Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Transkrypt

1 Spis treści Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu WYDZIAŁ MEDYCYNY WETERYNARYJNEJ Krzysztof Grzymajło Charakterystyka funkcjonalna adhezyn FimH fimbrii typu 1 Salmonella enterica serowar Abortus-ovis, Choleraesuis i Dublin Praca doktorska wykonana pod kierunkiem: Prof. dr. hab. Macieja Ugorskiego w Zakładzie Biochemii Katedry Biochemii, Farmakologii i Toksykologii Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu Wrocław

2 Spis treści Niniejszą pracę dedykuję mojej kochanej Żonie Ani i ukochanym Rodzicom 2

3 Spis treści Serdecznie podziękowania składam wszystkim tym, którzy przyczynili się do powstania niniejszej rozprawy doktorskiej. Szczególne podziękowania kieruję do: Prof. dr. hab. Macieja Ugorskiego, za zaproponowanie tematu badań, umożliwienie ich realizacji oraz za pomoc i wsparcie w trakcie prowadzenia pracy badawczej i pisania niniejszej pracy. Prof. dr. hab. Aleksandra F. Sikorskiego, za pomoc w interpretacji wyników powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Dr. hab. inż. Piotra Dobryszyckiego, za pomoc w analizie wyników dichroizmu kołowego Mgr. Tomasza Owczarka, za pomoc w eksperymentach z liniami komórkowymi Koleżankom i Kolegom z Zakładu Biochemii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu, za codzienną życzliwość i wsparcie. 3

4 Spis treści Badania, których wyniki są prezentowane w przedstawionej rozprawie, finansowane były przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego, w ramach projektów nr: 45/2-W/2010/IuventusPlus 18/2W/2006/G oraz współfinansowane ze środków projektu Przedsiębiorczy doktorant inwestycja w innowacyjny rozwój regionu ze środków Unii Europejskiej, Europejskiego Funduszu Społecznego oraz budżetu Województwa Dolnośląskiego w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki. 4

5 Spis treści Spis treści Spis treści... 5 Wykaz stosowanych skrótów Streszczenie Wstęp Wprowadzenie Salmonella Abortus-ovis Salmonella Choleraesuis Salmonella Dublin Czynniki wpływające na proces zakażenia pałeczkami Salmonella enterica Fimbrie Salmonella enterica Fimbrie typu IV Fimbrie curli Fimbrie tworzone na drodze czaperon - błonowe białko przenośnikowe Fimbrie tworzone na drodze alternatywej czaperon błonowe białko przenośnikowe Fimbrie typu 1 Salmonella enterica Biogeneza fimbrii typu Adhezyna FimH Struktura białka FimH Swoistość receptorowa FimH Warianty alleliczne adhezyny FimH Wiązanie adhezyny FimH do cukrowych ligandów w warunkach stresu mechanicznego Czynniki wpływające na tropizm pałeczek Salmonella enterica do określonych gospodarzy Cel pracy Materiały i metody Materiały i aparatura

6 Spis treści Odczynniki chemiczne Enzymy Przeciwciała Bufory i roztwory Gotowe zestawy odczynników Standardy DNA Standardy białek Podłoża mikrobiologiczne (/1L) Podłoża hodowlane i roztwory używane do pracy z komórkami eukariotycznymi Oligonukleotydy Wektory plazmidowe Szczepy bakteryjne Linie komórek eukariotycznych Programy komputerowe Aparatura Metody biologii molekularnej Izolacja genomowego DNA z użyciem zestawu QIAamp DNA Mini Izolacja plazmidowego DNA na małą skalę metodą lizy alkalicznej Trawienie DNA endonukleazami restrykcyjnymi Elektroforeza DNA w żelu agarozowym Izolacja DNA z żelu agarozowego z użyciem zestawu Gel-Out Oznaczanie ilości DNA po rozdziale w żelu agarozowym Spektrofotometryczne oznaczanie ilości DNA Oczyszczanie DNA po jego amplifikacji metodą PCR z użyciem zestawu Clean-Up Ligacja fragmentów DNA Przygotowanie kompetentnych bakterii Escherichia coli metodą z użyciem chlorku rubidu Transformacja bakterii metodą szoku termicznego

7 Spis treści Metoda łańcuchowej reakcji polimeryzacji (PCR) Hybrydyzacja DNA Sekwencjonowanie DNA Otrzymywanie rekombinowanych białek Ekspresja i izolacja rekombinowanych białek Oczyszczanie rekombinowanych białek metodą chromatografii powinowactwa na złożu Ni-NTA agaroza Otrzymywanie neoglikokoniugatu Man-BSA metodą syntezy wysokotemperaturowej [Kanska i wsp., 2008] Oznaczanie białka metodą bicynchoninową z użyciem zestawu Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS (SDS- PAGE) Western bloting Far-western bloting Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) Dichroizm kołowy Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) Stosowane bufory Immobilizacja ligandów na płytce CM Wyznaczanie stałych asocjacji i dysocjacji Regeneracja powierzchni biosensora Metody pracy z komórkami eukariotycznymi Linie komórkowe i warunki hodowli Otrzymywanie monoklonalnych przeciwciał 9E Rozmrażanie i zamrażanie komórek Otrzymywanie lizatów komórkowych Otrzymywanie lizatów z nabłonka jelita cienkiego Wyniki Otrzymanie wektorów plazmidowych zawierających geny fimh pałeczek Salmonella Abortus-ovis, Salmonella Choleraesuis i Salmonella Dublin

8 Spis treści 4.2. Utworzenie wektorów ekspresyjnych kodujących adhezyny FimH Salmonella Abortus-ovis, Salmonella Choleraesuis, Salmonella Dublin oraz Salmonella Gallinarum z N-końcowym wyrostkiem białka FimF Ekspresja rekombinowanych białek scfimh w komórkach Escherichia coli BL21(DE3) LysS Charakterystyka molekularna białek scfimh Salmonella Aborusovis, Salmonella Choleraesuis i Salmonella Dublin Analiza białek AscFimH, CscFimH i DscFimH metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) Analiza struktury drugorzędowej białek AscFimH, CscFimH i DscFimH metodą dichroizmu kołowego Charakterystyka funkcjonalna białek scfimh Salmonella Abortus-ovis, Salmonella Choleraesuis i Salmonella Dublin Wiązanie białek AscFimH, CscFimH i DscFimH do RNazy B, peroksydazy chrzanowej i Man-BSA analizowane metodą Far-western bloting Wiązanie białek AscFimH, CscFimH i DscFimH do RNazy B, peroksydazy chrzanowej i Man-BSA a nalizowane metodą SPR Wiązanie białek AscFimH, CscFimH i DscFimH do glikoprotein enterocytów reprezentowanych przez ustalone in vitro linie komórkowe owcy, świni i cielęcia analizowane metodą Far-western bloting Wiązanie białek EscFimH i GscFimH do glikoprotein enterocytów reprezentowanych przez ustalone in vitro linie komórkowe owcy, świni i cielęcia analizowane metodą Far-western bloting Analiza oddziaływań białek AscFimH, CscFimH i DscFimH z białkami blony śluzowej jelita cienkiego owiec, krów i świń

9 Analiza oddziaływań białek EscFimH i GscFimH z białkami błony śluzowej jelita cienkiego owiec, krów i świń Dyskusja Wnioski Bibliografia Materiały uzupełniające

10 Wykaz stosowanych skrótów Wykaz stosowanych skrótów Asn Asp BCIP BIA BSA C-HEGA DMF DMSO dntp DSC DSE EDTA Gln HA HR Ile IPTG kda kpz Ld NBT NTA Nte PCR Pd Phe PMSF pz RNaza B scfimh SDS SDS-PAGE SPI TEMED N, N, N, N TRIS Tyr UR Asparagina Kwas asparaginowy 5-bromo-4-chloro-3-indoilofosforan analiza oddziaływań międzycząsteczkowych (ang. Biomolecular Interaction Analysis) albumina surowicy bydlęcej cykloheksylobutanoilo-n-hydroksyetylo-d-glukaimid dimetyloformamid sulfotlenek dimetylu trifosforan deoksyrybonukleozydu Utworzenie kompletnej struktury domeny immunoglobulinowej (ang. Donor Strand Complementation) Wymiana N-końcowych wyrostków (ang. DSE - Donor Strand Exchange) etylenodiaminotetraoctan Glutamina Zaadoptowany do gospodarza (ang. Host adapted) Ograniczony pod względem gospodarza (ang. Host restricted) Izoleucyna izopropylotiogalaktopiranozyd kilodalton Tysiąc par zasad (kilo par zasad) Domena lektynowa (ang. Lectin domain) błękit nitrotetrazolowy kwas nitrylotrójoctowy N-końcowe wydłużenie (ang. N-terminal extension) łańcuchowa reakcja polimeryzacji Domena pilinowa (ang. Pilin domain) Fenyloalanina fluorek fenylometylosulfonowy Par zasad rybonukleaza B (ang. self complemented FimH) sól sodowa siarczanu dodecylu elektroforeza w żelu poliakryloamidowym w warunkach denaturujących wyspy patogenności Salmonella (ang. Salmonella Pathogenicity Island) N, N, N, N tetraetylometylenodiamina Tris-(hydroksymetylo)- aminoetan Tyrozyna Nieograniczony co do gospodarza (ang. Un-restricted) 10

11 Streszczenie Streszczenie Jednym z pierwszych i zarazem krytycznych momentów w zakażeniach pałeczkami Salmonella jest proces adhezji bakterii do komórek nabłonkowych wyściełających światło jelita gospodarza. Umożliwia on zakotwiczenie bakterii do ścian jelita, tym samym zapobiegając naturalnym, mechanicznym procesom usuwania ich z przewodu pokarmowego. Dowiedziono, że w przypadku pałeczek Salmonella ważną rolę w tym procesie odgrywają fimbrie typu 1, odpowiadające za wiązanie się komórek bakteryjnych do powierzchniowych glikoprotein z łańcuchami cukrowymi typu bogatego w mannozę. Bezpośrednią rolę w wiązaniu ligandów cukrowych odgrywają białka o charakterze lektyn, znajdujące się na szczycie fimbrii typu 1, noszące nazwę adhezyn FimH. Sekwencje genu fimh pochodzącego z różnych serowarów Salmonella wykazują bardzo wysoki stopień homologii (96-99%) w sekwencji aminokwasowej. Tym niemniej istniejące dowody doświadczalne wskazują, że te niewielkie różnice w składzie aminokwasowym adhezyn FimH mogą być odpowiedzialne za specyficzne dla danego serowaru właściwości adhezyjne, wpływając zarówno na siłę, jak i swoistość wiązania do określonych glikoprotein obecnych na powierzchni komórek eukariotycznych. To zaś w konsekwencji może decydować o tropizmie różnych serowarów Salmonella wobec określonych gospodarzy. W niniejszej pracy skupiono się na charakterystyce funkcjonalnej adhezyn FimH trzech serowarów Salmonella enterica: Abortus-ovis, Choleraesuis i Dublin. Ze względu na fakt, że każdy z tych serowarów wykazuje wyraźny tropizm wobec określonego gatunku zwierząt (Salmonella Abortus-ovis owce, Salmonella Choleraesuis świnie, Salmonella Dublin cielęta) praca ta podejmuje tematykę wpływu pojedynczych mutacji w białku FimH na procesy adhezyjne związane z rozpoznawaniem i wiązaniem się pałeczek Salmonella do komórek określonego gospodarza. 11

12 Streszczenie Do badań nad właściwościami białek FimH wykorzystano rekombinowane adhezyny, otrzymywane jako białka fuzyjne, zawierające dodatkowo N-końcowy fragment białka FimF. Taka modyfikacja pozwala na utworzenie białka FimH z zasłoniętym rdzeniem hydrofobowym, zapobiegając łączeniu się cząsteczek adhezyn między sobą. Oczyszczone na kolumnie powinowactwa Ni-NTA agaroza białka FimH występowaly jedynie w formie monomerycznej, w stopniu czystości przekraczającym 95%. Za pomocą dichroizmu kołowego stwierdzono właściwą biologicznie strukturę rekombinowanych białek. Charakterystykę funkcjonalną rekombinowanych białek FimH przeprowadzono z wykorzystaniem modelowych glikoprotein: RNazy B, peroksydazy chrzanowej, oraz Man-BSA, które to posiadają na swojej powierzchni różne strukturalnie łańcuchy cukrowe typu bogatego w mannozę. Analiza metodą far-western bloting wykazała, że wszystkie trzy adhezyny wiążą się do badanych glikoprotein, a wiązanie to jest mannozo-swoiste. Dalsze badania białek metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) pozwoliły określić powinowactwo adhezyn do modelowych glikoprotein. Dla wszystkich trzech adhezyn wyznaczono wysokie powinowactwo do RNazyB oraz peroksydazy chrzanowej (stała dysocjacji KD rzędu nm) oraz około 10-krotnie niższe powinowactwo do Man-BSA (KD w zakresie nm). Aby odpowiedzieć na pytanie, czy izolowana adhezyna ma zdolność rozpoznawania specyficznych ligandów prezentowanych na komórkach ich naturalnych gospodarzy, analizowano ich wiązanie do lizatów komórkowych za pomocą testu far-western-bloting. W pierwszym etapie analizowano wiązanie adhezyn do lizatów białkowych otrzymanych z ustalonych in vitro linii komórek nabłonka jelitowego owcy, świni i cieląt. Stwierdzono, że każda z adhezyn wiąże się do glikoprotein wszystkich rodzajów analizowanych komórek, ale wiązanie to jest komórkowospecyficzne. W przypadku każdej z analizowanych adhezyn, najsilniej wiązanym ligandem była glikoproteina o masie około 55 kda, występująca w każdej linii komórkowej. 12

13 Streszczenie Co ciekawe, w przypadku adhezyny FimH pochodzącej z Salmonella Enteritidis, serowaru zdolnego do zakażenia szerokiego spektrum gospodarzy, profil wiązania do analizowanych lizatów linii komórkowych był zupełnie inny i obejmował głównie białka o wysokiej masie cząsteczkowej, przekraczającej 100 kda. W dalszym etapie pracy wykazano, że różnice w profilach wiązania białek pochodzących z serowarów ograniczonych co do gospodarza i nieograniczonych pod względem gospodarza wykryte dla ustalonych in vitro linii komórowych, występują również w przypadku analizy oddziaływań z lizatami komórek nabłonka jelita izolowanymi bezpośrednio od owiec, świń i cieląt. Uzyskane wyniki wskazują, że białko FimH znajdujące się na szczycie fimbrii typu 1 może mieć wpływ na proces tropizmu do określonego gospodarza, z uwagi na zdolność do rozpoznawania specyficznych glikoprotein ligandów eksponowanych na komórkach nabłonka jelita. Za wcześnie jednak by stwierdzić, czy zmiany te przekładają się na rzeczywiste różnice w przebiegu zakażenia. Potrzeba zatem dalszych badań, które pozwolą określić role fimbrii w specyficzności dla gospodarza. 13

14 1. Wstęp 1. Wstęp 1.1. Wprowadzenie Opisana po raz pierwszy w 1880 roku przez Eberth a i wyhodowana w warunkach laboratoryjnych w 1884 roku przez Gaggky ego [Burrows, 1959] Salmonella to Gram-ujemna pałeczka należąca do rodziny Enterobacteriaceae. W obrębie rodzaju Salmonella wyróżnia się obecnie dwa gatunki: enterica i bongori. Gatunek Salmonella enterica, warunkowy enteropatogen, jest aktualnie dzielony na ponad 2500 różnych serowarów, spośród których jedynie około 50 uważanych jest za patogeny zdolne do zakażania ludzi i/lub zwierząt [Uzzau i wsp., 2000]. Wśród chorobotwórczych serowarów Salmonella enterica, większość wywołuje zatrucia pokarmowe - infekcje charakteryzujące się krótkim czasem inkubacji i objawami ograniczającymi się głównie do przewodu pokarmowego. Natomiast kilka serowarów Salmonella enterica wywołuje tzw. gorączki durowe, w których dochodzi do uogólnionego zakażenia. Gorączki durowe prowadzące do posocznicy czy też poronień, wywoływane są głównie przez serowary zdolne do zakażania jednego, bądź tylko kilku gatunków gospodarzy [Pardon i wsp., 1988, Rice i wsp., 1997, Schwartz, 1991]. Zdecydowanie mniej groźne i mniej dotkliwe zakażenia powodujące zatrucia pokarmowe wywoływane są zaś głównie przez serowary zdolne do zasiedlania wielu gatunków gospodarzy. Pierwotnie, serowary Salmonella enterica zdolne do zakażania wyłącznie jednego gatunku, takie jak Salmonella Typhi, Salmonella Gallinarum i Salmonella Abortus-ovis infekujące odpowiednio ludzi [Edsall i wsp., 1960], drób grzebiący [Barrow i wsp., 1994] i owce [Pardon i wsp., 1988], określane zostały mianem serowarów zaadoptowanych do gospodarza [ang. host-adapted (HA)]. Później, do serowarów HA zaliczono również pałeczki Salmonella zdolne do zakażania w nielicznych przypadkach więcej niż jednego gospodarza. Dla przykładu, serowary Choleraesuis i Dublin, wywołujące uogólnioną postać zakażenia 14

15 1. Wstęp odpowiednio u świń i cieląt, w rzadkich przypadkach mogą także zakażać innych gospodarzy [Nnalue, 1991, Smith i Jones, 1967, Wray i Sojka, 1977]. Stąd, w celu uściślenia funkcjonującego w literaturze nazewnictwa, Uzzau i wsp [2000] zaproponowali zmodyfikowany podział serowarów Salmonella enterica, co do ich zdolności do zasiedlania różnych gospodarzy. Serowary zdolne do zakażenie tylko jednego gospodarza określone zostały jako ograniczone pod względem gospodarza [ang. hostrestricted (HR)]. Serowary zakażające głównie jeden gatunek, zdolne jednak do wywołania zakażenia u innych gospodarzy określono jako zaadoptowane do gospodarza [ang. host-adapted (HA)]. Z kolei, serowary takie jak Salmonella Enteritidis czy Salmonella Typhimurium, wywołujące zatrucia pokarmowe u różnych gatunków nazwano nieograniczone pod względem gospodarza [ang. un-restricted (UR)]. Pierwszym etapem w zakażeniu pałeczkami Salmonella jest ich adhezja do nabłonka jelitowego, co znacząco utrudnia mechaniczne usunięcie bakterii ze światła jelita, warunkując ich przetrwanie w obcym środowisku i skuteczne namnażanie, w konsekwencji umożliwiając dalsze etapy inwazji [Beachey, 1981, Krajewska-Pietrasik D., 1993]. Proces wiązania się bakterii do komórek gospodarza zależny jest od ekspresjonowanych na powierzchni komórek bakteryjnych adhezyn, do których należą również białka o charakterze lektyn, rozpoznające łańcuchy cukrowe glikokoniugatów (glikoprotein i glikolipidów) znajdujących się na powierzchni komórek gospodarza [Klemm i Schembri, 2000, Soto i Hultgren, 1999]. Obecność adhezyn na komórkach bakteryjnych umożliwia nie tylko przyłączenie się patogenu do komórki gospodarza, ale nierzadko decyduje również o jego tropizmie do konkretnej tkanki czy konkretnego gatunku gospodarza ekspresjonujących określone ligandy [Edwards i wsp., 2002, Uzzau i wsp., 2000]. Jednymi z najlepiej poznanych organelli pośredniczących w adhezji pałeczek Salmonella do komórek eukariotycznych są fimbrie typu 1. Te długie, włókienkowate organella zbudowane są głównie z białka FimA, jednakże zdolność do wiązania glikoprotein zawierających łańcuchy cukrowe typu bogatego w mannozę zależna jest od znajdującej się na szczycie fimbrii adhezyny 15

16 1. Wstęp FimH. Szereg dowodów opartych zarówno na doświadczeniach in vitro jak i in vivo wskazuje, że fimbrie typu 1 są dla pałeczek Salmonella istotnym czynnikiem wirulencji [Humphries i wsp., 2001, Muller i wsp., 1991, Ugorski i wsp., 2011]. Co więcej, postuluje się, że niewielkie zmiany w strukturze adhezyn FimH mogą być odpowiedzialne za powinowactwo do określonych ligandów, w konsekwencji decydując o tropizmie poszczególnych serowarów Salmonella do określonej tkanki czy nawet określonego gospodarza [Guo i wsp., 2009, Uzzau i wsp., 2000]. Salmonella enterica jest obecnie jednym z najintensywniej badanych gatunków bakterii pod kątem jej biologii, genetyki, budowy, jak i patogenezy [Porwollik, 2011]. Jest również jednym z najlepiej scharakteryzowanych, obok Escherichia coli, bakteryjnych enteropatogenów. Pomimo tego, wiedza dotycząca wzajemnych relacji pomiędzy pałeczkami Salmonella a organizmem gospodarza ciągle jest bardzo ograniczona i dopiero zaczynamy poznawać molekularne podstawy interakcji tych bakterii z komórkami gospodarzy Salmonella Abortus-ovis Należąca do serowarów HR Salmonella Abortus-ovis jest jednym z głównych czynników powodujących poronienia u owiec w Europie i wschodniej Azji [Jack, 1968, Uzzau i wsp., 2001]. Obok poronień, typowym objawem obserwowanym w stadach owiec zakażonych tymi pałeczkami jest wyraźnie podwyższona śmiertelność wśród jagniąt. Natomiast dorosłe owce zakażone pałeczkami Salmonella Abortus-ovis nie wykazują, poza poronieniami, innych objawów chorobowych. Pałeczki Salmonella Abortus-ovis, które przedostały się do jelita cienkiego, jak już wspomniano powyżej (rozdz. 1.1), wywołują chorobę systemową w wyniku przekroczenia bariery jelitowej i dostania się do krwiobiegu. Badania nad mechanizmami patogenezy Salmonella Abortusovis wykazały, że u myszy, którym podano bakterie per os, ich adhezja do komórek M kępek Peyera jest dużo niższa niż w przypadku Salmonella 16

17 1. Wstęp Typhimurium [Rubino i wsp., 1993, Rubino i wsp., 1993a]. Stąd sugeruje się, że adaptacja pałeczek Salmonella Abortus-ovis do określonego gospodarza może być spowodowana utratą genów odpowiedzialnych za kolonizację przewodu pokarmowego dorosłych osobników, skutkując ich zwiększonym przenikaniem do krwi jagniąt i ciężarnych samic. Przejściowe zasiedlanie przez te pałeczki jelita cienkiego oraz układu siateczkowośródbłonkowego innych narządów, zmienia się w trakcie ciąży w intensywną kolonizację narządów płodu stymulowaną przez płodowe kępki Peyera [Lantier i wsp., 1981, Rubino i wsp., 1993], które obok łożyska, są głównymi ośrodkami namnażania bakterii [Jack, 1968] Salmonella Choleraesuis W ciągu ostatnich 20 lat zakażenia pałeczkami Salmonella Choleraesuis w Europie utrzymują się na stosunkowo niskim poziomie, podczas gdy na terenie Stanów Zjednoczonych ten serowar jest odpowiedzialny za większość przypadków salmonellozy u świń i naraża tamtejsze rolnictwo na straty sięgające 100 milionów dolarów rocznie [Foley, 2007, Gray i wsp., 1996]. Salmonella Choleraesuis jest enteropatogenem należącym do serowarów HA, w 99% przypadków zakażeń powodującym ostrą, systemową salmonellozę, głównie u młodych, 2-4 miesięcznych świń. Zwierzęta zakażone tym serowarem wykazują takie objawy kliniczne, jak wysoka gorączka i osowiałość już po upływie 36 do 48 godzin od zakażenia, siejąc od 10 3 do 10 6 CFU na gram kału w szczytowym punkcie choroby [Gray i wsp., 1995, Roof i wsp., 1992]. Wykazano, że do zakażeń Salmonella Choleraesuis dochodzi głównie drogą pokarmową lub oddechową [Anderson i wsp., 1998, Srinand i wsp., 1995]. Kolonizacja jelita cienkiego przez te pałeczki nie powoduje zazwyczaj biegunki, prowadzi zaś do uogólnienia choroby i posocznicy, analogicznie jak w przypadku zakażeń serowarem Typhimurim u myszy [Mills i Finlay, 1994, Moriguchi i wsp., 1991, Schwartz, 1991]. Podczas zakażenia, 17

18 1. Wstęp obserwuje się adhezję pałeczek Salmonella Choleraesuis do enterocytów kosmków jelitowych i komórek M występujących w kępkach Peyera [Saier i wsp., 1996], a także obserwuje się ich obecność w makrofagach błony śluzowej jelita jak i węzłach chłonnych [Saier i wsp., 1996]. Zakażenia ludzi wywołane przez Salmonella Choleraesuis, choć rzadkie, mogą również powodować posocznicę, głównie u osób osłabionych infekcjami innych patogenów [Huang i Lo, 1967] Salmonella Dublin Salmonella Dublin, enteropatogen należący do typu HA, zakaża głównie bydło. Pałeczka ta wywołuje zarówno zatrucia pokarmowe jak i uogólnioną postać choroby tak u młodych jak i starych osobników. Zakażenia charakteryzują się wysoką gorączką, brakiem apetytu, nagłym obniżeniem wydajności mlecznej, ostrą biegunką, poronieniami u ciężarnych krów i często kończą się śmiercią [Richards.A, 1973, Sojka i wsp., 1974]. Badania nad molekularnymi podstawami zakażeń tym serowarem [ElGedaily i wsp., 1997, Galyov i wsp., 1997, Grob i Guiney, 1996, Libby i wsp., 1997] wskazują na istotną rolę genów zlokalizowanych na plazmidzie wirulencji (spv), do których nadekspresji dochodzi w trakcie wnikania bakterii do komórek eukariotycznych [Chen i wsp., 1995]. Geny spv są niezbędne do przetrwania i replikacji bakterii w cielęcych monocytach [Guilloteau i wsp., 1996, Libby i wsp., 1997]. Eksperymentalne zakażenia cieląt pałeczkami Salmonella Dublin wykazały, że geny wirulencji są niezbędne do powstania uogólnionej postaci salmonellozy, natomiast nie wpływają one na kolonizację jelita cienkiego, adhezję do kępek Peyera i wywoływanie biegunki [Heffernan i wsp., 1987, Wallis i wsp., 1995]. Kiedy porównywano oddziaływania pałeczek Salmonella Dublin, reprezentujących serowary HA, i Salmonella Typhimurium, należącymi do serowarów UR, z jelitem cielęcym, nie stwierdzono między nimi istotnych różnic [Watson i wsp., 2000, Watson i wsp., 2000a]. Zakażenia ludzi wywołane przez Salmonella Dublin 18

19 1. Wstęp dotykają zwłaszcza osobników z osłabioną odpornością. Mogą one przybierać formę ostrej biegunki, lub częściej, uogólnionej postaci choroby [Fang i Fierer, 1991, Taylor i wsp., 1982, Werner i wsp., 1979] Czynniki wpływające na proces zakażenia pałeczkami Salmonella enterica Serowary Salmonella enterica, tak jak wiele innych bakteryjnych patogenów, posiadają cały szereg czynników warunkujących ich wirulentność, które, jako tzw. wyspy patogenności, pozyskiwane są często przez bakterie w wyniku horyzontalnego transferu genów [Groisman i Ochman, 1996, Hensel, 2004]. Pozwala to przejmować czynniki wirulencji od innych gatunków, co umożliwia szybką i skokową ewolucję patogenów [Groisman i Ochman, 1996]. Mimo, iż wyspy patogenności różnią się strukturą i funkcją, mają one również charakterystyczne cechy wspólne. I tak, każda z wysp patogenności reprezentuje odrębne, duże fragmenty chromosomów, na których znajdują się geny kodujące czynniki wirulencji. Wyspy patogenności charakteryzują się dużą niestabilnością genetyczną spowodowaną obecnością w ich obrębie sekwencji związanych z rearanżacjami DNA, takich jak geny integrazy, transpozazy, sekwencje inercyjne czy geny bakteriofagowe [Hensel, 2004]. Jak dotąd, u Salmonella enterica, stwierdzono obecność dziewiętnastu wysp patogenności, oznaczonych jako SPI-1 do SPI-19 (Salmonella Pathogenicity Island 1-19) [Blondel i wsp., 2010]. Pierwszych pięć uznaje się za podstawowe, konserwatywne dla całego gatunku Salmonella enterica, pozostałe zaś są specyficzne dla konkretnych serowarów. Najbardziej konserwatywną, a jednocześnie najlepiej scharakteryzowaną wyspą patogenności jest SPI-1, zajmująca region około 40 kpz, na której zlokalizowane są geny kodujące białka związane z aparatem sekrecyjnym typu 3 [Galan, 2001]. Geny SPI-1 odpowiedzialne 19

20 1. Wstęp są za pierwsze etapy inwazji komórek niefagocytujących oraz za indukcję procesów zapalnych w jelicie cienkim [Wallis i Galyov, 2000]. Za dalsze procesy zapalne, przeżywanie w makrofagach i powstanie uogólnionej postaci zakażenia odpowiedzialne są geny położone na SPI-2, liczącej również 40 kpz [Hensel i wsp., 1999, van der Velden i wsp., 2000]. Wyspa SPI-3, zespół genów o wielkości 17 kpz, jest odpowiedzialna za pobór jonów magnezowych w siedliskach utrudniających bakteriom odżywianie, pozwalając zasiedlać kolejne odcinki przewodu pokarmowego. Rola składającego się z 27 kpz regionu opisywanego jako SPI-4 nadal pozostaje niejasna, niemniej jednak stwierdzono jego udział w długotrwałych infekcjach Salmonella enterica [Lawley i wsp., 2006]. W jego obrębie kodowane są również niefimbrialne białka adhezyjne pośredniczące w wiązaniu pałeczek Salmonella do komórek nabłonkowych [Gerlach i wsp., 2007]. Natomiast wyspa SPI-5 koduje białka efektorowe dla SPI-1 i SPI-2 [Hensel, 2004], wpływając na powstanie odczynu zapalnego w wyniku infekcji bakteryjnej. Pozostałe wyspy patogenności, od SPI-6 do SPI-19, zawarte w genomach jedynie określonych serowarów Salmonella enterica, łączy się ze swoistym dla danego serowaru zachowaniem w trakcie przebiegu zakażenia i tropizmem do specyficznego gospodarza/gospodarzy [Gerlach i wsp., 2007, Hensel, 2004, Wallis i Galyov, 2000]. Poza wyspami patogenności w genomie Salmonella enterica znajdują się również inne sekwencje mające wpływ na wirulentność tych pałeczek, w tym regiony kodujące fimbrie. Do dziś stwierdzono obecność od 13 [Edwards i wsp., 2002, Humphries i wsp., 2001, Ibarra i Steele-Mortimer, 2009] do 17 operonów fimbrialnych [van Asten i van Dijk, 2005], wykazując ekspresję na poziomie białka co najmniej jedenastu spośród nich [Humphries i wsp., 2003]. Liczba ta, uwzględniając możliwe kombinacje występujące w różnych serowarach, wyposaża bakterie w szereg narzędzi służących do wiązania się pałeczek Salmonella do różnych typów tkanek, również w postaci biofilmów [Humphries i wsp., 2003, Humphries i wsp., 2001]. 20

21 1. Wstęp Uważa się, że geny należące do SPI, plazmidy wirulencji, a także operony fimbrialne mogą wspólnie determinować specyficzność zasiedlania gospodarzy przez poszczególne serowary Salmonella Fimbrie Salmonella enterica Termin fimbrie, którym określa się długie, włókienkowate organella odpowiadające za adhezję bakterii do komórek gospodarza, został wprowadzony w roku 1955 przez Duguida i wsp. [1955]. Od tego czasu różne rodzaje fimbrii zostały zidentyfikowane u wielu gatunków bakterii, tak Gram-ujemnych jak i Gram-dodatnich. Dzięki intensywnym badaniom nad biosyntezą tych organelli, początkowe podziały oparte na cechach morfologicznych, serologicznych czy funkcjonalnych, zastąpiono nomenklaturą opartą na molekularnych mechanizmach tworzenia fimbrii przez komórkę bakteryjną. W przypadku pałeczek Salmonella enterica można wyróżnić cztery główne typy fimbrii: fimbrie typu IV [Alm i Mattick, 1997, Mattick, 2002, Nudleman i Kaiser, 2004], fimbrie curli [Hammar i wsp., 1996], fimbrie tworzone na drodze czaperon błonowe białko przenośnikowe (usher) [Piatek i wsp., 2005, Sauer i wsp., 2004, Vetsch i wsp., 2006], oraz fimbrie tworzone na alternatywnej drodze czaperon błonowe białko przenośnikowe (usher) [Sakellaris i Scott, 1998] Fimbrie typu IV Obecne u wielu gatunków bakterii, zarówno Gram-ujemnych [Craig i Li, 2008] jak również Gram-dodatnich [Rakotoarivonina i wsp., 2002, Varga i wsp., 2006], fimbrie typu IV zostały po raz pierwszy opisane w roku 1975 [Ottow, 1975]. Morfologicznie, są to elastyczne, włókienkowate organella, o przekroju od 6 do 8 nm i kilku mikrometrach długości, często agregujące w charakterystyczne wiązki. Poza funkcjami pełnionymi przez inne typy fimbrii, jak adhezja bakterii do komórek gospodarza, czy udział w tworzeniu biofilmów, fimbrie typu IV posiadają 21

22 1. Wstęp wiele unikatowych cech, jak wiązanie DNA podczas transformacji i transdukcji, czy udział w niezależnym od wici ruchu [Mattick, 2002]. Fimbrie typu IV to zazwyczaj homopolimery zbudowane z cząsteczek białka strukturalnego o masie od 15 do 20 kda i w niektórych przypadkach adhezyny znajdującej się na szczycie fimbrii [Craig i Li, 2008]. W odróżnieniu od pozostałych typów fimbrii, biogeneza fimbrii typu IV angażuje co najmniej 12 białek charakteryzujących się wysoką konserwatywnością pomiędzy różnymi gatunkami bakterii. Sam mechanizm biogenezy wciąż jednak jest słabo poznany Fimbrie curli Opisane po raz pierwszy w roku 1989 fimbrie curli obecne są na powierzchni pałeczek jelitowych [Olsen i wsp., 1989]. Głównym elementem składowym tych fimbrii jest białko CsgA, którego budowa, niepodobna do innych strukturalnych białek fimbrialnych, ma sporo wspólnych właściwości biochemicznych i strukturalnych z eukariotycznymi włóknami amyloidowymi, tworzącymi się np. u pacjentów z chorobą Alzheimera czy Parkinsona [Chapman i wsp., 2002]. Fimbrie curli zaangażowane są w kilka procesów biologicznych, m.in. w tworzenie biofilmów, agregację bakterii, adhezję i wczesne etapy inwazji. Uważa się, że proces tworzenia tych fimbrii iv vivo zachodzi głównie w temperaturze 30 C [Olsen i wsp., 1989], choć inne źródła podają, że ekspresja w 37 C jest również możliwa [Kikuchi i wsp., 2005]. Mimo, że uważa się fimbrie curli za zdolne do wiązania co najmniej kilku rodzajów białek eksponowanych na komórkach gospodarza, nie mają one jak do tej pory jasno określonej roli w patogenezie zakażeń pałeczkami jelitowymi. 22

23 1. Wstęp Fimbrie tworzone na drodze czaperon - błonowe białko przenośnikowe Geny wchodzące w skład operonów fimbrii tworzonych na drodze czaperon błonowe białko przenośnikowe kodują co najmniej trzy różne białka: główne białko strukturalne fimbrii, czaperon oraz błonowe białko przenośnikowe (usher). Często w skład operonu wchodzą również geny kodujące znajdujące się na szczycie fimbrii białko adhezyjne oraz dodatkowe białka szlaku biogenezy. Wszystkie białka strukturalne fimbrii należących do tej grupy posiadają na N-końcu sekwencję sygnałową, umożliwiającą transport przez błonę cytoplazmatyczną z wykorzystaniem głównego mechanizmu sekrecji SEC [Manting i Driessen, 2000, Pugsley, 1993]. Aby zapobiec przedwczesnemu tworzeniu fimbrii, po przejściu przez wewnętrzną błonę cytoplazmatyczną poszczególne podjednostki łączą się ze specyficznym czaperonem. Kompleks pilina-czaperon jest następnie dostarczany do zlokalizowanego w zewnętrznej błonie cytoplazmatycznej błonowego białka przenośnikowego, które służy jako platforma do budowy fimbrii. Białko to tworzy kanał, który umożliwia przenoszenie poszczególnych białek tworzących fimbrie na powierzchnię bakterii, uniemożliwiając równocześnie przejście spolimeryzowanej fimbrii. Najintensywniej badanymi i jednocześnie najlepiej scharakteryzowanymi spośród omawianej grupy są fimbrie typu 1, występujące powszechnie w obrębie rodziny Enterobacteriacea (rozdz. 1.7) Fimbrie tworzone na drodze alternatywej czaperon - błonowe białko przenośnikowe W przypadku gatunku Salmonella enterica, fimbrie tworzone na alternatywnej drodze czaperon błonowe białko przenośnikowe są stosunkowo słabo poznane. Najintensywniej badanym pozostaje w chwili obecnej operon tcf Salmonella Typhi, którego fimbrialny produkt odpowiedzialny jest za kolonizację tkanek gospodarza oraz adaptację tylko do jednego gospodarza, którym jest człowiek [Bronowski i Winstanley, 23

24 1. Wstęp 2009, Townsend i wsp., 2001]. Wykazuje on bardzo wysoką homologię do występującego u enterotoksycznej Escherichia coli operonu coo, kodującego fimbrie CS1 (lub α-fimbrie) [Townsend i wsp., 2001]. W proces biogenezy omawianych fimbrii zaangażowane są jedynie cztery białka. Dwa z nich, główne białko strukturalne CooA o masie czasteczkowej 15,2 kda oraz białko CooD o masie cząsteczkowej 38 kda, znajdujące się na szczycie fimbrii, tworzą α fimbrie. Pozostałe dwa, czaperon CooB oraz błonowe białko przenośnikowe CooC nie wchodzą bezpośrednio w skład fimbrii, ale biorą udział w procesie ich biogenezy [Starks i wsp., 2006] Fimbrie typu 1 Salmonella enterica Ogólna struktura fimbrii typu 1 została podana już w roku 1969 [Novotny C, 1969], dzięki wykorzystaniu mikroskopu elektronowego i krystalografii. Późniejsze badania wykazały, że kodowane przez operon fim organella tworzą strukturę sztywnego, pustego w środku helikalnego włókna o średnicy 6-9 nm i długości od 1 do 2 mikrometrów [Hahn i wsp., 2002]. Głównym elementem tworzącym fimbrie typu 1 jest białko strukturalne FimA, występujące w liczbie od 500 do 3000 kopii na każde włókienko fimbrii. Poszczególne cząsteczki białka FimA ułożone są w prawoskrętną helisę, w której na jeden skręt przypada około 3,4 cząsteczek tego białka [Hahn i wsp., 2002] [Ryc. 1]. Białka FimA występujące u poszczególnych przedstawicieli Enterobacteriaceae cechują się wysoką heterogennością zarówno strukturalną (masa cząsteczkowa w zależności od gatunku waha się od 14 do 22 kda) jak i antygenową [Ghosh i wsp., 1994, Marc i Dho-Moulin, 1996, Muller i wsp., 1991, Orndorff i Falkow, 1985], natomiast w obrębie gatunku Salmonella enterica homologia sekwencji białka FimA jest bardzo wysoka i waha się od 96 do 99% [Rossolini i wsp., 1993, Swenson i wsp., 1991]. Tworzony przez białko FimA trzon fimbrii uzupełniony jest przez adhezynę FimH. Przyłączona jest ona do szczytu fimbrii za pośrednictwem białka FimF [Hahn i wsp., 2002, Le Trong i wsp., 2010]. Przez długi czas 24

25 1. Wstęp postulowana była także obecność białka FimH poza szczytem fimbrii, wbudowanego w jej trzon [Abraham i wsp., 1988], jednakże dalsze badania z użyciem mikroskopu elektronowego [Hahn i wsp., 2002] podważyły te sugestie. Białko adhezyjne FimH odpowiada bezpośrednio za rozpoznawanie i wiązanie oligomannozowych struktur glikoprotein wytwarzanych przez komórki gospodarza [Firon i wsp., 1984, 1983]. Podobnie jak w przypadku piliny FimA, również adhezyny FimH wytwarzane przez różne serowary Salmonella enterica charakteryzują się wysoką, sięgającą 98-99% homologią sekwencji aminokwasowych [Kisiela i wsp., 2005]. Ryc. 1. Schemat budowy fimbrii typu 1 Salmonella enterica. 25

26 1. Wstęp Biogeneza fimbrii typu 1 Fimbrie typu 1 tworzone są na drodze biogenezy wykorzystującej białko czaperonowe i błonowe białko przenośnikowe (ang. chaperon-usher). W tym szlaku, poszczególne jednostki białkowe tworzące fimbrie transportowane są z cytoplazmy do periplazmy przy udziale głównego mechanizmu sekrecji SEC. Tam łączą się one z czaperonem FimC tworząc stabilne kompleksy, które następnie rozpoznawane są przez błonowe białko przenośnikowe (usher) - FimD. Czaperon FimC stabilizuje białka fimbrialne, przyspieszając proces ich fałdowania i zapobiegając zbyt wczesnej ich polimeryzacji jeszcze w periplazmie [Barnhart i wsp., 2000, Vetsch i wsp., 2004]. Kompleksy białka FimC z białkami fimbrialnymi wychwytywane są następnie przez białko FimD, zapewniające łączenie się białek fimbrialnych w odpowiedniej kolejności, zaczynając od adhezyny FimH, a kończąc na kolejnych cząsteczkach białka FimA. Białko FimD, tworzące hydrofobowy kanał, umożliwia również wydostawanie się białek fimbrialnych na powierzchnię komórki bakteryjnej [Remaut i wsp., 2006, Remaut i wsp., 2008, Vetsch i wsp., 2006] [Ryc. 2]. W biogenezie fimbrii typu 1 istotną rolę pełni adhezyna FimH, o czym świadczy znacznie obniżony poziom ufimbriowania w mutantach pozbawionych tego białka [Schembri i wsp., 1996, So i Thanassi, 2006]. Ma to związek ze specyficznym sposobem rozpoznania białka FimH przez białko FimD, które wiąże kompleks FimC-FimH z powinowactwem od 20 do 100 razy wyższym niż pozostałe kompleksy czaperonu z białkami fimbrialnymi [Saulino i wsp., 1998], ułatwiając w ten sposób rozpoczęcie tworzenia nowej fimbrii od białka FimH. Co więcej, w przypadku braku adhezyny FimH nie dochodzi do łączenia się białka FimD z pozostałymi białkami fimbrialnymi [Saulino i wsp., 2000]. 26

27 1. Wstęp Ryc. 2. Schemat biogenezy fimbrii typu 1. Opracowano na podstawie [Li i wsp., 2010]. FimD, integralne białko błony zewnętrznej o masie 90 kda, zawiera dwie domeny periplazmatyczne oraz dużą domenę centralną osadzoną w zewnętrznej błonie komórkowej [Capitani i wsp., 2006, Remaut i wsp., 2008]. N-końcowa, periplazmatyczna domena FimDN, która zasłania część śródbłonowego kanału FimD [Remaut i wsp., 2008], w trakcie przechodzenia nowopowstającej fimbrii na powierzchnię komórki bakteryjnej ulega znaczącym zmianom konformacyjnym. Wydaje się, że czynnikiem wywołującym te zmiany jest adhezyna FimH [Remaut i wsp., 2008, Saulino i wsp., 1998], która to, w kompleksie z czaperonem FimC, umożliwia aktywację białka FimD, niezbędną do polimeryzacji fimbrii [Nishiyama i wsp., 2008]. Po aktywacji białka FimD przez kompleks białkowy FimC-FimH następuje przyłączanie kolejnych cząsteczek białek fimbrialnych do tworzącej się fimbrii, która jest jednocześnie transportowana na powierzchnię komórki bakteryjnej. Ponieważ kanał utworzony przez białko FimD ma średnicę tylko 2-3 nm, pozwala on na 27

28 1. Wstęp transport białek fimbrialnych przez zewnętrzną błonę cytoplazamtyczną jedynie w formie liniowego łańcucha. Stąd, sugeruje się, że trzon fimbrii typu 1 uzyskuje swoją ostateczną heliakalną strukturę dopiero po przetransportowaniu spolimeryzowanych białek na zewnątrz komórki [Saulino i wsp., 2000, Thanassi i wsp., 1998]. Każde z białek tworzących fimbrie fałduje się w sposób typowy dla białek typu immunoglobulin z charakterystycznym ułożeniem β włókien. Jedyną, ale bardzo istotną dla biogenezy i budowy fimbrii typu 1, różnicą w stosunku do typowego zwinięcia immunoglobulinowego (ang. Ig-fold) jest brak jednego z β włókien (włókna G), powodujący odsłonięcie hydrofobowego wnętrza każdego z białek. Powstały w ten sposób rowek służy jako miejsce wiązania dla N-końcowego wyrostka (ang. Nte - N-terminal extension) będącego β włóknem kolejnej podjednostki fimbrialnej. Rowek wypełniony N-końcowym wyrostkiem, tworzące razem motyw strukturalny noszący nazwę DSC (ang. Donor Stand Complementation), zamyka hydrofobowy rdzeń pozwalając na utworzenie pełnego zwinięcia immunoglobulinowego. N-końcowy wyrostek obecny jest w każdej cząsteczce białka tworzącego fimbrie za wyjątkiem adhezyny FimH, co stanowi kolejny dowód na występowanie tego białka jedynie na szczycie fimbrii typu 1 [Le Trong i wsp., 2010, Remaut i wsp., 2008]. Przedstawiony powyżej schemat łączenia się poszczególnych cząsteczek białek tworzących fimbrie jest skutecznym sposobem na wytworzenie bardzo silnych oddziaływań międzycząsteczkowych, spajających mocno całą strukturę. Stwarza on jednak pewne problemy w kontroli i regulacji procesu biogenezy fimbrii, co związane jest z obecnością w ich strukturze hydrofobowego rdzenia. W ich rozwiązywaniu pomaga białko czaperonowe FimC, które po związaniu cząsteczek białek FimH, FimF i FimA, a w przypadku E. coli również FimG, zasłania polipeptydowym ramieniem G1, pełniącym rolę N końcowego wyrostka, ich hydrofobowe wnętrze [Barnhart i wsp., 2000]. Co ciekawe, ramię czaperonu zamiast anty-równoległego, dostarcza równoległe β włókno, co skutkuje powstaniem niekanonicznego typu zwinięcia immunoglobulinowego [Ryc 3A]. W kolejnym etapie, proces przyłączania 28

29 1. Wstęp cząsteczek białek do tworzącego się włókna fimbrii wymaga wymiany N-końcowego wyrostka pochodzącego z białka FimC na N-końcowy wyrostek kolejnej przyłączanej podjednostki, co odbywa się w oparciu o mechanizm określany mianem wymiany N-końcowych wyrostków (ang. DSE - Donor Strand Exchange). W trakcje tego procesu N-końcowy wyrostek czaperonu zastępowany jest N-końcowym wyrostkiem kolejnego białka fimbrialnego [Remaut i wsp., 2006, Vetsch i wsp., 2006]. Co istotne, N-końcowy wyrostek pochodzący z białka fimbrialnego uzupełnia szczelinę anty-równoległym β włóknem, tworząc typowe zwinięcie immunoglobulinowe [Ryc. 3B, 3C]. Tak utworzony kompleks charakteryzuje się niższą energią swobodną, co umożliwia zachodzenie procesu DSE bez nakładów energetycznych [Sauer i wsp., 2002, Zavialov i wsp., 2003]. Ryc. 3. Schemat przedstawiający topologię włókien białek tworzących fimbrie typu 1 E. coli. (A) łączenie podjednostki fimbrialnej z czaperonem, (B) łączenie dwóch kolejnych jednostek fimbrialnych. (C) struktura białka FimH uzupełniona o N-końcowe wydłużenie pochodzące z białka FimF. Opracowano na podstawie [Remaut i wsp., 2008] oraz [Le Trong i wsp., 2010]. 29

30 1. Wstęp 1.8. Adhezyna FimH Struktura białka FimH Oparty na badaniach krystalograficznych model strukturalny białka FimH Escherichia coli w postaci kompleksu z czaperonem FimC został opracowany przez Choudhury ego i wsp. [1999]. Zgodnie z tym modelem, składające się z 279 aminokwasów białko posiada dwie domeny połączone krótkim, składającym się z trzech aminokwasów łącznikiem. Pierwsza z domen, znajdująca się na N-końcu i zawierająca w sobie reszty aminokwasowe od 1 do 156, to domena lektynowa, bezpośrednio odpowiedzialna za wiązanie liganda; druga, obejmująca reszty aminokwasowe od 160 do 279 to domena pilinowa zapewniająca połączenia białka z trzonem fimbrii [Ryc. 4A]. Ryc. 4. Model struktury białka FimH Escherichia coli. (A) w postaci kompleksu z czaperonem FimC [Choudhury i wsp., 1999]. (B) z wolną kieszenią wiążącą mannozę [Le Trong i wsp., 2010]. 30

31 1. Wstęp Domena pilinowa FimH Escherichia coli posiada strukturę zbliżoną do typowego zwinięcia immunoglobulinowego, pozbawioną jednak siódmego C-końcowego β włókna obecnego w przypadku typowego zwinięcia immunoglobulinowego [Choudhury i wsp., 1999, Sauer i wsp., 2000]. Domenę lektynową tworzy 11 β włókien złożonych w β baryłkę, która osłania znajdującą się na szczycie domeny silnie hydrofobową kieszeń wiążącą mannozę [Choudhury i wsp., 1999, Hung i wsp., 2002, Knight i wsp., 2000]. Znajdujące się w niej reszty aminokwasowe Phe1, Asn46, Asp47, Asp54, Gln133, Asn135, Asp140 i Phe142 wiążą grupy hydroksylowe D-mannozy za pomocą wiązań wodorowych i oddziaływań hydrofobowych, zaś mutacje w obrębie tych aminokwasów osłabiają, bądź też całkowicie uniemożliwiają wiązanie tego monosacharydu przez białko FimH [Hung i wsp., 2002]. Dodatkowo, kieszeń otoczona jest hydrofobowym pierścieniem, utworzonym przez reszty Ile13, Tyr48, Ile52 i Phe142, odpowiedzialnym prawdopodobnie za oddziaływania z oligosacharydami mannozowymi. Model krystaliczny białka FimH ze związanym oligosacharydem utworzonym przez trzy reszty D-mannozy wskazuje na zaangażowanie dodatkowej reszty Tyr137, która wraz z Tyr48 tworzy tzw. bramę tyrozynową, determinującą w dużej mierze siłę i specyfikę oddziaływań z cukrowymi ligandami [Wellens i wsp., 2008]. W modelu białka FimH, zaproponowanym przez Choudhur ego i wsp. [1999], kieszeń wiążąca mannozę zajęta była glukamidem (C-HEGA), natomiast w kolejnych modelach rolę liganda pełniła mannoza [Hung i wsp., 2002, Wellens i wsp., 2008]. Z kolei, w strukturze krystalicznej zaproponowanej ostatnio przez Le Trong i wsp [2010] adhezyna FimH, połączona z trzonem fimbrii, nie była związana z żadnym cukrowym ligandem [Ryc. 4B]. W tym ostatnim modelu wykazano, że brak liganda znacząco wpłynął na konformację domeny lektynowej. Jest ona szersza i bardziej zwarta w porównaniu do rozluźnionej strukturalnie domeny ze związaną mannozą [Le Trong i wsp., 2010, Tchesnokova i wsp., 2008]. Różnice dotyczą głównie położenia części dystalnych i proksymalnych włókien β tworzących domenę lektynową [Ryc. 5]. Wydaje się, że przechodzenie białka FimH znajdującego się na szczycie fimbrii 31

32 1. Wstęp ze stanu o ściśniętej, zwartej konformacji do stanu posiadającego konformację luźną i wydłużoną może być spowodowane siłami ścinającymi wpływającymi na właściwości adhezyjne FimH (rozdz ). Ryc. 5. Dwie konformacje domeny lektynowej białka FimH Escherichia coli. (A) - Zwarta struktura domeny lektynowej nie wiażącej D-mannozy, (B) - Rozluźniona konformacja domeny lektynowej ze związaną mannozą. Opracowano na podstawie [Le Trong i wsp., 2010]. Jak do tej pory struktura krystaliczna białka FimH pochodzącego z Salmonella enterica nie jest znana, jednak podobieństwa pod względem funkcji i swoistości receptorowej pozwalają, pomimo niewielkiego stopnia homologii [Boyd i Hartl, 1999, Kisiela i wsp., 2011, Nuccio i Baumler, 2007], na wnioskowanie o strukturze adhezyny FimH Salmonella enterica na podstawie znanej struktury białka FimH Escherichia coli. Co więcej, modelowanie in silico wykazało wysoki stopień tak strukturalnego jak i funkcjonalnego podobieństwa pomiędzy adhezynami FimH pochodzącymi z Escherichia coli i Salmonella Typhimurium [Kisiela i wsp., 2011] [Ryc. 6]. 32

33 1. Wstęp Ryc. 6. Obliczony in silico model strukturalny adhezyny FimH Salmonella Typhimurium [Kisiela i wsp., 2011] Swoistość receptorowa FimH Adhezyna FimH zdolna jest do wiązania szeregu glikoprotein, których łańcuchy cukrowe występują w postaci struktur określanych mianem bogatych w mannozę [Firon i wsp., 1984, 1983, Nagahori i wsp., 2002]. Najwcześniejsze badania, w których wiązanie bakterii do komórek drożdży hamowano za pomocą różnych strukturalnie oligosacharydów, wykazały istnienie znaczących różnic w specyficzności receptorowej fimbrii typu 1 różnych gatunków Enterobacteriaceae [Firon i wsp., 1984, 1983]. Dla sześciu przebadanych serowarów Salmonella enterica najlepszymi inhibitorami okazały się rozbudowane struktury oligomannozowe przedstawione w tabeli 1. Z kolei fenylo-α-d-mannoza, p-nitrofenylo-α-dmannoza oraz trisacharyd Manα(1-3)Manβ(1-4)GlcNAc, struktury, które tylko w niewielkim stopniu hamowały aglutynację drożdży przez badane pałeczki Salmonella [Firon i wsp., 1984, 1983], w przypadku kilku przebadanych szczepów Escherichia coli okazały się najskuteczniejszymi inhibitorami, hamującymi aglutynację od 21 do 72 razy mocniej niż metylo-α-mannoza. Natomiast związek nr 4 z tabeli 1, wiązany z wysokim powinowactwem przez pałeczki Salmonella, w tym Salmonella Enteritidis, 33

34 1. Wstęp okazał się umiarkowanym inhibitorem dla Escherichia coli [Firon i wsp., 1984]. Co istotne, w przypadku każdej badanej pałeczki jelitowej zamiana inhibitora p-nitrofenylo-α-d-mannozy na jego anomer, p-nitrofenylo-β-dmannozę, skutkowała niemal całkowitym brakiem hamowania aglutynacji, wskazując na zdecydowane preferencje do α-anomeru mannozy. Tabela 1. Struktury oligosacharydów mannozowych Nr Struktura Oligosacharydu Źródło 1 [Firon i wsp., 1984] 2 [Firon i wsp., 1984] 3 [Firon i wsp., 1984] 4 [Firon i wsp., 1984] Powyższe wyniki, uzyskane dla całych bakterii, dość dobrze korelują z wynikami uzyskanymi za pomocą techniki powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) dla wiązania oczyszczonej domeny lektynowej białka FimH Escherichia coli do różnych struktur oligomannozowych [Bouckaert i wsp., 2006]. W oparciu o te badania zaproponowano, że zróżnicowanie siły wiązania poszczególnych struktur cukrowych przez adhezynę FimH zależy od sposobu w jaki ligand dopasowuje się do bramy tyrozynowej 34

35 1. Wstęp [Bouckaert i wsp., 2005, Wellens i wsp., 2008] (rozdz ). I tak stwierdzono, że zarówno disacharyd Manα1-3Man jak i liniowy trisacharyd Manα1-3Manα1-6ManOMe są wiązane przez białko FimH z około 10-krotnie wyższym powinowactwem niż cząsteczka D-mannozy. Kolejny 10-krotny wzrost siły wiązania spowodowany jest przyłączeniem do tych struktur, wiązaniem β1-4 glikozydowym, reszty GlcNAc, która prawdopodobnie umiejscawia się pomiędzy dwiema tyrozynami tworzącymi bramę tyrozynową [Bouckaert i wsp., 2006]. Wykonane z wykorzystaniem techniki SPR pomiary pozwoliły na określenie powinowactwa adhezyny FimH Escherichia coli do wolnej mannozy na poziomie 2,3 µm [Bouckaert i wsp., 2005]. To stosunkowo silne oddziaływanie tłumaczone jest strukturą kieszeni wiążącej białka FimH, która powoduje, że głęboko schowana cząsteczka D-mannozy oddziałuje z aminokwasami kontaktowymi poprzez wiele grup hydroksylowych. Z kolei dodawanie do D-mannozy łańcuchów alkilowych powoduje wzrost siły wiązania na skutek zwiększonej liczby kontaktów o charakterze hydrofobowym. W przypadku niektórych alkilowanych mannozydów wiązanie to było nawet kilkaset razy silniejsze niż wolnej D- mannozy [Tabela 2]. Powinowactwo adhezyn FimH do struktur oligomannozowych zależy nie tylko od struktury łańcucha cukrowego typu bogatego w mannozę, ale również od subtelnych zmian w sekwencji aminokwasowej samej adhezyny, czyli występowania tzw. wariantów allelicznych białka FimH (rozdz ). Na przykład, około 80% izolatów Escherichia coli z kału zwierząt jest zdolnych do wiązania jedynie struktur trimannozowych (głównie α-1-3-mannotrioza α-1-6-mannotrioza). Z kolei, ponad 70% szczepów Escherichia coli izolowanych od ludzi z infekcją dróg moczowych, których adhezyna FimH różni się kilkoma aminokwasami od białka FimH szczepów izolowanych z kału, wykazuje zdolność wiązania pojedynczej cząsteczki D-mannozy [Sokurenko i wsp., 1995]. Również w przypadku białek FimH Salmonella Enteritidis i Salmonella Typhimurium drobne zmiany w strukturze pierwszorzędowej mogą wpływać na ich powinowactwo do łańcuchów cukrowych typu bogatego w mannozę [Boddicker i wsp., 2002, Grzymajlo i wsp., 2010]. 35