NOVA Lite Monkey Oesophagus IFA Kit/Slides (tylko przeciwciała skóry) Do diagnostyki in vitro Kod produktu: , ,

Transkrypt

1 NOVA Lite Monkey Oesophagus IFA Kit/Slides (tylko przeciwciała skóry) Do diagnostyki in vitro Kod produktu: , , Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie Te skrawki przełyku małpy są przeznaczone do stosowania jako substrat do badań przesiewowych autoprzeciwciał do wewnątrz-naskórkowych antygenów lub stref błony naskórkowej w surowicy ludzkiej, jako pomoc w diagnozowaniu odpowiednio pęcherzycy lub pemfigoidu klasycznego. Skrawki mogą nie obejmować tkanki śródmięśniowej i w związku z tym nie wolno ich używać do wykrywania przeciwciał śródmięśniowych. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Przeciwciała wewnątrz-naskórkowego IgG, które charakteryzują różne formy kliniczne pęcherzycy, reagują z antygenami występującymi na powierzchni komórki keratynocytów naskórka. Pozytywne wyniki dają charakterystyczny wzór drutu drobiu. Osadzanie się tkanki immuglobiny występuje prawie we wszystkich przypadkach. Zalecane jest zawsze sprawdzenie surowicy pacjenta i tkanki za pomocą choroby pęcherzowej. Przeciwciała strefy błony podstawowej klasyczne znajdują się w pemfigoidzie klasycznym. W przypadku tej choroby bezpośrednia biopsja wykazuje liniowe osadzanie IgG oraz C3 wzdłuż skórno-naskórkowego połączenia. Te autoprzeciwciała często, ale nie zawsze, występują w surowicy dotkniętych pacjentów. Jednak stężenie przeciwciał nie koreluje ze stanem choroby, a w przypadku klinicznej reemisji przeciwciała nadal występować w tkankach i surowicy. Koniugat FITC anty-ludzki IgG (H i L) (małpy) znajduje się w zestawie w celu zademonstrowania obu tych autoprzeciwciał. Zasada badania Niebezpośrednia technika immunofluorescencyjna 1 jest używana, gdy próbki pacjenta oraz odpowiednie kontrole są inkubowane z preparatami substratu. Niezwiązane przeciwciała są wypłukiwane i podawane są odpowiednie koniugaty znakowane fluoresceiną. Niezwiązany koniugat jest wypłukiwany i preparaty są oglądane pod mikroskopem fluorescencyjnym. Pozytywne próbki wykazują jasnozielone zabarwienie fluorescencyjne, które odpowiada obszarom skrawka, gdzie związało się autoprzeciwciało. Odczynniki 1. Skrawki przełyku małpy na próbkach 50- lub 10-dołkowych Tylko zestawy 2. Surowica kontroli pozytywnej (pochodząca z ludzkiej surowicy) wykazująca wzór drutu drobiu na skrawkach przełyku małpy, zawierająca azydek sodu o stężeniu 0,09%. Wstępnie rozcieńczony, gotowy do użycia. 3. Surowica kontroli pozytywnej (pochodząca z ludzkiej surowicy) zapewniająca wzór klasycznego pemphigoidu błony podstawowej lub skrawki przełyku małpy, zawierające azydek sodowy. Wstępnie rozcieńczony, gotowy do użycia. 4. Surowica kontroli negatywnej, uniwersalnie negatywne dla wszystkich autoprzeciwciał, zawierająca azydek sodowy o stężeniu 0,09% Wstępnie rozcieńczony, gotowy do użycia. 5. Bufor fosforanowy (PBS II), dostarczany jako 40-krotny koncentrat w formie płynnej. 6. Anty-ludzki koniugat fluoresceiny IgG (H i L) owcy oczyszczony na kolumnie powinowactwa. Wstępnie rozcieńczony, gotowy do użycia. 7. Błękit Evansa 1% jako opcjonalny barwnik kontrastowy. 8. Bibułki. 9. Środek do osadzania preparatu, zawierający czynnik zapobiegający blaknięciu (DABCO, 1, 4 diazabicyklo [2.2.2] oktan). 10. szkiełek nakrywkowych. 1

2 Ostrzeżenia/środki ostrożności Wszyscy dawcy dostarczonej ludzkiej surowicy (tylko zestawy) zostali przebadani na surowicę i stwierdzono, że są negatywni na antygen powierzchniowy zapalenia wątroby typu B i wirusa zapalenia wątroby typu C oraz wirusa ludzkiego niedoboru odporności (HIV 1 i 2). Jednak te badania nie mogą zagwarantować nieobecności czynników infekcyjnych. Należy ustalić odpowiednie metody obsługi i utylizacji wszystkich potencjalnie infekcyjnych materiałów badanych przy użyciu tego produktu. Jedynie personel odpowiednio przeszkolony w zakresie tych metod powinien być upoważniony do wykonywania tych badań. Błękit Evansa oraz kontrole zestawu zawierają azydek sodu 0,09%, pełniący funkcję konserwantu i należy obchodzić się z nim ostrożnie nie połykać i nie dopuszczać do kontaktu ze skórą lub błonami śluzowymi. W razie kontaktu przepłukać dane miejsce dużą ilością wody i zwrócić się o pomoc medyczną. Wybuchowe azydki metalu mogą tworzyć się w przypadku kontaktu z ołowianymi lub miedzianymi elementami instalacji kanalizacyjnej. W przypadku utylizacji odczynnika należy przepłukać instalację dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. Ten produkt powinien być używany wyłącznie przez przeszkolone osoby oraz zgodnie z przeznaczeniem. Zalecane jest przestrzeganie podanej procedury. Warunki przechowywania Nieotwarte zestawy powinny być przechowywane w temperaturze 2 8 C i mogą być używane w trakcie podanego terminu ważności. NIE ZAMRAŻAĆ. Gdy preparaty zostaną wyjęte z torebki foliowej, należy ich natychmiast użyć. Rozcieńczony bufor PBS II może być przechowywany maksymalnie przez jeden miesiąc w temperaturze 2 8 C. Wszystkie inne odczynniki powinny być przechowywane w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Próbki krwi powinny być pobierane poprzez wkłucie dożylne, powinny w naturalny sposób skrzepnąć, a surowica powinna zostać jak najszybciej oddzielona, aby nie dopuścić do hemolizy. Surowica przed analizą może być przechowywana w temperaturze 2 8 C do 7 dni lub dłużej, jeśli zostanie podzielona i będzie przechowywana w temperaturze -20 C lub niższej. 4. NIE zamrażać i rozmrażać surowicy więcej niż jeden raz. Unikać surowicy lipemicznej, hemolizowanej lub skażonej bakteryjnie, ponieważ może dojść do obniżenia stężenia lub może wystąpić niewyraźne wybarwienie. Badanie Dostarczone materiały (zestawy) x przełyk małpy (skóra) 5-dołkowy preparat 2. 1 x 1 ml kontroli pozytywnej pęcherzyca (wstępnie rozcieńczona) 3. 1 x 1 ml kontroli pozytywnej pemfigoidu (wstępnie rozcieńczona) 4. 1 x 1 ml systemu kontroli negatywnej IFA (wstępnie rozcieńczona) 5. 1 x 7 ml FITC IgG (H i L), koniugat małpy 6. 1 x 3 ml barwnika kontrastowego błękit Evansa 1% 7. 2 x 25 ml koncentratu PBS II (x40) 8. 1 x 3 ml środka do osadzania preparatu bibułek szkiełek nakrywkowych broszura z instrukcjami 2

3 x przełyk małpy (skóra) 10-dołkowy preparat 2. 1 x 1 ml kontroli pozytywnej pęcherzyca (wstępnie rozcieńczona) 3. 1 x 1 ml kontroli pozytywnej pemfigoidu (wstępnie rozcieńczona) 4. 1 x 1 ml systemu kontroli negatywnej IFA (wstępnie rozcieńczona) 5. 1 x 15 ml FITC IgG (H i L), koniugat małpy 6. 1 x 3 ml barwnika kontrastowego błękit Evansa 1% 7. 2 x 25 ml koncentratu PBS II (x40) 8. 1 x 10 ml środka do osadzania preparatu bibułek szkiełek nakrywkowych broszura z instrukcjami Dostarczone materiały (preparaty) x preparat przełyku małpy (skóra) (5 dołków) x preparat przełyku małpy (skóra) (5 dołków) Wymagane materialy nie dolaczone do zestawu Woda destylowana do rozcieńczania koncentratu PBS II Naczynie do buforu PBS II Mikropipety i jednorazowe końcówki do przenoszenia próbek pobranych od pacjentów Komora wilgotna do czynności związanych z inkubacją Mikroskop fluorescencyjny z filtrem wzbudzającym 495 nm i filtrem barierowym 515 nm Plastikowa gruszka laboratoryjna do wstępnego płukania w buforze PBS II Dodatkowe elementy można zakupić w firmie INOVA Diagnostics: PBS II (508998), system kontroli negatywnej IFA (508186), kontrola pozytywna pęcherzycy (504051), kontrola pozytywna pemfigoidu (504055), FITC (H+L) koniugat małpy (504011, ), błękit Evansa 1% (504049) i środek do osadzania preparatu (508001, , ). 3

4 Procedura badania Kontrola jakości Przy każdym badaniu próbek powinna być stosowana kontrola pozytywna i negatywna. 1. Środek do osadzania preparatu: Wyjąć środek do osadzania preparatu z chłodziarki, aby przed użyciem osiągnął temperaturę pokojową (18 28 C). 2. Rozcieńczyć koncentrat PBS II. Rozcieńczyć koncentrat PBS II wodą destylowaną lub dejonizowana (1 część koncentratu PBS II + 39 części wody destylowanej lub dejonizowana) i wymieszać. Uwaga: przygotować całą zawartość PBS II zestawu, jeśli cały zestaw zostanie zużyty w ciągu jednego miesiąca. Bufor PBS II jest używany do rozcieńczania próbek pacjentów oraz jako bufor do płukania. 3. Rozcieńczyć próbki pobrane od pacjenta. Rozcieńczyć próbki pochodzące od pacjenta w stosunku 1/10, dodając 20 µl surowicy do 180 µl buforu PBS II. 4. Preparaty substratu. Preparaty substratu przed wyjęciem z woreczka muszą osiągnąć temperaturę pokojową (18 28 C). Odpowiednio oznaczyć preparaty, umieścić w komorze wilgotnej i dodać jedną kroplę kontroli pozytywnej oraz negatywnej do odpowiednich dołków. Do pozostałych dołków dodać 50 µl rozcieńczonych próbek pochodzących od pacjenta. 5. Inkubacja preparatu. Inkubować preparaty przez 30 minut w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej (18 28 C). (Zmoczone ręczniki papierowe na dnie komory utrzymają wilgoć.) 6. Płukanie PBS II. Wyjąć preparaty z komory wilgotnej i krótko przepłukać PBS II posługując się gruszką laboratoryjną. Nie kierować strumienia bezpośrednio na dołki. Umieścić preparaty w statywie, zanurzyć w buforze PBS II i wstrząsać lub mieszać przez 5 10 minut. 7. Dodanie fluorescencyjnego koniugatu.strząsnąć nadmiar buforu PBS II i osuszyć przestrzeń wokół dołków za pomocą dostarczonych bibułek. Umieścić preparaty ponownie w komorze wilgotnej i natychmiast przykryć każdy dołek kroplą odpowiednio rozcieńczonego fluorescencyjnego koniugatu. NIE POZOSTAWIAĆ ODKRYTYCH DOŁKÓW NA CZAS DŁUŻSZY NIŻ 15 SEKUND. 8. Inkubacja preparatu. Inkubować preparaty przez 30 minut w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej (18 28 C). 9. Płukanie PBS II. Wykonać ponownie płukanie, zgodnie z punktem Opcjonalne barwienie kontrastowe. Przed zanurzeniem preparatu dodać 2 3 krople błękitu Evansa 1% na 100 ml buforu PBS II. 11. Osadzanie ze szkiełkiem nakrywkowym. Wyjąć po kolei preparaty z płukanki PBS II. Osuszyć szybko obszar wokół dołków i do każdego dołka dodać kroplę środka do osadzania preparatu. Opuścić ostrożnie preparat na szkiełko nakrywkowe. Należy starać się nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza, ale jeśli występują, nie należy ich usuwać. Zetrzeć nadmiar środka do osadzania wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego. 12. Obejrzeć preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym.preparaty mogą być przechowywane do 3 dni w temperaturze 2 8 C, w ciemności, bez istotnej utraty fluorescencji. Kontrola jakości Kontrola pozytywna pęcherzycy powinna wykazać jasnozielone zabarwienie w kostniwie międzykomórkowym nabłonka ( wzór siatki drucianej ). Kontrola pozytywna pemfigoidu powinna wykazać jasnozielone zabarwienie błony podstawowej. Kontrola negatywna powinna wykazać zgniłozielone zabarwienie we wszystkich tkankach, bez dostrzegalnej fluorescencji. Jeśli powyżej opisane kontrole nie zostaną uzyskane, badanie jest nieprawidłowe i należy je powtórzyć. 4

5 Interpretacja wyników Kolorowy przykład fotograficzny tego wzoru można znaleźć w punkcie ref. 2. Wyniki są raportowane jako pozytywne lub negatywne. Pozytywne przeciwciało pęcherzycy Zabarwienie kostniwa międzykomórkowego nabłonka wielowarstwowego. Pozytywne przeciwciało pemfigoidu Zabarwienie strefy błony podstawowej wzdłuż połączenia skórno-naskórkowego. Uwaga: Każde laboratorium powinno ustalić, na którym etapie wynik pozytywny jest traktowany jako klinicznie istotny. Ograniczenia badania 1. Źródło światła, filtry i przyrządy optyczne różnych producentów mikroskopów fluorescencyjnych wpływają na wrażliwość badania. Działanie mikroskopu jest w dużym stopniu uzależnione od prawidłowej obsługi/serwisowania. Szczególnie dotyczy to wycentrowania lampy rtęciowej oraz jej wymiany, zgodnie z zaleceniami serwisowymi 2. Przeciwciała przeciwjądrowe (ANA), przeciwmitochondrialne (AMA), przeciw-mięśnia gładkiego (ASMA) oraz mięśnia szkieletowego mogą reagować z substratem przełyku. Obecność tych autoprzeciwciał powinna być potwierdzona na odpowiednim substracie. 3. Test ten, gdy przeprowadza się go jako jedyny, nie powinien być rozpatrywany jako diagnostyczny. Muszą zostać uwzględnione wszystkie inne czynniki, w tym historia kliniczna pacjentów oraz inne wyniki serologiczne lub wyniki badań biopsyjnych. 4. Na skutek małej odległości pomiędzy dołkami na preparacie 10-dołkowym, może wystąpić krzyżowe zanieczyszczenie próbek i kontroli. Należy zachować ostrożność, szczególnie na etapie płukania, aby do tego nie dopuścić. 5. Przydatność do stosowania z odczynnikami IFA innych producentów nie została sprawdzona, ale stosowanie z takimi odczynnikami nie koniecznie musi być wykluczone. 6. Może wystąpić reaktywność krzyżowa na skutek obecności przeciwciał grupy krwi anty-a i anty-b, ponieważ śluzówka przełyku może zawierać określone substancje grupy krwi. 3 U niektórych pacjentów wzór zabarwienia może przypominać przeciwciała pęcherzycy, pomimo tego, że przeciwciała grupy krwi również będą barwić kapilary umięśnienia przełyku. Preparaty sprzedawane oddzielnie są sklasyfikowane jako Odczynniki analityczne. Nie ustalono ich właściwości analitycznych i wynikowych z wyjątkiem uwzględnienia jako składniku zestawu. Spodziewane wartości Preparaty przełyku małpy (skóra) zostały użyte do badania pacjentów z chorobami skóry: pęcherzycy i pemfigoidu jak również do badania 20 losowo wybranych dawców krwi. Wyniki: Liczba dodatnia Grupa pacjentów Numer Międzykomórkowe Strefa błony podstawowej Pęcherzyca Pemfigoid Normalne

6 Specyficzna charakterystyka wyników Badanie porównawcze zostało przeprowadzone na 25 próbkach surowicy (17 klinicznych, 8 normalnych) przy użyciu tego zestawu oraz komercyjnie dostępnej metody referencyjnej do pozytywnych próbek pęcherzycy i pemfigoidu. Ogólnie pomiędzy zestawami występowała dobra zgodność. W przypadku pęcherzycy 10 z 13 próbek wykazało wyniki pozytywny w obu zestawach. Dwie z niezgodnych próbek były na granicy wyniku pozytywnego w zestawie, ale negatywne w zestawie referencyjnym. W przypadku pemfigoidu wszystkie cztery pozytywne próbki wykazały zgodność, pomimo tego, że zabarwienie było nieco słabsze w zestawie konkurującym. Osiem normalnych przetestowanych próbek dało wynik negatywny w obu zestawach. Podsumowanie badania 1. Rozcieńczyć bufor PBS II wodą destylowaną lub dejonizowana. 2. Rozcieńczyć surowicę pacjenta buforem PBS II w stosunku 1/ Doprowadzić preparaty substratu do temperatury pokojowej (18 28 C). 4. Do odpowiednich dołków wlać 50 µl grupy kontrolnej pozytywnej i negatywnej oraz rozcieńczoną surowicę pacjenta. 5. Inkubować w komorze wilgotnej przez 30 minut. 6. Płukać przez 5 10 minut w buforze PBS II. 7. Osuszyć obszar wokół każdego dołka i natychmiast pokryć każdy dołek kroplą koniugatu. 8. Inkubować zgodnie z punktem Przepłukać zgodnie z punktem Osadzić. 11. Obejrzeć preparat pod mikroskopem fluorescencyjnym. 6

7 Piśmiennictwo 1. Weller, T. H; Coons, A.H. (1954): Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes Zoster propagated in vitro: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: Bradwell A. R. et al (1997): Atlas of autoantibody patterns on tissues. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK. 3. Szulman AE. (1962): The histological distribution of blood group substances A and B in man. J. Exp. Med Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3 rd Edition) Ed. A Milford Ward, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14. NOVA Lite I INOVA Diagnostics, Inc. jest zastrzeżonym znakiem handlowym Copyright Wszelkie prawa zastrzeżone 7

8 Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Niemcy Tel.: Faks.: POL Listopad 2013 Wersja 2 8