Sport i nauki o sporcie

Transkrypt

1 Sport i nauki o sporcie u progu nowego wieku Wynik analizy antydopingowej musi byæ niepodwa alnym dowodem stosowania lub nie dopingu przez sportowca. 5 Postêpy diagnostyki antydopingowej Precyzyjne wykrywanie oraz identyfikacja niedozwolonych œrodków dopinguj¹cych w organizmie sportowców, uczestnicz¹cych w zawodach (a tak e wyrywkowo, w trakcie kontroli poza zawodami), jest zasadniczym elementem wspó³czesnego systemu przeciwdzia- ³ania dopingowi w sporcie. Wynika to z przyjêtej obecne definicji dopingu, wed³ug której podstawowym kryterium diagnostycznym i dowodowym stosowania niedozwolonych œrodków jest stwierdzenie w moczu sportowca okreœlonego zwi¹zku lub jego metabolitu, b¹dÿ te przekroczenie dopuszczalnego progu (limitu) jego stê enia. Obecnie w laboratoriach antydopingowych, poza analizami moczu, przeprowadzane s¹ równie badania próbek krwi i innych materia³ów badawczych (np. w³osów). St¹d te wynikaj¹ wysokie wymagania stawiane badaniom, prowadzonym w laboratoriach antydopingowych, oraz d¹ enie do sta³ego udoskonalania metod wykrywania oraz identyfikacji zakazanych zwi¹zków. Wysi³ki zmierzaj¹ce w tym kierunku przynios³y, w ci¹gu ostatnich lat, szereg nowych rozwi¹zañ w dziedzinie techniki instrumentalnej i analitycznej. Dziêki temu znacznie rozszerzy³y siê mo liwoœci badañ analitycznych, a uzyskane wyniki sta³y siê wiarygodne. Warto przeto, choæby pobie nie, zapoznaæ siê Sport Wyczynowy 2002, nr 1-2/

2 6 z aparatur¹ badawcz¹ nowej generacji, stanowi¹c¹ zasadnicze wyposa enie czo- ³owych laboratoriów antydopingowych. Spoœród nowych rozwi¹zañ i innowacji technicznych pragnê ukazaæ trzy rodzaje aparatów, których zastosowanie okaza³o siê wyj¹tkowo korzystne. Jednym z trudniejszych problemów, które nale a³o rozwi¹zaæ w toku badañ antydopingowych by³o rozró nienie endogennych androgenów, takich jak testosteron, dihydrotestosteron (DHT) i dehydroepianarosteron (DHEA), od ich syntetycznych pochodnych, stosowanych w celach dopingowych. Na podstawie wyników rutynowych analiz antydopingowych nie mo na by³o rozstrzygn¹æ, czy zwi¹zki, ujawnione w moczu badanego sportowca, by³y pochodzenia egzogennego, czy te zosta³y wytworzone w sposób naturalny w jego organizmie. Odró nienie androgenów egzogennych (syntetycznych) od wytwarzanych endogennie sta³o siê mo liwe dziêki wprowadzeniu nowej generacji aparatów (1, 2, 11, 13, 14). GC/C/IRMS nowa metoda bezpoœredniego wykrywania syntetycznego testosteronu i endogennych androgenów Udowodnienie przyjmowania preparatów testosteronu, w celu zwiêkszenia osi¹gniêæ, sta³o siê zasadniczym problemem z chwil¹ zaliczenia testosteronu przez Komisjê Medyczn¹ MKOl do œrodków dopingowych (1982 rok, po Igrzyskach Olimpijskich w Moskwie) (5). Przyjêcie w 1983 roku przez Manfreda Dönikego (profesora w Deutschen Sporthochschule w Kolonii), podwy - szonej wartoœci wskaÿnika T/Et w analizach GC/MS za kryterium przyjmowania testosteronu w celach dopingowych by³o pierwszym krokiem w kierunku rozwi¹zania tego problemu (9). Chocia badania populacji sportowców ujawni³y, e œrednie wartoœci tego wskaÿnika wynosz¹ 1,0±0,9, to jednak, aby unikn¹æ fa³szywie dodatnich wyników testu, Komisja Medyczna MKOl przyjê³a za dopuszczaln¹ wartoœæ T/Et = 6, a zatem wszystkie wyniki poni ej tej wartoœci uznawane s¹ za negatywne. PóŸniejsze badania wykaza³y, e przyjêcie powy - szych za³o eñ nie eliminuje trudnoœci interpretacyjnych (6, 7). Okaza³o siê np., e podanie 250 mg testosteronu oœmiu chiñskim sportowcom spowodowa³o podwy szenie wskaÿnika T/Et tylko u trzech z nich, utrzymywuj¹ce siê przez 1 dzieñ (18). Reagowali oni wiêc odmiennie ni sportowcy rasy bia³ej (kaukaskiej). Na tej podstawie wnioskowano, e u sportowców pochodzenia azjatyckiego mog¹ wystêpowaæ wyniki fa³szywie ujemne. Skutecznym sposobem obni ania T/Et poni ej dopuszczalnej wartoœci okaza³o siê jednoczesne przyjmowanie epitestosteronu z preparatami testosteronu (6). Tak wiêc istnia³a równie mo liwoœæ fa³szowania wyników tego badania. Z drugiej strony, wartoœci wskaÿnika T/Et powy ej 6, maj¹ce wskazywaæ na przyjmowanie egzogennego testosteronu, mog¹ byæ efektem naturalnego zmniejszenia wydalania epitestosteronu. Z tego wzglêdu Komisja Medyczna MKOl dopuszczaln¹ graniczn¹ wartoœæ tego wskaÿnika podnios³a do 10, zaœ wyniki pomiêdzy 6 a 10 podlega³y we- 6

3 Postêpy diagnostyki antydopingowej ryfikacji poprzez dalsze badania (endokrynologiczne). Okaza³o siê ponadto, e na wzrost T/Et mog¹ wp³ywaæ równie takie czynniki, jak: spo ycie alkoholu (zw³aszcza u kobiet), nieodpowiednie przechowywanie próbek i rozwój pewnych szczepów flory bakteryjnej w moczu (4), a wiêc czynniki zupe³nie nie zwi¹zane z przyjmowaniem syntetycznych preparatów testosteronu. Wszystko to sprawi³o, e udowodnienie przyjmowania testosteronu w celach dopingowych, nawet przy wysokich wartoœciach wskaÿnika T/Et, sta³o siê problematyczne (odszkodowawcze procesy cywilne z regu³y koñczy³y siê wygran¹ sportowców, oskar onych o doping). A eby prze³amaæ ten impas, nasili³y siê poszukiwania metod bardziej skutecznych. Takim rozwi¹zaniem okaza³a siê nowa metoda, wykorzystuj¹ca urz¹dzenie, nazywane w skrócie GC/C/IRMS. Sk³ada siê ono z chromatografu gazowego (gas chromatography GC) sprzê onego z komor¹ spalania (combustion C) oraz spektrometrem masowym (mass spectrometry MS) i umo liwia bezpoœrednie wykrywanie syntetycznych androgennych hormonów w analizowanych próbkach moczu sportowców. Badanie oparte jest na tym, e syntetyczny testosteron zawiera mniejsz¹ iloœæ izotopu wêgla 13 C ni hormon naturalny, powstaj¹cy w organizmie. Okreœlenie stosunku izotopów wêgla 13 C/ 12 C, pochodz¹cego z testosteronu wyizolowanego z badanej próbki moczu, pozwala ustaliæ, czy jest to hormon naturalny, czy te syntetyczny (1, 11, 18). W komorze spalania w wysokiej temperaturze (+850 C) dochodzi do spalenia wyizolowanego zwi¹zku (np. testosteronu) do podstawowych sk³adników H 2 O i CO 2. Wêgiel powsta³y z CO 2 jest nastêpnie analizowany w spektrometrze masowym, wyposa onym w detektor izotopowy, który pozwala na oznaczenie stosunku izotopów wêgla 13 C/ 12 C (Isotope Ratio Mass Spectrometry IRMS). 1 W pierwszym etapie analizy w chromatografie gazowym nastêpuje rozdzia³ badanego materia³u i wyizolowanie, w okreœlonym czasie retencji, piku testosteronu lub innych interesuj¹cych nas zwi¹zków endogennych androgenów, (które nastêpnie podlegaj¹ spaleniu w komorze spalania do H 2 O i CO 2 ). W detektorze IRMS okreœla siê stosunek 13 C/ 12 C w promilach, oznaczany symbolem [ä 13 C ( )] wobec wzorcowego gazu o standaryzowanym stosunku 13 C/ 12 C. Analiza ta wymaga dok³adnego oczyszczenia izolowanego piku testosteronu, którego stê enie powinno wynosiæ oko³o 50 ng. Procedura badawcza wymaga wiêc wstêpnego zagêszczenia próbki moczu i izolowania testosteronu na kolumnach chromatografu cieczowego wysokociœnieniowego (HPLC). Jak ustalono w drodze badañ eksperymentalnych, podanie 1 tabletki 40 mg preparatu testosteronu (Andriol) powodowa³o wzrost T/Et powy ej 6, który 1 Warto pamiêtaæ, e izotopy to zwi¹zki o tej samej liczbie protonów, ale ró nej neutronów. W przyrodzie wystêpuj¹ trzy naturalne izotopy wêgla: 12 C (szeœæ protonów i szeœæ neutronów) z czêstoœci¹ wystêpowania oko³o 98,9%, 13 C (szeœæ protonów i siedem neutronów) w stê eniu 1,1% oraz 14 C (szeœæ protonów i osiem neutronów), czas pó³trwania wynosi 5760 lat i jest u ywany do obliczenia wieku znalezisk archeologicznych (18). 7 7

4 8 utrzymywa³ siê do 2 godzin, zaœ wynik 13 C/ 12 C, wskazuj¹cy na przyjêcie egzogennego testosteronu, utrzymywa³ siê do 10 godzin (mimo powrotu wskaÿnika T/Et do wartoœci prawid³owej) (18). Badanie t¹ metod¹ pozwala na wykrycie stosowania egzogennego testosteronu nawet u osób z wrodzonym niskim poziomem wskaÿnika T/Et (np. u Azjatów) (18). Natomiast podwy szenie wskaÿnika T/Et do wartoœci 14,7 nie zawsze znajdowa³o potwierdzenie w analizach GC/C/IRMS, które dawa³y wynik ca³kowicie negatywny (18). Oznaczanie wskaÿnika T/Et nale y wiêc uznaæ za badanie wstêpne (skryningowe). W przypadku przekroczenia wartoœci 6,0 Komisja Antydopingowa mo e rozszerzyæ badanie próbki B o wykonanie dodatkowego testu, okreœlaj¹cego stosunek izotopów wêgla 13 C/ 12 C (IRMS). Wynik ten bêdzie podstaw¹ ostatecznej oceny badania antydopingowego. Badanie to zastêpuje uprzednio wykonywany w tych przypadkach test ketokonazolowy. Pozwala tak e rozstrzygn¹æ, czy wysoki poziom epitestosteronu, stosowanego w celu maskowania przyjmowania testosteronu i utrzymuj¹cy wartoœæ wskaÿnika T/Et w granicach prawid³owych, jest pochodzenia egzogennego, czy te jest naturalnie wytwarzany w organizmie sportowca. Wysoka cena aparatu GC/C/IRMS (oko³o dolarów amerykañskich) oraz pracoch³onna procedura przygotowania próbki i przeprowadzenia analizy nie pozwalaj¹ na zastosowanie tej metody do rutynowych analiz. Wyniki oznaczeñ, uzyskiwane przy u yciu tej metody, stanowi¹ wa ny dowód w procesach s¹dowych, w toku których dochodzi do czêstego podwa ania materia³u dowodowego. W obowi¹zuj¹cym w latach wykazie zakazanych farmakologicznych klas œrodków i metod dopingu, podanym w Aktualnym Dodatku A Kodu Antydopingowego MKOl z 1 wrzeœnia 2001 roku (3), zmieszczono nastêpuj¹c¹ uwagê: W celu podjêcia ostatecznych decyzji, w przypadkach podejrzenia stosowania testosteronu, lub innych endogennych androgenów, nale y braæ pod uwagê zarówno wyniki zaburzeñ profilu steroidowego w moczu, jak i pomiar stosunku izotopów. Chromatograf gazowy sprzê ony z detektorem wysokiej rozdzielczoœci GC/HRMS W analizach antydopingowych bardzo istotnym elementem diagnostycznym, decyduj¹cym o mo liwoœciach wykrywania zakazanych œrodków w badanych próbkach moczu sportowców, jest wysoka czu³oœæ analityczna instrumentów badawczych, czyli zdolnoœæ do wykrycia najmniejszej iloœci danego zwi¹zku. Dotyczy to zw³aszcza wykrywania metabolitów steroidów anaboliczno-androgennych. Przerwa w przyjmowaniu tych œrodków na d³ugo przed spodziewan¹ kontrol¹ antydopingow¹, przeprowadzan¹ np. w czasie zawodów lub podczas zgrupowañ treningowych, sprawia, e stê enia tych metabolitów mog¹ byæ bardzo niewielkie, a ich wykrycie zwyk³ymi metodami wrêcz niemo liwe. 8

5 Postêpy diagnostyki antydopingowej Wprowadzenie do analiz antydopingowych aparatu o nazwie GC/HRMS (chromatograf gazowy sprzê ony z detektorem mas o wysokiej rozdzielczoœci) pozwoli³o na wykrywanie œladowych iloœci metabolitów steroidów anabolicznych, nawet po d³u szej ni miesi¹c przerwie w przyjmowaniu tych preparatów. Dotyczy to zw³aszcza zwi¹zków anabolicznych, takich jak metandienon, stanozolol, metylotestosteron i clenbuterol, których metabolity d³ugo utrzymuj¹ siê w organizmie. Od czasu wprowadzenia Spektrometrii Mas Wysokiej Rozdzielczoœci GC/HRMS do laboratorium antydopingowego w Kolonii w 1995 roku na 116 pozytywnych próbek a 75 zidentyfikowano za pomoc¹ tego aparatu (18). Spoœród 28 próbek, w których stwierdzano obecnoœæ metabolitów metandienonu, tylko w 7 przypadkach wykryto go tradycyjn¹ metod¹ GC/MS, zaœ pozosta³e potwierdzono wy- ³¹cznie metod¹ HRMS. W badaniach, przeprowadzonych przez Federacjê Podnoszenia Ciê arów przed Igrzyskami Olimpijskimi w Atlancie w 1996 r. w ponad 40 próbkach, stwierdzono, równie za pomoc¹ tej metody, obecnoœæ metabolitów steroidów anabolicznych (18). Wysoka czu³oœæ i specyficznoœæ analiz przy bardzo dobrej powtarzalnoœci sprawi- ³y, e aparat HRMS sta³ siê urz¹dzeniem niezbêdnym do potwierdzania obecnoœci (zw³aszcza œladowych iloœci) metabolitów steroidów anabolicznych we wszystkich podejrzanych próbkach. Bardzo wysoka cena tego aparatu (oko³o dolarów) spowodowa³a poszukiwanie alternatywnych rozwi¹zañ technicznych. W wyniku tych poszukiwañ zosta³ skonstruowany chromatograf gazowy, sprzê ony ze spektrometrem MS/MS n, pozwalaj¹cy na wielokrotn¹ analizê g³ównych jonów widma poszczególnego metabolitu i znacznie zwiêkszaj¹cy mo liwoœci ich wykrywania. Pozwala on na potwierdzenie obecnoœci œladowych iloœci metabolitów steroidów anabolicznych, wykrytych w tradycyjnym aparacie GC/MS. Zak³ad Badañ Antydopingowych w Instytucie Sportu w Warszawie posiada tego typu aparat o nazwie GCQ Plus, firmy ThermoQuest-Finigan, który spe³nia wymogi, stawiane wyposa eniu laboratoriów antydopingowych, ubiegaj¹cych siê o akredytacjê MKOl. Aparat ten, poza zwyk³¹ analiz¹ GC/MS, pozwala równie na rozbicie wyizolowanego jonu, tzw. jonu prekursora danego zwi¹zku, na jony potomne, czyli tzw. córki, które s¹ charakterystyczne dla tego zwi¹zku. Pozwala równie na wykrywanie œladowych stê eñ metabolitów steroidów anabolicznych rzêdu 1 ng lub poni ej w 1 ml moczu (15). Wykrywanie metabolitów 5 œrodków anabolicznych o stê eniach 0,2 ng/ml sta³o siê niezbêdnym warunkiem uzyskania akredytacji MKOl przez laboratoria antydopingowe. S¹ to: clenbuterol oraz metabolity: nandrolonu, metylotestosteronu, metandienonu i stanazololu. Obni enie progu detekcji metabolitów nandrolonu wykaza³o, e mog¹ one w nieznacznej iloœci wystêpowaæ w moczu sportowców w warunkach fizjologicznych, zw³aszcza po wysi³kach (12). Przepisy Antydopingowe (3) wprowadzi³y progi (limity) dopuszczalnych stê- eñ nor-androsteronu, które dla kobiet wynosz¹ 5 ng/ml, zaœ dla mê czyzn 2 ng/ml moczu. 9 9

6 10 Warto wspomnieæ, e w badaniach antydopingowych, przeprowadzonych w Zak³adzie Badañ Antydopingowych Instytutu Sportu w 2001 r., stwierdzono, e w 15 próbkach stê enie nor-androsteronu wynosi³o powy ej 2 ng/ml i waha³o siê od 2,5 do 350 ng/ml, natomiast w innych 19 stê enie tego metabolitu by³o poni ej dopuszczalnej granicy, czyli 2 ng/ml. Tylko 2 próbki moczu zosta³y pobrane poza zawodami. Wyniki te potwierdzaj¹ uprzednie obserwacje, e wysi³ek fizyczny mo e mieæ wp³yw na wydalan¹ w moczu iloœæ tego metabolitu (12). Chromatograf cieczowy sprzê ony z detektorem masowym lub MS n (LC/MS lub LC/MS n ). Trzeci¹ nowoœci¹, jaka pojawi³a siê niedawno w laboratoriach antydopingowych, jest chromatograf cieczowy, sprzê- ony z detektorem masowym lub MS n (LC/MS lub LC/MS n ). Jak zaznaczyliœmy wczeœniej, wysoka powtarzalnoœæ i dok³adnoœæ analiz stanowi¹ o jakoœci badañ antydopingowych. Po³¹czenie spektrometrii masowej z odpowiedni¹ procedur¹ chromatograficzn¹ jest metod¹ z wyboru, charakteryzuj¹c¹ siê wysok¹ czu³oœci¹, powtarzalnoœci¹ i specyficznoœci¹ oraz mo liwoœci¹ oceny iloœciowej badanych zwi¹zków. O ile chromatograf gazowy sprzê- ony z spektrometrem mas (GC/MS) jest tzw. z³otym standardem w analizach lotnych substancji, to do pomiarów nielotnych zwi¹zków wymagana jest analiza w chromatografie cieczowym (HPLC) (5). To nowe rozwi¹zanie techniczne jest po³¹czeniem przez system API (Atmospheric Pressure Ionization) lub ElectroSpray starej, wypróbowanej metody chromatografii cieczowej wysokociœnieniowej (HPLC) z nowoczesnym detektorem MS (z mo liwoœci¹ wielokrotnej analizy MS n ). Pozwoli³o to ogromnie zwiêkszyæ zakres detekcji zwi¹zków o ciê arach masy molekularnej powy ej 1000, a nawet do (GC/MS mo e wykrywaæ tylko do 1000) (5). Szereg analitycznych parametrów wykrywania zakazanych zwi¹zków (czu³oœæ, powtarzalnoœæ, oznaczanie iloœciowe oraz ³atwoœæ obs³ugi aparatu) sprawia, e urz¹dzenie to nale y do zasadniczego wyposa enia nowoczesnych laboratoriów antydopingowych. Analiza próbek krwi aparatem LC/MS pozwala na wykrycie estrów testosteronu, a tym samym udowodnienie stosowania dopingu. Analiza LC/MS/MS okaza³a siê tak e bardzo dobr¹ metod¹ oznaczania ß-blokerów w moczu. Zgodnie z obecnymi przepisami antydopingowymi (3) dopuszczalne stê- enia salbutamolu (dozwolonego jedynie w inhalacjach) wynosz¹: 100 ng/ml w próbkach moczu, pobranych od sportowców w czasie zawodów i 1000 ng/ml w kontroli poza zawodami. Iloœciowe oznaczenia salbutamolu w moczu sportowców, wykonane w LC/MS, daj¹ znacznie lepsz¹ powtarzalnoœæ i prostolinijnoœæ pomiarów. Postêp techniczny, jaki dokona³ siê w analityce chemicznej w ci¹gu ostatnich dziesiêciu lat, sprawi³, e wykrywanie oraz identyfikacja substancji chemicznych i farmakologicznych uznanych za dopin- 10

7 Postêpy diagnostyki antydopingowej gowe, przesta³o praktycznie byæ problemem. Przed laboratoriami antydopingowymi staje obecnie nowe wyzwanie wykrywanie dopingu hormonami peptydowymi, wœród nich przede wszystkim erytropoetyny (EPO) 2 i hormonu wzrostu (hgh). Hormony peptydowe, takie jak rekombinowana egzogenna erytropoetyna (rhuepo) i rekombinowany hormon wzrostu (rhgh), znalaz³y siê na liœcie œrodków zakazanych przez MKOl ju w 1989 roku (klasa E), ale dot¹d nie by³o testów, które pozwala³y na udowodnienie stosowania ich w celach dopingu przez sportowców. Powodem brak wiarygodnych metod wykrywania oraz identyfikacji syntetycznych hormonów rhuepo i rhgh. Ostatnio pojawi³y siê doniesienia o nowej formie EPO (wykazuje znacznie d³u sze i silniejsze dzia³anie) o nazwie Novel Erythropoiesis Stimulating Protein (NESP). Synteza nowej formy erytropoetyny o nazwie fabrycznej Darbepoetin alfa, pobudza erytropoezê w szpiku w identyczny sposób, jak naturalnie wytwarzane EPO lub rhuepo. Modyfikacja cz¹steczki EPO, przez dodanie dwóch ³añcuchów sialowych, 2 Erytropoetyna jest hormonem glikoproteinowej (sk³adaj¹cym siê ze 165 aminokwasów i komponenty wêglowodanowej), wytwarzanym przez nerki, który reguluje prawid³owy poziom masy krwinek czerwonych w organizmie. Rekombinowany ludzki hormon EPO (rhuepo) syntetyczna erytropoetyna okaza³a siê lekiem bardzo skutecznym i dobrze tolerowanym, nieodzownym w terapii niedokrwistoœci dializowanych chorych z przewlek³¹ niewydolnoœci¹ nerek, w ciê kiej niedokrwistoœci w przebiegu chemioterapii nowotworów, jak te w leczeniu AIDS. Terapia rhuepo wymaga jednak czêstych, do trzech razy w tygodniu, wstrzykniêæ tego preparatu. 11 (z jednoczesn¹ zamian¹ 5 aminokwasów na cz¹steczki wêglowodanów) powoduje 3,5-krotne wyd³u enie czasu jej pó³trwania w organizmie. Pozwala to na ograniczenie podawania tego hormonu w leczeniu pacjentów z niedokrwistoœci¹ (10). Stosowanie rhuepo lub nowej formy tego hormonu NESP sta³o siê atrakcyjnym i skutecznym sposobem zwiêkszenia zdolnoœci organizmu sportowców do jeszcze wy szych osi¹gniêæ (wzrost transportu tlenu do miêœni), zw³aszcza w dyscyplinach wytrzyma³oœciowych. Metody wykrywania rekombinowanej egzogennej formy rhuepo, zaproponowane w programie EPO Sydney 2000, bêd¹ stosowane podczas kontroli antydopingowej w czasie najbli szych Zimowych Igrzysk Olimpijskich w Salt Lake City. Badania te opieraj¹ siê na dwóch rodzajach testów: 1)bezpoœrednich, ró nicuj¹cych struktury obu hormonów w próbkach moczu na podstawie ich niejednorodnoœci (16); 2)poœrednich, czyli oznaczaniu tzw. markerów osocza krwi, których zmiany s¹ efektem dzia³ania hormonu (8). Metody bezpoœrednie polegaj¹ na analizie zachowañ obu postaci hormonów w rozdziale elektroforetycznym; w polu elektrycznym poruszaj¹ siê one z ró n¹ szybkoœci¹. Porównanie uk³adu (oko³o 10 pasm-widm) izoform naturalnego hormonu EPO (bardziej kwaœne) z izoformami rhuepo (bardziej zasadowe) pozwala na odró nienie rekombinowanej rhuepo od naturalnej EPO. Uzyskane wyniki badañ próbek moczu lub surowicy porównu- 11

8 12 je siê z równoczeœnie przeprowadzonymi analizami uk³adu izoform: czystej naturalnej erytropoetyny, preparatów rekombinowanej rhuepo oraz próbek kontrolnych. Przydatnoœæ tej metody jako kryterium dowodowego stosowania dopingu erytropoetyn¹ mog¹ potwierdzaj¹ retrospektywne badania uczestników kolarskiego Wyœcigu Dooko³a Francji w 1998 roku. U 14 spoœród 102 zawodników stwierdzono podwy szenie poziomu EPO we krwi. W analizach elektroforetycznych 14 próbek moczu, pobranych od tych samych zawodników, stwierdzono uk³ad izoform typowy dla rekombinowanej rhuepo (16). PóŸniejsze badania potwierdzi³y u ytecznoœæ tej metody w ró nicowaniu syntetycznej i naturalnej erytropoetyny w moczu. Krótki czas pó³trwania erytropoetyny powoduje, e ju po godzinach nie stwierdza siê œladu rhuepo w moczu. Dlatego te przeprowadza siê oznaczanie tzw. markerów osocza krwi, które wskazuj¹ d³u sze utrzymywanie siê efektów dzia³ania przyjêtego hormonu. Do markerów tych zalicza siê oznaczenia przeprowadzane we krwi, jak: poziom hematokrytu, retikulocytów, % makrocytów (du ych erytrocytów) oraz w surowicy: poziomy rozpuszczalnego receptora transferyny (stfr), ferrytyny oraz erytropoetyny. Uwa a siê, e ta grupa markerów odznacza siê swoistoœci¹ i specyficznoœci¹ diagnostyczn¹, pozwalaj¹c¹ wyró niæ osoby przyjmuj¹ce rhuepo. Ponadto opracowano specjalne modele diagnostyczne wyników tych oznaczeñ, potwierdzaj¹cych stosowanie rhuepo (ON-MODEL) i zestaw wyników, wykluczaj¹cych przyjmowanie tego hormonu (OFF-MODEL). W ramach programu wspó³pracy MKOl i rz¹du australijskiego dokonano analizy wiarygodnoœci (walidacji) testów poœrednich oraz okreœlenia prawid³owych wartoœci tych markerów w grupie osób, uprawiaj¹cych sporty rekreacyjne, pochodz¹cych z ró nych krajów europejskich, azjatyckich oraz z Australii. Analizowano wp³yw p³ci, wieku oraz zmiennoœæ osobnicz¹ i wynikaj¹c¹ z stosowania ró nych metod oznaczeñ. Wyniki analiz próbek krwi i moczu wielokrotnie pobieranych w 1100-osobowej grupie ochotników, pochodz¹cych z 12 krajów, pozwoli³y na ocenê wiarygodnoœci tych testów. Badania potwierdzi³y, e stosowanie rhuepo powoduje okreœlone i powtarzalne zmiany hematologiczne jednakowe u sportowców, pochodz¹cych z ró nych kontynentów. Badania oznaczania poziomów tych markerów s¹ stosunkowo proste i wykonuje siê je metodami enzymo-immunologicznymi w aparatach hematologicznych (m. in. ADIVA 120 Hematological Analyser firmy BAYER). Zwraca siê jednak uwagê, e stosowanie preparatu rhuepo wraz z do ylnymi wstrzykniêciami elaza, praktykowane przez niektórych sportowców, mo e modyfikowaæ uzyskiwane wyniki. Obni a to poziom rozpuszczalnych receptorów transferyny, jednego z wa nych testów potwierdzaj¹cych stosowanie rhuepo. Dlatego zaleca siê, a eby u zawodników z wysokimi poziomami ferrytyny przeprowadzaæ testy dwukrotnie (przed i po sezonie zawodów) w celu wykluczenia mo liwoœci wahañ indywidualnych (wewn¹trzosobnicznych). 12

9 Postêpy diagnostyki antydopingowej Inn¹ metod¹ maskowania efektów stosowania preparatów rhuepo jest zwiêkszenie objêtoœci osocza krwi z jednoczesnym rozrzedzeniem jej sk³adników, co powoduje obni enie poziomów m. in. hemoglobiny, hematokrytu i innych markerów. Najczêœciej stosowane s¹ wstrzykniêcia do ylne preparatu skrobi hydroksyetanolowej (hydroxyethyl starch HES). Podczas Mistrzostw Œwiata (Lahti, luty 2001 r.) stwierdzono, e niektórzy norwescy narciarze stosowali ten preparat. Metoda GC/MS pozwala na jednoznaczne stwierdzenie obecnoœci metabolitów HES w moczu, a tym samym udowodnienie stosowania dopingu (17). Warto przy tym zaznaczyæ, e preparat HES mo e byæ przyczyn¹ ostrej niewydolnoœci nerek. Od stycznia 2000 roku stosowanie substancji, zwiêkszaj¹cych objêtoœæ osocza, zosta³o zakazane wesz³y na listê metod dopingu (3). Wykorzystywanie substytutów krwi, jak te sztucznych przenoœników tlenu, m.in. roztworów modyfikowanej hemoglobiny (krwi bydlêcej, pozbawionej sk³adników komórkowych HBOC- 201) lub emulsji tetrafluorowêgla (perfluorocarbon-pfc) jest równie zakazane (3), a ich wykrycie jest stosunkowo proste. Wspó³czesne metody wykrywania dopingu hormonem wzrostu (hgh) Podobne jak w przypadku EPO w procedurach, wykrywaj¹cych stosowanie preparatów hormonu wzrostu, wyró nia siê dwie metody (19): 13 1)bezpoœredni¹ immunologiczn¹, pozwalaj¹c¹ na odró nienie izomerów pochodzenia przysadkowego, naturalnie wytwarzanego hgh, od monomeru rekombinowanego egzogennego hormonu wzrostu rhgh; 2)poœrednie oznaczaj¹ce poziom markerów surowicy krwi, które œwiadcz¹ o d³u ej utrzymuj¹cych siê efektach dzia³ania tego hormonu (8,19). Obie metody wymagaj¹ pobierania próbek krwi. W przypadku pierwszej metody tzw. okno wykrycia wynosi 24 godziny od wstrzykniêcia preparatu rhgh, a ponadto wysi³ek fizyczny ma wp³yw na wynik badania, dlatego powinno byæ ono przeprowadzane rano przed treningiem i zawodami (19). Podwy szone wyniki markerów dzia- ³ania rhgh utrzymuj¹ siê przez okres oko³o 2 tygodni i s¹ wy sze u mê czyzn ni u kobiet. Na wyniki tych testów nie ma wp³ywu nawet bardzo intensywny wysi³ek fizyczny. Dlatego mog¹ byæ przeprowadzane u zawodnika zaraz po zakoñczeniu zawodów sportowych (19). Podstaw¹ interpretacji wyników testu bezpoœredniego jest stwierdzenie, e przysadkowy hormon wzrostu w surowicy zawiera ró ne molekularne izofomy: 22-kDa-GH i 20 kda-gh. Izomer 20 kda, normalnie znajduj¹cy siê w surowicy, stanowi 10% izomeru 22 kda-gh. Brak izomeru 20 kda-gh, a obecnoœæ wy³¹cznie 22 kda-gh, œwiadczy o podaniu rhgh. Badanie nie pozwala na wykrycie, czy podane zosta³y preparaty naturalnego przysadkowego hormonu lub hormonu uwalniaj¹cego hormon wzrostu (GHRH) (19). 13

10 14 Podstaw¹ badañ poœrednich dopingu z u yciem rhgh s¹ zmiany okreœlonych parametrów regulowanych przez naturalny hormon. Wykrycie stosowania rhgh jest mo liwe, gdy stwierdza siê wzrost poziomu (powy ej normy) GH-zale - nych markerów. Do markerów hgh nale ¹ 4 markery pochodzenia w¹trobowego: IGF-1 (insulinopodobny czynnik wzrostu); bia³ko 2-wi¹ ¹ce IFG-1 (IGF-2BG); bia³ko 3-wi¹ ¹ce IGF1 (IGF-3BG); ALS (acid labile sub-unit) oraz 4 markery pochodzenia kostnego: osteokalcina, prokolagen typ III (P-III-P), telepeptyd kolagenu I i propeptyd c-koñcowego kolagenu typ I (8,19). Dok³adne badania, przeprowadzone na 100 ochotnikach przed, w czasie i w 3 miesi¹ce od zaprzestania podawania rhgh, wykaza³y, e dla odró nienia grup, otrzymuj¹cych rhgh i placebo, wystarczy oznaczenie dwóch markerów IGF-1 i prokolagenu typ III (P-III-P). Badania wykaza³y te bardzo dobr¹ stabilnoœæ i powtarzalnoœæ oznaczeñ ww. markerów podczas ich przechowywania (19). Czu³oœæ diagnostyczn¹ powy szych testów, œwiadcz¹cych o stosowaniu dopingu z u yciem rhgh, ocenia siê na ponad 90%, z prawdopodobieñstwem mniejszym ni 1:10 000, e tego dopingu nie stosowano. Nale y podkreœliæ, e analiza dyskryminacyjna wyników przeprowadzonych testów wypada znacznie gorzej u kobiet ni u mê czyzn czu³oœæ diagnostyczna tych testów jest u nich znacznie ni sza (19). Reasumuj¹c, nale y podkreœliæ, e postêp techniczny, instrumentalny i analityczny, poparty osi¹gniêciami nauk podstawowych (farmakologii, fizjologii i patologii) i klinicznych, pozwala na coraz szybsze, dok³adniejsze i niezawodne wykrywanie oraz identyfikacjê œrodków i metod dopingu w sporcie. Coraz mniej pozostaje bia³ych plam, czyli tzw. niewykrywalnych œrodków w programach antydopingowych, z powodu braku w³aœciwych metod, za pomoc¹ których mo na jednoznacznie dowieœæ stosowania dopingu. Piœmiennictwo 1. Aguilera R. et al.: Improved Method of Detection of Testosterone Abuse by Gas Chromatography/Combustion/ Isotope Ratio Mass Spectrometry Analysis of Urine Steroids. Journal of Mass Spectrometry 1996, 31: Aguilera R. et al.: Screening urine for exogenous testosterone by isotope ratio mass spectrometric analysis of one pregnanediol and two androstnediols. Journal of Chromatography B, 1999, 727, Appendix A.: Prohibited Classes of Substances and Prohibited Methods Olympic Movement Antidoping Code. IOC. 1 September Ayotte C. et al.: Validity of Urinary Samples: Microbial Degradation. [in:)] Recent Advances in doping Analysis (4). Proceedings of the Manfred Dönike Workshop 16th Cologne Workshop on Dope Analysis 17th-22nd March 1996: Bogusz M., J.: Liquid Chromatography-mass spectrometry as a routine method in forensic sciences: a proof of maturity. Journal of Chromatography B, 2000,

11 Postêpy diagnostyki antydopingowej Chrostowski K.: Doping testosteronem wskaÿnik T/E i jego interpretacja. Sport Wyczynowy 1992, 11-12; Chrostowski K.: Doping testosteronem wskaÿnik T/Et (II). Test ketokonazolowy. Sport Wyczynowy 1994, 9-10: De Palo E. F. et al.: Carrelations of growth hormone (GH) and insulinlike growth factor 1 (IGF-1); effects of exercise and abuse by athletes. Clinica Chemica Acta 2001, 305: Dönike M. et al.: Nachweis von exogenem Testosteron. [in:] Sport: Leistung und Gesundheit. Edit.: H. Heck, W. Hollmann, H. Leisen, R. Rost. Köln Deutscher Ärzte Verlag, Egrie J. C., Browne J. K.: Development and Characterisation of Novel Erythropoiesis Stimulating Protein (NESP). Nephrology Dialysis Transplantation 2001, (suppl.3): Flenker U. et al.: Measurement of 13C/12C-Ratios to Confirm Misuse of Endogenous Steroids [in:] Recent Advances in doping Analysis (6). Proceedings of the Manfred Dönike Workshop 16th Cologne Workshop on Dope Analysis 15th-2nd March 1998: Geyer H. et al.: The Cologne protocol to follow up high testosterone/ epitestosterone ratios. [in:] Recent Advances in doping Analysis (4). Proceedings of the Manfred Dönike Workshop 16th Cologne Workshop on Dope Analysis 15th-2nd March 1996: Horning S. et al.: Detection of Exogenous Testosterone by 13C/12C Analysis. [in:] Proceedings of the Manfred Dönike Workshop 14th Cologne Workshop on Dope Analysis 17th-22nd March 1996: Horning S. et al.: Detection of ExogenousTestosterone by 13C/12C Analysis. [in:] Proceedings of the Manfred Dönike Workshop 15th Cologne Workshop on Dope Analysis 23nd-28th February 1997: Kwiatkowska D. i in.: Nandrolon metody wykrywania. Sport Wyczynowy 2001, 7-8: Lasle F., de Caurriz J.: Recombinant erythropoietin in urine. Nature 2000; 405, Thevis M., Opferman G., Schänzer W.: Detection of the plasma volume expander hydroxyethyl starch in human urine. Journal of Chromatography B 2000, 744: Schäncer W.: Abuse of androgens and detection of illegal use. [in:]. Testosteron. Action Deficiency Substitution. Edit. Nieschlag E., H. M. Behre. Springer 1998: Sonksen P. H.: Insulin, growth hormone and sport. Journal of Endocrinology 2001, 170: