KRĄŻKI DO OZNACZANIA WRAŻLIWOŚCI BAKTERII NA ANTYBIOTYKI 50 KRĄŻKÓW W RURCE Oznaczanie wrażliwości na leki przeciwbakteryjne

Transkrypt

1 KRĄŻKI DO OZNACZANIA WRAŻLIWOŚCI BAKTERII NA ANTYBIOTYKI 50 KRĄŻKÓW W RURCE Oznaczanie wrażliwości na leki przeciwbakteryjne 2016/11 1- ZNACZNIE KLINICZNE Krążki są przeznaczone do półilościowego oznaczania wrażliwości in vitro na antybiotyki i chemioterapeutyki bakterii szybko rosnących oraz niektórych trudno rosnących gatunków metodą dyfuzji w podłożu agarowym. Metoda oparta na wystandaryzowanej procedurze wydanej przez WHO (1), została zaadoptowana jako powszechnie stosowany standard przez CLSI (2, 3), CA-SFM (4) oraz EUCAST (5) (aktualizowany na bieżąco). Najnowsze wytyczne, dotyczące wykonania testu wrażliwości oraz interpretacji wyników, znajdują się w ostatniej edycji wytycznych CLSI (2, 3), CA-SFM (4) oraz EUCAST (5). 2- ZASADA METODY Oznaczanie wrażliwości bakterii na antybiotyki metodą dyfuzyjno-krążkową polega na naniesieniu bibułowych krążków nasyconych antybiotykiem lub chemioterapeutykiem w określonym stężeniu na powierzchnię odpowiedniego podłoża agarowego (A) na płytkach Petriego, uprzednio zaszczepionego wykalibrowanym inokulum (A) czystej i młodej hodowli badanego szczepu bakterii. Po inkubacji dokonuje się pomiaru średnicy stref zahamowania wzrostu bakterii wokół poszczególnych krążków i porównuje z wartościami granicznymi (A) dla badanych antybiotyków, w celu zaklasyfikowania szczepu bakteryjnego jako wrażliwy, średnio-wrażliwy lub oporny na dany preparat antybakteryjny. Wielkość strefy zahamowania wzrostu jest proporcjonalna do wrażliwości badanego szczepu na dany lek. (A) Zgodnie z najnowszymi rekomendacjami CLSI (2, 3), CA-SFM (4) oraz EUCAST (5). 3- POSTAĆ TESTU Krążki produkowane przez Bio-Rad mają średnicę 6.5 mm i wykonane są z wysokiej jakości bibuły impregnowanej roztworami antybiotyków o dokładnie określonym stężeniu. Krążki z każdej strony są wyraźnie oznakowane 1-3 literowym symbolem (patrz tabela 1). Krążki znajdują się w rurkach po 50 krążków, umieszczonych w wodoszczelnym opakowaniu z pochłaniaczem wilgoci. Tabela 1. Krążki do oznaczania lekowrażliwości w ofercie firmy Bio-Rad. STĘŻENIE SYMBOL OPAKOWANIE NR KAT. Amikacin AKN Amoxicillin 25 µg AMX Amoxicillin + Clavulanic Acid 2/1 µg 20/10 µg AUG3 AMC Ampicillin 2 µg 10 µg API2 AMP Ampicillin + Sulbactam 10/10 µg SAM Azithromycin 15 µg AZM Aztreonam ATM Bacitracin 10 IU (1) BCT Carbenicillin 100 µg CRB Cefaclor CEC Cefalexin CXN

2 STĘŻENIE SYMBOL OPAKOWANIE NR KAT. Cefamandole FAM Cefazolin CZN Cefepime FEP Cefixime 5 µg 10 µg FIX5 CFM Cefoperazone 75 µg CFP75 CPZ Cefoperazone + Sulbactam 75/ SCF Cefotaxime 5 µg COX5 CTX Cefotetan CTT Cefoxitin FOX Cefpirome CPO Cefpodoxime 10 µg CPD Cefprozil CPR Cefsulodin CFS Ceftaroline 5 µg CPN Ceftazidime 10 µg CZD10 CAZ Ceftibuten CTB Ceftriaxone CRO Cefuroxime CXM Cephalothin CEF Chloramphenicol CHL Ciprofloxacin 5 µg CIP Clarithromycin 15 µg CLR Clindamycin 2 µg CMN Colistin 10 µg 50 µg COL10 CST Doripenem 10 µg DOR Doxycycline DOX Ertapenem 10 µg ETP Erythromycine 15 µg ERY Flumequine UBN Fosfomycin 50 µg 200 µg FSF50 FOS Fusidic Acid 10 µg FAD Gentamicin 10 µg 10 IU (15 µg) GMN10 GMI15 GME Gentamicin (high load) 120 µg 500 µg HLG120 GEN Imipenem 10 µg IPM Isepamicin ISP Kanamycin KMN Kanamycin (high load) 1 mg KAN Levofloxacin 5 µg LVX Lincomycin 15 µg LCN Linezolid 10 µg LIN Linezolid LZD Mecillinam 10 µg MEC Meropenem 10 µg MEM Metronidazole 4 µg MTR Mezlocillin 75 µg MZN Minocycline MNO Moxalactam MOX Moxifloxacin 5 µg MXF Mupirocin 5 µg MUP µg PUM Nalidixic Acid NAL Neomycin 30 IU NEO Netilmicin 10 µg NTM10 NET Nitrofurantoin 100 µg NFE Nitrofurantoin 300 µg FTN Nitroxolin 20 µg NIT Norfloxacin 10 µg NXN

3 STĘŻENIE SYMBOL OPAKOWANIE NR KAT. 5 µg NOR Ofloxacin 5 µg OFX Oleandomycin 15 µg OLE Oxacillin 1 µg 5 µg OXC1 OXA Oxolinic Acid 10 µg OAD Pefloxacin 5 µg PEF Penicillin 1 IU 6 µg (10 IU) PNG1 PEN Pipemidic Acid 20 µg PIM Piperacillin 75 µg 100 µg PIL30 PIP75 PIR Piperacillin + Tazobactam 30/6 µg 75/10 µg 100/10 µg PTZ36 PPT85 TZP Polymixin 300 IU (50 µg) PXB Pristinamycin 15 µg PTN Quinupristin-Dalfopristin 15 µg QDF Rifampicin 5 µg RIF5 RAM Sparfloxacin 5 µg SPX Spectinomycin 100 µg SPT Spiramycin 100 µg SPN Streptomycin 10 µg SMN Streptomycin (high load) 300 µg 500 µg HLS300 STR Sulphonamides 300 µg 200 µg SSS300 SUL Teicoplanin TEC Telithromycin 15 µg TEL Temocillin TEM Tetracycline TET Ticarcillin 75 µg TIC Ticarcillin + Clavulanic Acid 75/10 µg TCC Tigecycline 15 µg TGC Tobramycin 10 µg TMN10 TOB Trimethoprim + Sulfamethoxazole 1.25/23.75 µg SXT Trimethoprim 5 µg TMP Vancomycin 5 µg VNC5 VAN PRZECHOWYWANIE Podana data ważności odnosi się wyłącznie do krążków w nieotwieranym opakowaniu, przechowywanym zgodnie z zaleceniami producenta. Data ważności i numer serii znajdują się na etykiecie (na rurce z krążkami oraz na opakowaniu zewnętrznym). Rurki z krążkami należy przechowywać w oryginalnym opakowaniu w temp C w suchym miejscu. Przed otwarciem opakowanie z krążkami musi osiągnąć do temp. pokojową (18-30 C). Po wyjęciu potrzebnej liczby krążków, pozostałe schować do lodówki. Nie używać krążków po upływie terminu przydatności. W przypadku krążków, które były pozostawione w temp. pokojowej (18-30 C) ponad 8 godzin, nastawić antybiogramy wzorcowe przed dalszym użytkowaniem (6). Krążki pozostające w dyspenserze powinny być przechowywane w temp C w suchym miejscu, z pochłaniaczem wilgoci wewnątrz. W otwartym opakowaniu lub w dyspenserze, krążki są stabilne przez 6 tygodni (przechowywane zgodnie z zaleceniami z pochłaniaczem wilgoci) za wyjątkiem krążków nasączonych antybiotykiem, oznaczonych symbolem, których okres stabilności, wyrażony w tygodniach, oznaczony jest we wnętrzu symbolu. 5- INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY Dyspenser krążków na 6-7 krążków nr kat. # na krążków nr kat. # Podłoża mikrobiologiczne (zgodnie z najnowszymi zaleceniami (CLSI (2, 3), CA-SFM (4) oraz EUCAST (5) ) Odczynniki Szczepy wzorcowe bakterii 3

4 Wzorzec gęstości inokulum: 0.5 w skali McFarlanda Sprzęt laboratoryjny do oznaczania wrażliwości na antybiotyki metodą dyfuzyjno-krążkową 6- ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA Należy postępować zgodnie z najnowszymi wytycznymi (CLSI (2, 3), CA-SFM (4), EUCAST (5) ). Należy przestrzegać zasad bezpieczeństwa pracy z materiałem zakaźnym. Wykorzystane hodowle i wszystkie zanieczyszczone nimi materiały poddać sterylizacji. 7- PROCEDURA Próbki: Testu wrażliwości nie należy wykonywać na podłożach z bezpośrednio wysianym materiałem klinicznym. Stosowane do testu inokulum bakterii powinno być przygotowane wg zaleceń (CLSI (2, 3), CA-SFM (4) lub EUCAST (5) ) z czystej, młodej hodowli. Każdy etap oznaczenia i interpretacji wrażliwości na antybiotyki powinien być wykonywany zgodnie z instrukcjami CLSI (2, 3), CA-SFM (4) oraz EUCAST (5) : sporządzenie wystandaryzowanego wg. CLSI (2, 3), CA-SFM (4) lub EUCAST (5) inokulum, wysiew na płytki Petriego, dobór i układ na płytce odpowiednich krążków, temperatura i czas inkubacji oraz interpretacja wyników. Należy przestrzegać zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. 8- INTERPRETACJA WYNIKÓW Należy dokładnie zmierzyć średnicę strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół krążka i porównać z wartościami granicznymi (CLSI (2, 3), CA-SFM (4), EUCAST (5) ). Od wielkości strefy zahamowania wzrostu w porównaniu z wartością graniczną zależy ocena wrażliwości szczepu (wrażliwy, średnio-wrażliwy lub oporny) na dany antybiotyk lub chemioterapeutyk. Kryteria te są na bieżąco aktualizowane w nowych edycjach standardów CLSI (2, 3), CA-SFM (4), EUCAST (5). 9- KONTROLA Aktywność krążków należy systematycznie kontrolować z użyciem następujących szczepów wzorcowych: Escherichia coli Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Streptococcus pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Haemophilus influenzae Enterococcus faecalis Clostridium perfringens Enterococcus faecalis Clostridium sporogenes W tabeli 2 podano akceptowane strefy zahamowania wzrostu w metodzie dyfuzyjno-krążkowej dla wymienionych szczepów referencyjnych. KONTROLA Standard E.coli Amikacin / Amikacyna CLSI Amoxicillin / Amoksycylina 25 µg Wewn Amoxicillin + Clavulanic Acid / Amoksycylina z kwasem klawulanowym 20 / 10 µg CLSI Ampicillin / Ampicylina 10 µg CLSI Ampicillin+ Sulbaktam / 10 / 10 Ampicylina z sulbaktamem µg CLSI Azithromycin /Azytromycyna 15 µg CLSI Aztreonam / Aztreonam CLSI Bacitracin / Bacytracyna 10 UI Wewn Carbenicillin/ Karbenicylina 100 µg CLSI Cefaclor/ Cefaklor CLSI Cefalexin / Cefaleksyna Wewn Cefamandole / Cefamandol CLSI Cefazolin / Cefazolin CLSI Cefepime / Cefepim CLSI Cefixime / Cefiksym 10 µg Wewn Cefixime / Cefiksym 5 µg CLSI Cefoperazone / Cefoperazon CLSI Cefoperazone / Cefoperazon 75 µg Wewn Cefoperazone + Sulbactam / Cefoperazon + Sulbaktam 75/ Wewn Cefotaxime / Cefotaksym CLSI Cefotetan / Cefotetan CLSI S.aureus P.aeruginosa S.pneumoniae H.influenzae

5 KONTROLA Standard E.coli Cefpirome / Cefpirom Wewn Cefpodoxim / Cefpodoksym 10 µg CLSI Cefprozil / Cefprozil CLSI Cefsulodin / Cefsulodyna Wewn Ceftazidime / Ceftazydym CLSI Ceftibuten / Ceftibuten CLSI Ceftriaxone / Ceftriakson CLSI Cefuroxime / Cefuroksym CLSI Cephalothin / Cephalothina CLSI Chloramphenicol / Chloramfenikol CLSI Ciprofloxacin / Ciprofloksacyna 5 µg CLSI Clarithromycin/Klarytromycyna 15 µg CLSI Clindamycin / Klindamycyna 2 µg CLSI Colistin / Kolistyna 10 µg CLSI Colistin / Kolistyna 50 µg CA-SFM Doxycycline / Doksycyklina CLSI Ertapenem/ Ertapenem 10 µg CLSI Erythromycine / Erytromycyna 15 µg CLSI Flumequine / Flumekina Wewn Fosfomycin / Fosfomycyna 50 µg CA-SFM Fosfomycin / Fosfomycyna 200 µg CLSI Fusidic Acid / Kwas fusydowy 10 µg CA-SFM Gentamicin / Gentamycyna 10 µg CLSI Gentamicin / Gentamycyna 10 UI CA-SFM Imipenem / Imipenem 10 µg CLSI Isepamycin / Izepamycyna Wewn Kanamycin / Kanamycyna CLSI Levofloxacin / Lewofloksacyna 5 µg CLSI Lincomycin / Linkomycyna 15 µg CA-SFM Linezolid / Linezolid CLSI Mecillinam / Mecillinam 10 µg CLSI Meropenem / Meropenem 10 µg CLSI Mezlocillin / Mezlocylina 75 µg CLSI Minocycline / Minocyklina CLSI Moxalactam / Moksalaktam CLSI Moxifloxacin/ Moksyfloksacyna 5 µg CLSI Mupirocin / Mupirocyna 5 µg Wewn Mupirocin/ Mupirocyna 200 µg CLSI Nalidixic Acid / Kwas nalidyksowy CLSI Neomycin / Neomycyna 30 UI Wewn Netilmicin / Netylmycyna CLSI Nitrofurantoin / Nitrofurantoina 300 µg CLSI Nitroxolin / Nitroksolina 20 µg Wewn Norfloxacin / Norfloksacyna 5 µg Wewn Norfloxacin / Norfloksacyna 10 µg CLSI Ofloxacin / Ofloksacyna 5 µg Wewn Oleandomycin/ Oleandomycyna 15 µg Wewn Oxacillin / Oksacylina 5 µg CA-SFM Oxacillin / Oksacylina 1 µ CLSI Oxolinic Acid / Kwas oksolinowy 10 µg Wewn Pefloxacin / Pefloksacyna 5 µg CA-SFM Penicillin / Penicylina 6 µg CLSI Pipemidic Acid / Kwas pipemidowy 20 µg Wewn Piperacillin / Piperacylina 100 µg CLSI Piperacillin / Piperacylina 75 µg Wewn S.aureus P.aeruginosa S.pneumoniae H.influenzae

6 KONTROLA Standard E.coli S.aureus P.aeruginosa S.pneumoniae H.influenzae Piperacillin + tazobactam / 75 / 10 Piperacylina z tazobaktamem µg Wewn Piperacillin + tazobactam / 100 / 10 Piperacylina z tazobaktamem µg CLSI Polymixin / Polimyksyna 300 UI CLSI Pristinamycin / Prystynamycyna 15 µg CA-SFM Quinupristin-Dalfopristin 15 µg CLSI Rifampicin / Rifampicyna 5 µg CLSI Rifampicin / Rifampicyna CA-SFM Sparfloxacin / Sparfloksacyna 5 µg CLSI Spectinomycin / 100 µg Wewn Spektynomycyna Spiramycin / Spiramycyna 100 µg Wewn Streptomycin / Streptomycyna 10 µg CLSI Sulfonamides / Sulfonamidy 300 µg CLSI Sulfonamides / Sulfonamidy 200 µg Wewn Teicoplanin / Teikoplanina CLSI Telithromycin / Telitromycyna 15 µg CLSI Temocillin / Temocylina Wewn Tetracycline / Tetracyklina CLSI Ticarcillin / Tikarcylina 75 µg CLSI Ticarcillin + Clavulanic Acid / Tikarcylina z kwasem klawulanowym 75 / 10 µg CLSI Tigecycline / Tygecyklina 15 µg CLSI Tobramycin / Tobramycyna 10 µg CLSI Trimethoprim + sulfamethoxazole / Trimetoprim+sulfametoksazol 1.25/ 23.75µg CLSI Trimethoprim 5 µg CLSI Vancomycin / Wankomycyna CLSI Zakresy wielkości stref zahamowania wzrostu w kontroli wewnętrznej: Gentamycyna 120 µg: E.faecalis (16-23 mm) Streptomycyna 300 µg: E.faecalis (14-20 mm) Gentamycyna 500 µg: S.aureus (30-34 mm); E.faecalis (18-28 mm) Kanamycyna 1 mg: S.aureus ( 14 mm) ); E.faecalis (>14mm) Streptomycyna 500 µg: S.aureus (24-28 mm); E.faecalis (14-25 mm) Metronidazol 4 µg: Clostridium perfringens 13124, Clostridium sporogenes ( 15 mm) Cefoperazon + Sulbaktam 75/: E.coli (24-30 mm) Mupirocyna 200 µg : S. aureus BAA-1708 (6 mm) Temocillin : E. coli (22-28 mm) Szczep wzorcowy Haemophilus influenzae zalecany jest jako dodatkowe narzędzie w kontroli żyzności podłoża HTM. Pomimo braku wiarygodnych kryteriów interpretacji dla oznaczania wrażliwości na niektóre antybiotyki beta-laktamowe metodą dyfuzyjno-krążkową w przypadku S.pneumoniae, jako szczep wzorcowy dla wszystkich paciorkowców zalecany jest szczep Streptococcus pneumoniae Dla szczepu wzorcowego Neisseria gonorrhoeae 49226, zalecanego dla krążka ze spektynomycyną zakres strefy zahamowania wzrostu powinien wynosić mm (CLSI). Jakość krążków z oksacyliną 1 µg najlepiej jest sprawdzać przy pomocy szczepu Staphylococcus aureus 25923, dla którego wielkość strefy zahamowania wzrostu powinna mieścić się w zakresie mm. Zgodnie z zaleceniami EUCAST (wersja V3.1, 2013), aktywność krążków należy systematycznie kontrolować z użyciem następujących szczepów wzorcowych: Escherichia coli Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Streptococcus pneumoniae Enterococcus faecalis Haemophilus influenzae NCTC

7 W tabeli 3 podano akceptowane strefy zahamowania wzrostu w metodzie dyfuzyjno-krążkowej dla wymienionych szczepów referencyjnych. KONTROLA E. coli S. aureus P. aeruginosa S. pneumoniae H. influenzae NCTC 8468 E. faecalis Amoxicillin + Clavulanic Acid 2/1 µg Ampicillin 2 µg Cefotaxime 5 µg Cefoxitin Ceftaroline 5 µg Ceftazidime 10 µg Doripenem 10 µg Gentamicin Linezolid 10 µg Netilmicin 10 µg Nitrofurantoin 100 µg Penicillin 1 IU Piperacillin Piperacillin + Tazobactam 30/6 µg Tobramycin Vancomycin 5 µg KONTROLA PRODUCENTA Odczynniki zostały przygotowane zgodnie z naszym Systemem Jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Odczynniki każdej serii podlegają oznaczeniu kontrolnemu i są dopuszczane do użytkowania, jeśli spełniają wymagane kryteria. Bio-Rad posiada protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii. 11- OGRANICZENIA METODY Określenie kategorii klinicznej szczepu (oporny, średnio-wrażliwy, wrażliwy) często zależy od różnicy 1 milimetra w wielkości strefy zahamowania wzrostu, co odpowiada marginesowi błędu laboratorium. Używane mogą być również inne niż wymienione w Tabeli 2 preparaty przeciwbakteryjne. Wynik testów wrażliwości dla preparatów bez ustalonych zakresów wielkości stref należy interpretować w sposób wyłącznie jakościowy na podstawie obecności lub braku określonej strefy zahamowania wzrostu. Należy notować wielkość każdej strefy. Prawidłowe wykonanie testu wrażliwości zależy nie tylko od aktywności krążków, lecz i od szeregu innych czynników, jak stosowane inokulum, szczepy wzorcowe, właściwe i sprawdzone podłoża, oraz właściwy sposób przechowywania krążków. Ostateczna interpretacja testu wrażliwości, podobnie jak innych testów laboratoryjnych, nie powinna opierać się na pojedynczym wyniku, lecz uwzględniać także dane kliniczne, oraz wyniki testów biochemicznych, cytologicznych i immunologicznych. 12- BIBLIOGRAFIA 1. World Heath Organization Expert Committee on Biological Standardization Technical report series 822. W.H.O., Geneva. 2. CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute Approved standard M2-A11. Performance standards for antimicrobial susceptibility tests, 10th ed. CLSI, Wayne, Pa. 3. CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI document M100-S23. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, 21th informational supplement, Wayne, Pa. 4. CA-SFM: Comité de l antibiogramme French Society of Microbiology. 5. EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST QC Tables V V. Loncle-Provot, E. Keller, M.O. Gourdin, M.L. Garrigues. Etude de la stabilité des Krążków antibiotiques dans les conditions d'utilisation en routine, 18th inter disciplinary meeting on anti-infectious chemotherapy, Paris, Dec.3/ Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /11 7