Uzyskanie skutecznej metody regeneracji ubytków kości jest jednym z ważnych celów medycyny regeneracyjnej. Aktualnie stosowane metody klinicznego zaop

Transkrypt

1 Streszczenie Kwas mlekowy jest udokumentowanym czynnikiem wpływającym stymulująco na syntezę kolagenu zarówno przez komórki tkanki łącznej in vivo, jak i przez wybrane komórki hodowane w warunkach laboratoryjnych. Dotychczas udowodniono, że zwiększone stężenie kwasu mlekowego przyspiesza gojenie się ran poprzez kilkukrotne zwiększenie syntezy kolagenu i cytokin typowych dla bliznowacenia, takich jak naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF) i transformujący czynnik wzrostu (TGF). Powyższe efekty zostały potwierdzone w fibroblastach różnego pochodzenia hodowanych w warunkach laboratoryjnych. Autorzy tych obserwacji zaproponowali szlak metabolicznego działania kwasu mlekowego na komórki, który dotyczy formy lewoskrętnej kwasu. Według postulowanego mechanizmu nasilone utlenianie mleczanu przez dehydrogenazę mleczanową (LDH) skutkuje obniżeniem dostępności utlenionej formy dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NAD+). W efekcie NAD+ nie może być dalej wykorzystany w posttranslacyjnej modyfikacji białek katalizowanej m.in. przez polimerazę poli(adp-rybozy). Wywołuje to szereg skutków, a wśród nich aktywację ekspresji genów do syntezy kolagenu. Wpływ kwasu mlekowego na syntezę kolagenu przez komórki osteogenne nie był dotychczas badany, tymczasem kolagen jest podstawowym białkiem strukturalnym macierzy międzykomórkowej (ECM) tkanki kostnej. Ewentualne potwierdzenie stymulacji komórek osteogennych do produkcji zwiększonej ilości kolagenu w hodowli in vitro pod wpływem dodawanego do pożywki kwasu mlekowego stanowiłoby istotną wartość poznawczą. Uzyskana wiedza mogłaby przybliżyć nie tylko rozumienie fizjologii tkanki kostnej, ale także interakcji pomiędzy tkanką kostną a wszczepianymi do niej implantami z polimerów kwasu mlekowego. Potwierdzenie stymulującego wpływu kwasu mlekowego na syntezę kolagenu przez osteoblasty może mieć też wymiar praktyczny - w pracach nad przygotowywaniem substytutów tkanki kostnej w warunkach in vitro.

2 Uzyskanie skutecznej metody regeneracji ubytków kości jest jednym z ważnych celów medycyny regeneracyjnej. Aktualnie stosowane metody klinicznego zaopatrywania ubytków kości, do których należy wszczepianie fragmentu kości własnej pacjenta, wszczepianie tkanki pochodzącej od zmarłego dawcy lub stosowanie implantów złożonych z materiałów medycznych, są obarczone wieloma ograniczeniami. Z tego powodu trwają badania nad wytwarzaniem przeszczepów zawierających komórki wprowadzane do ustroju na podłożu, stanowiącym wypełnienie ubytku tkanki. Jest to przedmiotem młodej interdyscyplinarnej dziedziny naukowej, jaką jest inżynieria tkankowa. Produkt inżynierii tkankowej przeznaczony do regeneracji kości składa się typowo z co najmniej dwóch elementów komórek osteogennych oraz podłoża, czyli rusztowania złożonego z materiału naturalnego pochodzenia lub materiału wytworzonego przez człowieka. Niektóre z typowanych materiałów są resorbowalne, tzn. podlegają stopniowemu rozkładowi, a ich produkty degradacji są włączane w szlaki metaboliczne komórek. Wśród nich są poliestry alifatyczne, które, w procesie degradacji, stają się lokalnym źródłem kwasu mlekowego. Opisywano już przypadki skutecznej klinicznie regeneracji tkanki kostnej metodami inżynierii tkankowej u ludzi, dostępne są pojedyncze produkty tego typu na rynku medycznym. Jednakże, nadal istnieją wątpliwości, co do możliwości ich powszechnego wykorzystania. Pomimo satysfakcjonujących wyników badań produktów inżynierii tkankowej w modelach zwierzęcych, gdzie wykazywano długotrwałe przeżycie, proliferację i wytwarzanie przez komórki charakterystycznych białek ECM, jednoznaczna ocena wyników uzyskiwanych w klinice człowieka jest trudna. W przypadku zastosowania materiałów resorbowalnych, wynika to, między innymi, z ograniczonych możliwości kontrolowania tempa degradacji tych materiałów w przebiegu procesu gojenia i regeneracji tkanek po implantacji in vivo. Zjawisko to jest zależne od wielu czynników lokalnych, a ponadto podlega różnicom osobniczym. Niekontrolowana degradacja może prowadzić do niekorzystnych efektów uniemożliwiających regenerację tkanki m.in. do nekrozy wprowadzonych komórek, zapalenia wokół wszczepu, co ostatecznie prowadzi do utraty jego funkcjonalności.

3 W tym świetle interesująca byłaby strategia wytwarzania substytutów tkanki kostnej w taki sposób, aby zjawiska występujące w pierwszych etapach degradacji materiału i towarzysząca im aktywność komórek rozmieszczonych w degradującym rusztowaniu przebiegała pod kontrolą w warunkach in vitro, w okresie poprzedzającym implantację do tkanek biorcy. Wszczep w momencie zabiegu składałby się prawie wyłącznie z komórek i białek istoty międzykomórkowej wytworzonych przez komórki osteogenne w trakcie hodowli. Taka możliwość była już wzmiankowana w pracach poglądowych. Jednak jak dotąd, nie otrzymuje się tego typu wszczepów. W niniejszej pracy wysunięto propozycję uzyskania produktu inżynierii tkankowej kości w trakcie długotrwałej hodowli ludzkich komórek osteogennych na trójwymiarowym rusztowaniu resorbowalnym zbudowanym z polimeru kwasu mlekowego. Oryginalność zaproponowanego w pracy rozwiązania opiera się na hipotezie, że kwas mlekowy, który jest produktem degradacji wytypowanego materiału polimerowego, będzie stymulować produkcję kolagenu typu I przez komórki osteogenne w hodowli. Stymulacja wytwarzania kolagenu pod wpływem kwasu mlekowego dodawanego do hodowli została opisana dla fibroblastów, jednak, jak dotychczas, nie potwierdzono takiego efektu w hodowli osteoblastów. W pracy sformułowano dwa główne cele badawcze. Pierwszy to weryfikacja hipotezy o stymulującym wpływie kwasu mlekowego na produkcję kolagenu typu I w hodowli ludzkich osteoblastów. Drugi to sprawdzenie i udokumentowanie możliwości wykorzystania tego efektu do pozyskiwania nowych produktów inżynierii tkankowej kości. Dla osiągnięcia tych celów pracy konieczne było opracowanie metodologii i rozwiązanie zagadnień, które zawarto w postaci celów szczegółowych. Realizację pierwszego głównego celu rozprawy oparto na badaniu ludzkich prawidłowych komórek izolowanych z tkanki kostnej hodowanych w pożywkach zawierających kwas L-mlekowy. W doświadczeniach wstępnych wytypowano metody oznaczania kolagenu w hodowlach oraz wytypowano stężenie kwasu do dalszych badań. Następnie, w trakcie trzytygodniowych hodowli, przeprowadzono szczegółową analizę

4 wpływu kwasu mlekowego na ekspresję genu i syntezę kolagenu oraz obserwowano wytwarzanie dojrzałych włókien kolagenowych. Równolegle do tych badań przeprowadzono analizę przeżywalności i różnicowania komórek osteogennych. W wybranych oznaczeniach uwzględniono wpływ kwasu askorbinowego obecnego w badanych pożywkach na otrzymywane wyniki. Podjęto również próbę sprawdzenia specyficzności działania kwasu L-mlekowego na badane komórki. W tym celu analizowano wyniki uzyskane w hodowlach prowadzonych w obecności kwasu D-mlekowego w pożywce oraz przy odpowiednio obniżonym ph medium. Biorąc pod uwagę dużą zmienność osobniczą komórek prawidłowych, w ramach każdego doświadczenia we wszystkich grupach doświadczalnych stosowano komórki od jednego dawcy, a eksperymenty powtarzano z użyciem komórek od innych dawców. W sumie wykorzystano komórki izolowane od 18 dawców. Uzyskane w pracy wyniki jednoznacznie wskazują na stymulujący wpływ kwasu mlekowego na ludzkie komórki osteogenne w hodowli tym samym, zrealizowano główny cel poznawczy pracy. Dodanie kwasu L-mlekowego do pożywki przeznaczonej dla komórek osteogennych wywołało znaczący wzrost ekspresji genu kodującego kolagen i wzmożoną syntezę kolagenu. Uzyskano dojrzałe włókna kolagenowe w hodowlach poddanych działaniu kwasu mlekowego. Kwas askorbinowy dodany do pożywek wzmocnił stwierdzany wpływ kwasu mlekowego na syntezę kolagenu, a dodatkowo, częściowo, niwelował efekt cytotoksyczny kwasu mlekowego. Kontrolując stężenie osteokalcyny w hodowlach udokumentowano stymulujący wpływ kwasu mlekowego na terminalne różnicowanie osteoblastów. Dodatkowe analizy wskazują, że stwierdzane efekty nie są swoiste dla kwasu L-mlekowego. W pracy wykazano bowiem, że podobne zmiany w syntezie kolagenu zachodzą w warunkach obniżenia ph medium, które wywołuje dysocjacja kwasu. Natomiast cytotoksyczność kwasu L-mlekowego oraz jego pobudzający wpływ na terminalne zróżnicowanie komórek zależą od działania jonu mleczanowego. Te ostatnie dwa efekty zachodzą bowiem także wtedy, gdy w hodowli obecny jest kwas mlekowy w formie D. Uzyskane w pracy wyniki stymulacji syntezy kolagenu przez kwas mlekowy obecny w medium potwierdzają efekty opisywane przez innych badaczy

5 w odniesieniu do hodowli fibroblastów. Jednakże podjęte w pracy próby weryfikacji postulowanego dla fibroblastów mechanizmu działania kwasu mlekowego, nie wskazują na jego występowanie w hodowlach ludzkich komórek osteogennych. Na podstawie uzyskanych w pracy wyników nie stwierdzono bowiem wpływu kwasu mlekowego na syntezę ani ekspresję genu kodującego VEGF, nie uzyskano obniżenia stężenia polimerazy poli(adp-rybozy). Nie potwierdzono również, aby pośrednikiem stymulującego działania kwasu mlekowego na syntezę kolagenu był TGF-β1. Realizacja drugiego celu rozprawy, którym było sprawdzenie możliwości wykorzystania stymulującego działania kwasu mlekowego na ludzkie osteoblasty, opierała się na doświadczeniach, w których komórki hodowano w rusztowaniach złożonych z polimeru kwasu mlekowego. Przygotowano materiały w dwóch odmiennych formach - rusztowania sztywne o otwartej porowatości oraz rusztowania włókniste - oba degradujące z ostatecznym uwolnieniem do pożywki kwasu mlekowego. W pierwszej grupie zastosowano rusztowania w formie walców z polimeru kwasu L-mlekowego z kopolimerem kwasu mlekowego i glikolowego (50/50) (PLLA/PLGA), które przygotowano techniką wymycia porogenu, tak, aby uzyskać wysoką (76 %) porowatość rusztowań. W drugim przypadku wykorzystano rusztowania włókniste otrzymane z polilaktydu (PLA) za pomocą elektroprzędzenia. W efekcie kilkutygodniowej hodowli na podłożu obu typów rusztowań, uzyskano struktury składające się w znacznym stopniu z komórek i wytworzonej przez nie macierzy międzykomórkowej, przy zaawansowanej degradacji podłoża. Stwierdzono, że postępujący rozkład obu typów materiałów w warunkach in vitro nie miał negatywnego wpływu na przyrost populacji hodowanych komórek, ich fenotyp oraz na wytwarzanie przez komórki charakterystycznych dla kości białek ECM. W przypadku PLLA/PLGA, po ośmiu tygodniach w hodowli, nastąpiło odwrócenie ról pomiędzy biologicznymi i syntetycznymi składnikami konstrukcji. O ile w punkcie wyjściowym rusztowanie stanowiła konstrukcja wykonana z polimeru, o tyle w końcowym punkcie czasowym obserwowano rozdrobnione pozostałości polimeru rozmieszczone w osnowie macierzy międzykomórkowej.

6 Aby uzyskać powyższe wyniki, w doświadczeniach na rusztowaniach zastosowano szereg technik, które umożliwiły wydajną adhezję komórek do zastosowanych materiałów oraz długotrwałe przeżycie i utrzymanie ich osteogennego fenotypu. Zoptymalizowano technikę przygotowania materiałów do hodowli i wysiewania komórek. W trakcie doświadczeń prowadzono jednoczesną ocenę degradacji materiałów i wytwarzania przez komórki istoty międzykomórkowej. W przypadku próbek porowatych degradacja była widoczna makroskopowo w postaci stopniowego zanikania materiału i utraty jego struktury trójwymiarowej. Zaawansowanie degradacji polimeru potwierdzono badaniem chromatograficznym. W przypadku włóknistych próbek PLA przebieg degradacji oceniono na podstawie pomiaru ilości kwasu mlekowego uwalnianego do medium. Zaproponowano potencjalne wykorzystanie otrzymanych w pracy substytutów tkanki. Ze względu na słabe właściwości mechaniczne w porównaniu do tkanki kostnej, oba produkty mogłoby być zastosowane do wypełnień ubytków tkanki kostnej o niewielkich objętościach w okolicach nieprzenoszących wysokich obciążeń. Postać otrzymanych struktur pozwalałaby na szczelne wypełnienie ubytku, przy czym obie konstrukcje mogłyby być wprowadzone do tkanek w mało inwazyjny sposób do ubytków o trudnym dostępie chirurgicznym, np. poprzez iniekcję. Podsumowując, w niniejszej pracy, według najlepszej wiedzy autorki, po raz pierwszy potwierdzono stymulujący wpływ kwasu mlekowego na ludzkie osteoblasty w hodowli in vitro. Zaproponowano wykorzystanie tego efektu przy otrzymywaniu produktów inżynierii tkankowej w trakcie długotrwałych hodowli ludzkich komórek osteogennych na podłożach polimerowych, uwalniających kwas mlekowy w trakcie degradacji. Przedstawiona propozycja jest przedmiotem zgłoszenia zastrzeżenia patentowego do Urzędu Patentowego Rzeczypospolitej Polskiej oraz zgłoszenia międzynarodowego w trybie Patent Cooperation Treaty.

7 Stimulatory effect of lactic acid on osteoblasts cultured in vitro - possible application in tissue engineering Abstract Lactic acid is a known factor that stimulates collagen synthesis by connective tissue cells in vivo, as well as by selected cells cultured in vitro. It has been shown that lactic acid accumulated in wounds induces a synthesis of collagen and cytokines engaged in wound healing, such as the vascular endothelial growth factor (VEGF) and the transforming growth factor (TGF). These effects have been already confirmed in cell cultures of fibroblasts of various origin. According to available research data on metabolic pathway of L-lactic acid activity in the cells, an increased oxidation of L-lactate by lactic acid dehydrogenase (LDH) decreases the availability of the oxidized form of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+). This leads to the inhibition of the post-translational modification of proteins catabolized by poly(adp-ribose) polymerase and therefore causes several effects, including activation of the collagen genes expression. The influence of lactic acid on collagen synthesis by osteogenic cells has not yet been elucidated, although collagen is the crucial structural protein of the extracellular matrix (ECM) in bone tissue. Thus, a confirming that osteogenic cells produce increased amounts of collagen in vitro, as a response to lactic acid, would broaden our basic knowledge about the physiology of bone tissue. It may also have a practical value and contribute to the research on bone tissue substitutes in vitro. In particular, it might improve our understanding of the interactions of bone with implants based on polylactides. Effective reconstruction of bone defects is one of the most important aims of regenerative medicine. Current clinical treatments of bone defects, such as the use of autografts, allografts or implants based on medical materials are associated with several limitations. Thus, the current trends in research aim at obtaining bone tissue substitutes which are composed of man-made scaffolds and cells distributed on it and expected to induce osteogenesis at the implantation site. This is the object of study of a new interdisciplinary branch of science tissue engineering. In the most wanted scenario,

8 scaffold may disappear in time, being substituted by regenerated host tissue. It is possible when the material is resorbable, which means that it degrades with time, and the degradation products are removed via metabolic pathways. Among them are aliphatic polyesters that release lactic acid as a by-product and the materials from this group are taken for research in the present dissertation. Several tissue engineered products are already available on the market. However, their clinical use is not yet common. Although satisfactory results coming from animal models prove long viability, proliferation of cells and the synthesis of ECM, it is still difficult to obtain definite, unambiguous conclusions from human studies. Some problems come from a poor control of the material degradation, which may result in unexpected disturbance of tissue regeneration in vivo. The material degradability depends on several factors which characterize local environment of the graft, as well as the patient-to-patient variability. Uncontrolled degradation may lead to the inhibition of tissue regeneration, by causing cell necrosis, inflammation, which ultimately leads to the loss of the graft s functionality. In this context, a strategy of obtaining a bone graft in a way that the initial scaffold degradation occurs under control, during cell culture in vitro - prior to implantation, would be encouraging. At the time of implantation, the product would consist almost entirely of cells and extracellular matrix proteins produced by the cultured cells. Although such strategy has been mentioned by others before, no bone grafts are produced this way. The aim of the current study was to obtain a tissue engineered product for bone regeneration during a prolonged culture of human bone derived cells in vitro on a three-dimensional resorbable scaffold made of polylactic acid. The originality of the project was based on a hypothesis that lactic acid released during scaffold degradation would stimulate collagen type I synthesis by the cells. The effect of collagen production stimulated by lactic acid added to the culture has been already described for fibroblasts, however, such effect has not been confirmed for bone cell cultures as yet. The study had two main research aims. The first aim was to verify the hypothesis regarding the stimulatory effect of lactic acid on collagen synthesis by human bone cells cultured in vitro, while the latter aim was to propose new tissue engineered products - based

9 on this phenomenon. Several secondary aims of the study, which addressed the methodological issues, were stated as well. In order to attain the first main aim of the study, human bone derived cells were cultured with L-lactic acid present in the culture medium. The methods for collagen assessment in culture, as well as the concentration of lactic acid for further studies, were selected in the first - preliminary part of the study. In the next step, the influence of lactic acid on the expression, synthesis and the production of mature collagen fibers was analyzed in detail in three-week long cultures. Cell viability and differentiation were determined, as well. Additionally, the influence of ascorbic acid on the cells was tested in selected cultures. Control media, i.e. one medium containing D-lactic acid and one medium of a decreased ph (as low as caused by the presence of the lactic acid) were used to test the specificity of the L-lactic acid impact on the cells. Taking into account the patient-to-patient variability, in each individual experiment cells from one donor were used in all research groups, and the experiments were repeated using cells from different donors. Altogether, cells isolated from 18 donors were used in the study. The results clearly indicate the stimulatory effect of lactic acid on human bone derived cells. L-lactic acid added to the culture medium caused an increase in the expression collagen-coding gene and an increased synthesis of the collagen by the tested cells. Mature collagen fibers were produced by the cells stimulated by lactic acid. Additionally, it was shown that ascorbic acid even enhanced the lactate-induced synthesis of collagen. Moreover, it also partially neutralized the cytotoxic effect of lactic acid. The stimulatory influence of lactic acid on the terminal differentiation of bone cells, measured by osteocalcin concentration in cultures, was observed. Additional analyses revealed that the described effects were not specific for L-lactic acid, because the stimulatory effect on collagen production was also found in response to the decrease of the medium s ph by acid dissociation. Moreover, the influence on terminal differentiation and cytotoxicity of the acid dependented on the increase in the lactate anion concentration, as the effects were observed regardless of whether the ion source was L-lactic or D-lactic acid. The obtained results confirm the stimulatory effect of lactic acid on collagen production in bone cells, which has already been described by others for fibroblasts. However, the mechanism proposed for fibroblasts was not confirmed here. There was no influence of lactic acid on the

10 VEGF expression or synthesis, nor was poly(adp-rybose) polymerase decreased under acid influence on bone cells. It was also not proven that TGF- β1 might be an agent of the stimulatory effect of lactic acid. Cells were cultured on resorbable scaffolds made of polylactic acid in order to address the second main aim of the study. This was done to verify if the stimulatory effect of lactic acid on bone cells may be employed to obtain bone grafts in vitro on lactate-releasing scaffolds. Materials of two architectures were created: open-porous rigid and fibrous scaffolds. Scaffolds of the first type were porous cylinders of polylactide and polyglycolide copolymer (50/50) (PLLA/PLGA), prepared by a mould pressing, salt-leaching technique in order to reach high porosity (76 %). The latter ones were fibrous scaffolds made of polylactide (PLA), obtained by electrospinning. Structures composed of cells and very abundant cell-produced ECM with little amounts of synthetic materials were obtained at the end-point of the prolonged bone cell cultures on the scaffolds. In the PLLA/PLGA-based system only residuals of the materials remained. A gradual in vitro degradation of the scaffolds did not cause any negative effect on the cell population, neither on their viability, phenotype nor the synthesis of bonespecific extracellular matrix proteins. Several techniques were employed in order to enable proper cell adhesion, their long viability and maintenance of the bone cell phenotype in vitro. The methods for preparing scaffolds prior to culture and the cell seeding techniques on the scaffold were optimized. The degradation of the materials and the synthesis of the extracellular matrix proteins were assessed at the same time. The degradation of the porous rigid scaffold was observed macroscopically in the form of a gradual decrease of the amount of the material and a loss of its three-dimensional structure. At the macromolecular level, the progress of the degradation was measured by chromatography. In the case of fibrous scaffolds, the degradation rate was assessed by measuring the concentration of lactate released into the medium. A potential clinical use of the obtained tissue substitutes was proposed. Both products may be used as fillers in small-volume, non-load bearing sites, because of their weak mechanical strength in comparison to bone tissue. On the other hand, both weakly

11 textured PLLA/PLGA-based products and easily moldable PLA-based ones may be implemented in a minimally invasive manner, e.g. by packing the structure tightly into the defect site or by injection and are expected to well conform to the shape of the tissue defect. To summarize the results of the current study, to the best of my knowledge, it was shown for the first time that lactic acid stimulates human bone cells in vitro. It was proposed to employ this effect in obtaining tissue engineered products for bone during prolonged cell cultures in vitro on lactate-releasing scaffolds. The above concept is a subject of patent application pending at the Polish Patent Office and as an international application at the Patent Cooperation Treaty.