Ocena pracy doktorskiej mgr inż. Katarzyny Kur

Transkrypt

1 Dr hab. inż. Jerzy Karpiuk Instytut Fizyki PAN Warszawa, Al. Lotników 32/46 Warszawa, Ocena pracy doktorskiej mgr inż. Katarzyny Kur Fluorescencyjne badania pochodnych kwasu boronowego w aspekcie zastosowania w sensorze optycznym do oznaczania wybranych cukrów Czujniki lub sensory molekularne służące do specyficznego i selektywnego wykrywania różnych indywiduów chemicznych są od wielu lat przedmiotem intensywnych badań, głównie z uwagi na możliwość stosowania in situ i w powiązaniu z nieinwazyjnymi metodami analizy. W ostatnich dwóch dekadach szczególną rolę zaczęły odgrywać czujniki fluorescencyjne, które ze względu na wysoką czułość metod detekcji światła umożliwiają oznaczanie analitów nawet na poziomie attomolowym. Cukry są substancjami powszechnie występującymi w przyrodzie, a ich oznaczanie jest bardzo istotne w wielu dziedzinach, w tym przede wszystkim w diagnostyce medycznej ze względu na rolę glukozy w fizjologii człowieka. Pomimo wysokiego stopnia zaawansowania fizycznych i chemicznych technik oznaczania tych związków, poszukuje się nowych metod, zwłaszcza umożliwiających oznaczanie poziomu glukozy za pomocą światła in vivo i bezboleśnie, bez naruszania ciągłości tkanek, np. za pośrednictwem odpowiednich tatuaży czy soczewek kontaktowych. Metody te wymagają sensorów optycznych opartych na receptorach, które w wyniku selektywnego oddziaływania z glukozą zmieniają parametry emitowanej fluorescencji, sygnalizując w ten sposób ilościowo obecność cukru. Kandydatami na takie receptory są między innymi aromatyczne pochodne kwasu boronowego badane w rozprawie doktorskiej mgr inż. Katarzyny Kur. Rozprawa została przygotowana pod kierunkiem dr hab. inż. Ewy Miller jako promotora i pod opieką dr inż. Małgorzaty Przybyt jako promotora pomocniczego w Zespole Biofizyki Chemicznej na Wydziale Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej. 1

2 Praca wpisuje się w prowadzone od wielu lat przez Panią promotor z zespołem badania nad sensorami optycznymi i ich zastosowaniem jako biosensory fluorescencyjne. Recenzowana rozprawa doktorska składa się z autoreferatu (47 stron) poprzedzającego zbiór pięciu załączonych publikacji ([P1] - [P5]) w ich postaci wydawniczej. Publikacje te ukazały się w latach , są poświęcone badaniom optycznym pochodnych kwasu boronowego z punktu widzenia ich zastosowania w sensorach optycznych do oznaczania cukrów i stanowią zbiór spójny tematycznie, a jako takie spełniają wymagania art. 13 ust. 2 ustawy z 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. z 2017 r., poz ze zm.) w odniesieniu do formy rozprawy doktorskiej. Dwa z załączonych artykułów ukazały się w czasopismach o zasięgu światowym (Journal of Luminescence [P2] i Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy [P3]), a trzy ([P1], [P4] i [P5]) w Biotechnology and Food Science, czasopiśmie branżowym wydawanym na Wydziale Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej publikującym recenzowane artykuły w trybie otwartego dostępu (MNiSzW - lista B, 8 pkt). Nie umniejszając rangi BFS, wydaje się, że praca [P4] i - zwłaszcza - praca [P5] mogłyby z powodzeniem ukazać się w czasopismach o szerszym zasięgu międzynarodowym. Łączna liczba punktów za załączone publikacje według listy czasopism MNiSzW wynosi 89. Praca [P3] ma 10 cytowań (w tym 2 autocytowania), praca [P2] - 4 (w tym 2 autocytowania). Publikacje wchodzące w skład rozprawy są wieloautorskie, a ich współautorami są także promotor (5 artykułów) i promotor pomocniczy (4 artykuły). Wszystkie artykuły opublikowano w języku angielskim. Autorka rozprawy jest pierwszym autorem wszystkich publikacji, a w jednej z nich ([P5]) jest autorem korespondencyjnym, co wskazuje na Jej wiodącą rolę w przygotowaniu tych artykułów, jednak brak danych na temat udziału Doktorantki i pozostałych współautorów w przygotowaniu poszczególnych prac utrudnia ocenę tego aspektu i dlatego proszę o przedstawienie stosownej informacji podczas obrony rozprawy. Autoreferat poprzedzający załączone artykuły zawiera streszczenie rozprawy w języku polskim i angielskim, wprowadzenie, opis celu i zakresu pracy, opis i dyskusję wyników, wnioski końcowe oraz wykaz literatury cytowanej w autoreferacie, obejmujący 51 pozycji. We wprowadzeniu, omówiwszy pokrótce istniejące fizyczne i chemiczne metody oznaczania cukrów, Doktorantka przekonywująco uzasadniła potrzebę poszukiwania nowych optycznych czujników cukrów w kontekście rozwoju nowoczesnych metod oznaczania tych substancji, w tym zwłaszcza sensorów glukozy. Wybrane do badań aromatyczne pochodne kwasu 2

3 boronowego oddziałują specyficznie z cukrami, a ich fluorescencja ulega zmianie w obecności cukrów. Z tych też względów dobór tematu rozprawy należy uznać za trafny i przemyślany, a sam temat za aktualny i ważny. Tekst autoreferatu jest opracowany poprawnie i dość obszernie relacjonuje przeprowadzone badania i uzyskane wyniki. Mankamentem autoreferatu jest brak opisu stosowanych metod i technik eksperymentalnych, który by porządkował i syntetycznie przedstawiał ewentualną ewolucję tych metod wraz z postępem wykonywanych badań. A tak jest w przypadku - ważnych z punktu widzenia rozprawy - badań zaników fluorescencji, gdzie przejście ze wzbudzenia nanosekundową lampą wodorową ([P1]) przez impulsową nanosekundową diodę luminescencyjną (n.b., o różnie podawanym czasie impulsu - < 1,0 ns [P2] i < 0,01 ns [P3]) do sub-nanosekundowej impulsowej diody luminescencyjnej [P4]), wiąże się ze zmianami funkcji odpowiedzi przyrządu, czasu trwania, warunków i rozdzielczości czasowej pomiaru, a co za tym idzie istotnie wpływa na błąd wyznaczanego czasu zaniku fluorescencji. Pewien niedosyt pozostawia też przedstawiony w autoreferacie bardzo skromny przegląd dotychczasowych badań sensorów fluorescencyjnych cukrów na bazie związków boronowych, także dlatego, że szersza prezentacja wiedzy zgromadzonej w tej dziedzinie pozwoliłaby lepiej zarysować oryginalność i nowatorski charakter wyników przedstawionych w rozprawie. Autoreferat zawiera stosunkowo niewiele błędów językowych lub typograficznych. Wśród tych pierwszych należy wymienić nadużywanie lub niewłaściwe używanie terminu "absorbancja" ("widmo absorbancji", "techniki absorbancji", "molowy współczynnik absorbancji") czy "emisja fluorescencji (np. "charakterystyka absorbancji oraz emisji fluorescencji PBA" str. 19). Zamiast przymiotnika "optyczny" w stosunku do np. właściwości lub charakterystyki lepiej jest używać, zależnie od kontekstu, "fotofizyczny" (jak na str. 16 zauważa Autorka) lub "spektroskopowy". Wykaz piśmiennictwa cytowanego w autoreferacie zawiera szereg drobnych błędów typograficznych lub nieścisłości (np. pozycje 7, 14, 22, 43, 49). Razi także niespójność w odmianie nazwisk obcojęzycznych: nieodmieniane przy odsyłaniu do przypisów (np. "przez Yoon i Czarnik" (str. 13), "przez Yan i współpr." "przez Soundararajan i współpr." (str. 19), i odmieniane w przywołaniach nazw metod, np. "Sterna- Volmera" (str. 19) czy "Mollera-Plesseta" (str. 35). Za cel pracy Autorka postawiła sobie zbadanie i próbę "dogłębnej", jak sama zaznacza, analizy szeregu właściwości optycznych wybranych pochodnych kwasu boronowego w środowisku wodnym w szerokim zakresie ph i w określonym zakresie stężeń wybranych 3

4 cukrów. Zaplanowane badania miały posłużyć uzupełnieniu wiedzy na temat spektroskopii tych związków, a przede wszystkim - znalezieniu takiej pochodnej kwasu boronowego, która będzie dobrym sensorem optycznym cukrów i w tym sensie tezę naukową rozprawy - chociaż nie sformułowaną explicite - należy w zasadzie utożsamiać z pytaniem o przydatność badanej grupy związków chemicznych do tego celu. Cel rozprawy sformułowano właściwie, a przeprowadzone badania niewątpliwie poszerzyły wiedzę o badanych układach i pozwoliły określić stopień przydatności tych związków do oznaczania cukrów. Trudno jednak uznać materiał przedstawiony w rozprawie za dogłębną lub wnikliwą (str. 17) charakterystykę właściwości fotofizycznych badanych związków układów. Badania opisane w rozprawie składają się zasadniczo z (i) eksperymentalnej charakteryzacji właściwości spektroskopowych w zakresie UV/Vis wybranych trzech aromatycznych pochodnych kwasu boronowego: kwasu fenyloboronowego (PBA) (szerzej opisanego w [P1]), kwasu 3-aminofenyloboronowego (3APBA) (szerzej opisanego w [P2] i [P3]) i kwasu 3-(acetamidometylo)fenyloboronowego (3AAPBA) (szerzej opisanego w [P4]) oraz ich estrów z wybranymi cukrami, a także (ii) obliczeń kwantowo-chemicznych metodami DFT i TD-DFT kwasów 3APBA, 3AAPBA oraz ich form estrowych z fruktozą (opisane szczegółowo w [P5]). Epizodycznie w autoreferacie potraktowano opisane szerzej w pracy [P3] badania dwuskładnikowego sensora kwas 3APBA-kropki kwantowe oraz nieopisane publikacyjnie badania właściwości fotofizycznych kwasu 2- aminokarbonylofenyloboronowego (ze względu na brak efektu obecności cukrów na fotofizykę tego związku). Do głównych wyników rozprawy zaliczam: - opis podstawowych właściwości fotofizycznych badanych kwasów boronowych, PBA, 3APBA i 3AAPBA w roztworze wodnym, przy różnych wartościach ph roztworu; - zbadanie wpływu obecności wybranych cukrów w roztworze wodnym na fluorescencję badanych kwasów boronowych, przy różnych wartościach ph roztworu; - wykorzystanie pomiarów zaników fluorescencji do określenia właściwości fotofizycznych dwóch form pochodnej kwasu boronowego, z atomem boru o hybrydyzacji sp 2 i sp 3 ; - wyznaczenie zoptymalizowanej geometrii i struktury elektronowej dwóch form cząsteczki badanych kwasów boronowych 3APBA i 3AAPBA oraz estrów tych kwasów z fruktozą, a także wskazanie przyczyn bardziej efektywnego tworzenia estru przez formę 4

5 kwasu z atomem B o hybrydyzacji sp 3. i wytypowanie najbardziej stabilnej formy estru pochodnych obu form kwasu z fruktozą; - porównanie dwóch metod wyznaczania stałej równowagi kwasowo-zasadowej, opartych na pomiarach absorpcji i emisji; - określenie równowag kwasowo-zasadowych pochodnych boronowych przy użyciu metod chemometrycznych. Oceniając te wyniki stwierdzam, że są one oryginalne, zawierają elementy nowości naukowej, uzupełniają dotychczasową wiedzę o właściwościach fotofizycznych kwasów boronowych i są istotne dla rozwoju metod detekcji sacharydów z wykorzystaniem pochodnych boronowych. Chociaż sposób przedstawienia i interpretacja wyników zasługują ogólnie na pozytywną ocenę, mam w tym zakresie szereg uwag krytycznych i proszę o ustosunkowanie się do nich w trakcie obrony: 1. W rozprawie brak informacji o weryfikacji czystości badanych związków, np. za pomocą widm wzbudzenia fluorescencji. 2. W rozprawie brak informacji o usuwaniu tlenu z badanych roztworów w pomiarach widm i zaników fluorescencji, co mogło mieć wpływ na uzyskiwane wyniki, zwłaszcza w przypadku dłuższych zarejestrowanych zaników fluorescencji (np. czas zaniku rzędu 8 ns i dłuższy, [P2]-[P3]). 3. Na str. 19 autoreferatu znajduje się informacja o zgodności obserwacji Autorki z "charakterystyką absorbancji i fluorescencji PBA opisaną uprzednio przez Patil i współpr. [27]". Pomijając fakt, że praca [P1], na wyniki z której powołuje się w tym miejscu Autorka, jest wcześniejsza niż [27], lektura pracy [27] (Fig. 2 i Fig. 3) wskazuje na bardzo duże rozbieżności widm absorpcji i fluorescencji PBA w wodzie przedstawianych w [27] i w rozprawie. 4. Wbrew temu, co pisze Autorka (str. 21), duże przesunięcie Stokesa nie wskazuje na szerszą przerwę energetyczną między stanem S 0 a stanem S 1, ale ogólnie ujmując opisuje różnicę między stanem osiąganym w wyniku absorpcji promieniowania, a stanem emitującym fluorescencję. 5. Przedstawianie widm absorpcji w postaci znormalizowanej zaciera zawarte w nich informacje, np. na temat molowego współczynnika absorpcji. Na przykład, na rys. 3, str. 18 wystarczyłoby zachować oryginalną skalę absorbancji w widmie absorpcji i graficznie 5

6 zrównać maksimum widma absorpcji z maksimum widma fluorescencji, co przy podaniu stężenia i długości drogi optycznej umożliwia czytelnikowi odczytanie wartości ε. Po normalizacji, widmo nie przedstawia już absorbancji z pomiaru, i - podając stężenie roztworu w podpisie rysunku - należałoby wskazać, że oś rzędnych na wykresie przedstawia absorbancję w jednostkach względnych. 6. Podobnie, niewielka jest zawartość informacyjna rysunków ze zoptymalizowanymi strukturami badanych cząsteczek (rys. 10, 11, str. 36, 37), zamieszczenie na nich parametrów geometrycznych istotnych dla interpretacji geometrii takich jak np. długości (nawet wybranych) wiązań lub kątów zdecydowanie zwiększyłoby przydatność takiego rysunku. 7. Opisy osi rzędnych na wykresach przedstawiających zależność natężenia fluorescencji jako funkcji długości fali, są niespójne: na rys. 3 (str. 18), 5, 6 (str. 22) jest to "emisja fluorescencji" (bez jednostek), na rys. 4 str. 20 "Intensywność [j. w.]", na rys. 8 A "emisja fluorescencji [a.u.]". Co ciekawe, niespójności tej nie ma w publikacji [P1]. 8. W zakresie długości fal promieniowania wzbudzającego ( nm) stosowanych w badaniach spektroskopowych kwasu PBA występuje znacząca absorpcja glukozy. Jak ją uwzględniano w analizie wyników, zwłaszcza przy interpretacji wygaszania fluorescencji badanych kwasów boronowych przez glukozę? 9. W rozprawie nie dopatrzyłem się analizy błędów wyznaczanych wielkości, natomiast często wielkości te są podawane wraz z błędem ich wyznaczenia. Podawane przez Autorkę wielkości tych błędów (np. błąd 0,01 ns przy wyznaczaniu czasów życia rzędu 8,4 ns za pomocą układu o rozdzielczości co najwyżej setek ps, Tabela 4, str. 25, czy błąd 0,001 dla wyznaczonej wydajności kwantowej 0,062, tj. <5%) są nierealistyczne i wskazują na zbyt duże poleganie na danych generowanych przez stosowane programy komputerowe. 10. W autoreferacie i załączonych publikacjach nie znalazłem wartości wydajności kwantowej fluorescencji 3APBA, jest natomiast mowa o tym, że intensywność fluorescencji kwasu 3APBA jest o 2 rzędy wielkości wyższa niż dla 3AAPBA (str ), która jest równa Takie stwierdzenie uruchamia wyobraźnię. Proszę o wyjaśnienie. 6

7 11. Co kryje się za terminem "złożony mechanizm wygaszania fluorescencji" w przypadku obserwowanego wygaszania fluorescencji badanych aromatycznych kwasów boronowych przez cukry? W podsumowaniu oceny recenzowanej rozprawy doktorskiej stwierdzam, że w toku przeprowadzonych badań Pani mgr inż. Katarzyna Kur uzyskała istotne i wartościowe wyniki, uzupełniające dotychczasową wiedzę o fotofizyce badanych aromatycznych kwasów boronowych i ich oddziaływaniu z wybranymi cukrami. Przedstawione wyżej uwagi i komentarze krytyczne nie umniejszają mojej pozytywnej oceny ogólnej, stwierdzającej, że przedstawiona rozprawa doktorska spełnia standardy prac doktorskich. Zamierzenia i cele badawcze rozprawy zostały zrealizowane, a Doktorantka potrafiła wykorzystać uzyskane wyniki do sformułowania ogólniejszych wniosków i hipotez. W konkluzji pragnę poinformować Radę Naukową Wydziału Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej, że mgr inż. Katarzyna Kur w swojej pracy doktorskiej spełniła naukowe, formalne i zwyczajowe wymagania stawiane rozprawom doktorskim. Opierając się na przedstawionej rozprawie i dorobku naukowym Doktorantki wnoszę o dopuszczenie mgr inż. Katarzyna Kur do kolejnych etapów przewodu doktorskiego i do publicznej obrony rozprawy doktorskiej. Jerzy Karpiuk Warszawa,