Wykorzystanie interferencji RNA do opracowywania nowych terapii przeciwnowotworowych
|
|
- Artur Duda
- 8 lat temu
- Przeglądów:
Transkrypt
1 PRACE PRZEGL DOWE Wykorzystanie interferencji RNA do opracowywania nowych terapii przeciwnowotworowych Bo ena Kamiñska 1,2, Dorota Kulesza 1,2, Pawe³ Wiœniewski 3 1 Pracownia Regulacji Transkrypcji, Instytut Biologii Doœwiadczalnej im. M. Nenckiego, Polska Akademia Nauk 2 Studium Medycyny Molekularnej, Warszawski Uniwersytet Medyczny 3 Zak³ad Biologii Molekularnej, Miêdzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej, Warszawa RNA interference-based therapeutics in anticancer therapy Summary Adres do korespondencji Bo ena Kamiñska, Pracownia Regulacji Transkrypcji, Instytut Biologii Doœwiadczalnej PAN im. M. Nenckiego, ul. Pasteura 3, Warszawa; bozenakk@nencki.gov.pl 3 (90) RNA interference (RNAi) is a phenomenon of sequence-specific gene silencing and its discovery led to wide applications. Short interfering RNA (sirna), which induces RNAi, has been experimentally introduced as a cancer therapy and is expected to be developed as a nucleic acid-based medicine. Potential success of sirna cancer therapies depends on selection of appropriate gene targets and candidate targets include genes associated with cell proliferation, metastasis, angiogenesis, and drug resistance. In vivo systemic delivery of sirna-based therapeutics to tumour tissues is challenging and the major limitations of sirna therapeutic use are its degradation by serum nucleases, poor cellular uptake and rapid renal clearance following systemic administration. Several sirna-based therapeutics are already in clinical trials. Further development of anti-cancer therapeutic sirnas depends on development of nanocarriers, nuclease-resistant chemically modified sirnas and variety of synthetic or natural lipids and polymers to systemically deliver sirna. Here, we review potential approaches for delivery of RNAi based therapeutic in cancer therapy, results of current studies and clinical trials which demonstrate that the use of targeted sirna offers promising strategies for cancer therapies. Key words: RNA interference, cancer therapy, sirna.
2 Wykorzystanie interferencji RNA do opracowywania nowych terapii przeciwnowotworowych 1. Wprowadzenie Kiedy w 1998 r. ukaza³a siê w Nature publikacja Andrew Fire a i wsp. (1), aden z nich nie przypuszcza³ zapewne, e opisane przez nich zjawisko interferencji RNA jest uniwersalne i doprowadzi do powstania niezwykle skutecznych narzêdzi do modulowania ekspresji genów in vitro i in vivo. W latach osiemdziesi¹tych i dziewiêædziesi¹tych ubieg³ego wieku bardzo popularne by³o wykorzystanie antysensowych RNA do modulowania ekspresji genów i powszechnie uwa ano, e jest to wynikiem dzia³ania prostego mechanizmu wynikaj¹cego z hybrydyzacji miêdzy wprowadzonym antysensowym RNA i endogennym mrna, prowadz¹cego do degradacji przez RNazy, blokowania obróbki transkryptu lub blokowania translacji mrna. Fire a i wsp. wprowadzaj¹c jedno- lub dwuniciowe (ds) antysensowe RNA do komórek nicienia Caenorhabditis elegans pokazali, e dsrna by³o bardziej efektywne ni jednoniciowe RNA w blokowaniu transkrypcji genów (1). Wielka intuicja autorów poleg³a jednak e nie tylko na stwierdzeniu, e kilka cz¹steczek dwuniciowego RNA na komórkê wystarczy, aby specyficznie interferowaæ z ekspresj¹ genów. Autorzy zaproponowali, e u pod³o a procesu musi istnieæ mechanizm katalityczny lub odpowiadaj¹cy za zwielokrotnienie zjawiska wyciszania ekspresji genów. S³usznoœci ich tezy dowiedziono wkrótce w badaniach innych zespo³ów dokumentuj¹cych wystêpowanie zjawiska interferencji RNA i obecnoœci 25 nt RNA komplementarnych zarówno do mrna jak i antysensowego RNA w komórkach roœlin (2) i nt RNA komplementarnych do mrna w komórkach owadów Drosophila melanogaster (3-6), komórkach ssaczych (7) i roœlinnych (8). Zjawisko i mechanizm molekularny interferencji RNA by³y przedmiotem licznych badañ i publikacji. Wysoka wydajnoœæ i specyficznoœæ wyciszania poprzez mechanizm interferencji zale nej od RNA (RNAi) przyspieszy³y rozwój badañ tego zjawiska i doprowadzi³y do dobrego poznania mechanizmów komórkowych le ¹cych u podstaw tego procesu (8). Pierwsze wyniki dotycz¹ce maszynerii komórkowej odpowiedzialnej za zjawisko RNAi pochodzi³y z badañ nad organizmem modelowym Drosophila melanogaster i wskazywa³y, e RNAi jest inicjowane przez d³ugie fragmenty dwuniciowego RNA (dsrna), które ulega pofragmentowaniu przez enzym zwany Dicer. Dicer ma dwie domeny o aktywnoœci RNazy III oraz domeny: wi¹ ¹c¹ dwuniciowe RNA, helikazow¹ oraz PAZ odpowiedzialn¹ za interakcje z innymi bia³kami. Dicer degraduje d³ugie fragmenty dwuniciowego RNA do krótkich, 21-nukleotydowych fragmentów zawieraj¹cych 19 sparowanych nukleotydów i 2 wolne nukleotydy na koñcach 3. Powsta³e 21-nukleotydowe, dwuniciowe RNA nazywane s¹ sirna (ang. short interfering RNA) (9,10). Dwuniciowe sirna asocjuj¹ z kompleksem bia³ek zwanym RISC (ang. RNA-Induced Silencing Complex), który jest du ym kompleksem (160 kda) o z³o onej aktywnoœci enzymatycznej wykazuj¹cym aktywnoœæ helikazy oraz endo- i egzonukleazy. Centrum katalityczne kompleksu stanowi¹ bia³ka Argonaute (Ago) zawieraj¹ce domeny: PAZ (ang. Piwi/Argonaute/Zwille) rozpoznaj¹c¹ 3 koniec RNA i PIWI (ang. P-ele- BIOTECHNOLOGIA 3 (90)
3 Bo ena Kamiñska, Dorota Kulesza, Pawe³ Wiœniewski ment Induced Wimpy Testis) o aktywnoœci endonukleolitycznej (10). Bia³ka TRBP (ang. TAR RNA Binding Protein) i PACT (ang. Protein Activator of Protein Kinase PKR) u³atwiaj¹ przekazanie sirna do kompleksu bia³ka Ago2 i RISC (11-13). W obrêbie kompleksu RISC sirna jest rozwijane, RISC wi¹ e preferencyjnie niæ wiod¹c¹ (ang. guide strand), a niæ towarzysz¹ca (ang. passenger strand) jest degradowana przez nukleazy. Zwi¹zany z kompleksem RISC, jednoniciowy, antysensowy RNA rozpoznaje komplementarne sekwencje w mrna, hybrydyzuje z nim, co umo - liwia degradacjê rozpoznanego RNA przez endonukleazy wchodz¹ce w sk³ad RISC. Ciêcie dupleksów mrna/sirna nastêpuje pomiêdzy nukleotydem 10 i 11 od koñca 5 nici antysensowej, a w dalszej degradacji uczestnicz¹ egzonukleazy. Zjawisko to prowadzi do transkrypcyjnego wyciszenia ekspresji genów docelowych. W komórkach eukariotycznych procesy RNAi zaanga owane s¹ tak e w obróbkê i dojrzewanie mikro RNA. mikro RNA to jednoniciowe cz¹steczki RNA o d³ugoœci ok nukleotydów nale ¹ce do grupy niekoduj¹cych kwasów rybonukleinowych tzw. ncrna (ang. non-coding RNA) (14). Podobnie jak normalne geny mirna s¹ kodowane przez genom komórki. Obecnie u cz³owieka znanych jest >800 mirna, a koduj¹ce je geny stanowi¹ >3% wszystkich genów. Pierwotne transkrypty mirna zawieraj¹ z³o one struktury drugorzêdowe zwane (ang. hairpin czyli szpilki do w³osów ) i s¹ przecinane do prekursorowych mirna o d³ug. 70 pz przez j¹drow¹ nukleazê III Drosha (u zwierz¹t) lub DCL1 (u roœlin). Pre-miRNA s¹ transportowane do cytoplazmy przez bia³ko Eksportyna-5 (Exp5) i procesowane do dojrza³ego mirna o d³ugoœci od 18 do 24 nukleotydów przez Dicer (8,15). W odró nieniu od sirna, mirna nie wykazuj¹ 100% identycznoœci sekwencji do docelowego mrna. Jeœli dwuniciowy RNA ma sekwencjê nie dopasowan¹ perfekcyjnie (w przypadku mirna) wykorzystywany jest mechanizm obejmuj¹cy rozplecenie dupleksu przez helikazê. Powstaje wtedy dojrza³y mirna aktywuj¹cy RISC. W przeciwieñstwie do sirnas i roœlinnych mirna, które indukuj¹ ciêcie docelowego, specyficznego mrna, wiêkszoœæ mirna zwierz¹t nie ma perfekcyjnej homologii z docelowym mrna i hamuje translacjê poprzez mechanizm zale ny od RISC i rozpoznawania cap mrna. Zjawisko to wystêpuje w cytoplazmie w cia³kach P (ang. processing bodies), które zawieraj¹ mrna nie ulegaj¹ce translacji i s¹ miejscem jego degradacji (16). W komórkach ssaków oprócz transkrypcyjnego wyciszenia ekspresji genów wystêpuje tak e zjawisko potranskrypcyjnego wyciszenia ekspresji genów. Kompleksy sirna-ago2 wraz z TRBP2 (DNA metyltransferaza) i metyltransferaz¹ histonów EZH2 (z rodziny Polycomb) s¹ rekrutowane do promotorów genów docelowych sirna. Przeprowadzaj¹ metylacjê DNA de novo lub metylacjê lizyny 9 i 27 histonu H3, co powoduje trwa³e modyfikacje chromatyny (17,18). 96 PRACE PRZEGL DOWE
4 Wykorzystanie interferencji RNA do opracowywania nowych terapii przeciwnowotworowych 2. Jak zaplanowaæ dobre si/shrna? 2.1. Zasady projektowania si/shrna Najbardziej powszechnym zastosowaniem RNAi jest specyficzne wyciszenie ekspresji wybranego genu. Jednak e projektowanie sirna nie jest proste tym bardziej, e struktura przestrzenna i ufa³dowanie docelowego mrna lub jego oddzia³ywania z innymi bia³kami mog¹ ograniczaæ dostêp i wi¹zanie kompleksu RISC do mrna. Rekomendowane i powszechnie stosowane s¹ zasady projektowania sirna opracowane przez grupê Thomasa Tuschla ( (19). Zasady projektowania si/shrna z uwzglêdnieniem regu³ Tuschla s¹ stosunkowo proste: Zaczyna siê od sekwencji AUG kodonu start i wyszukuje sekwencje AA i 19 s¹siaduj¹cych nukleotydów jako potencjalne miejsce rozpoznawane przez sirna. Wybiera siê 3-4 sekwencje docelowe najlepiej znajduj¹ce siê w ró nych czêœciach mrna, bo nie wiadomo, które oka ¹ siê najbardziej wra liwe na degradacjê. Zawartoœæ G/C nie powinna przekroczyæ ~30-50%. Przeszukuje siê wybrane bazy genów pod k¹tem podobieñstwa z wybran¹ sekwencj¹ i odrzuca wszystkie sekwencje o znacz¹cej homologii z innymi genami. Nale y unikaæ sekwencji 5 -GUCCUUCAA-3 i 5 - UGUGU-3, poniewa te motywy maj¹ silne dzia³anie immunostymuluj¹ce i indukuj¹ odpowiedÿ interferonow¹. shrna syntetyzowane z zintegrowanego wektora lentiwirusowego nie wywo³uje efektu ubocznego tak jak egzogenne sirna, gdy nie wchodzi do endosomów. Nie mo na dopuœciæ do wysycenia endogennego mechanizmu wyciszaj¹cego (np. hamowanie Eksportyny 5 i eksportu endogennego mirna jest toksyczne dla komórek). Dlatego lepszy jest s³abszy promotor H1 ni silniejszy U6. Istnieje kilka ogólnodostêpnych serwisów internetowych w instytucjach akademickich lub komercyjnych, które oferuj¹ narzêdzia do projektowania sirna (URL: Cold Spring Harbor Laboratories; Wistar Institute; Whitehead Institute; techlib/misc/sirna_finder.html, Ambion; Dharmacon; Invitrogen). Jednak e nale y zaznaczyæ, e pos³ugiwanie siê teoretycznymi kryteriami projektowania efektywnie dzia³aj¹cych sirna nie zapewnia ich efektywnego dzia³ania (20). Szereg bardzo efektywnie dzia³aj¹cych sirna tylko czêœciowo spe³nia kryteria zasad projektowania sirna i odwrotnie, teoretycznie optymalne cz¹steczki sirna mog¹ wykazywaæ siê ograniczon¹ efektywnoœci¹ wyciszania. Zatem optymalny wybór cz¹steczki sirna wymaga doœwiadczalnego porównania efektywnoœci wyciszania przez kilka zaprojektowanych cz¹steczek-kandydatów. BIOTECHNOLOGIA 3 (90)
5 Bo ena Kamiñska, Dorota Kulesza, Pawe³ Wiœniewski Wkrótce skonstruowano wektory zawieraj¹ce kasety DNA umo liwiaj¹ce tworzenie w komórce krótkich RNA o strukturze spinki do w³osów (shrna, ang. short hairpins) lub transkrypcjê przez polimerazê III 21-nukleotydowych nici sensowej i antysensowej tworz¹cych w komórce dwuniciowe RNA. Minimalny wektor do ekspresji shrna zawiera promotor dla polimerazy III, po którym nastêpuje 19 nukleotydów odpowiadaj¹cych sekwencji docelowej, linker o d³ugoœci 4-10, 19-nukleotydow¹ sekwencjê antysensow¹ zakoñczon¹ 4-6 urydynami oraz adaptory do klonowania do plazmidu. System mo e tez zawieraæ dwa promotory umo liwiaj¹ce transkrypcje 2 oddzielnych nici RNA. W celu lepszej modulacji procesu wyciszania stosuje siê promotory indukowalne (np. tetracyklin¹) lub system indukowalnej ekspresji Cre-loxP. Podobnie jak w przypadku sirna, plazmidy koduj¹ce shrna nie przechodz¹ ³atwo przez b³ony komórkowe i wymagaj¹ stosowania substancji u³atwiaj¹cych przenikanie do komórek. Dlatego te stosowane s¹ wektory wirusowe, najczêœciej adenowirusowe lub pochodne AAV (ang. Adeno-Associated Virus). Coraz czêœciej do wprowadzania do komórek DNA stosuje siê wektory retrowirusowe, które pozwalaj¹ na trwa³e zmiany ekspresji, gdy integruj¹ siê chromosomalnym DNA gospodarza. Wektory te bazuj¹ na wirusie bia³aczki (MLV, ang. Murine Lukemia Vrus) lub lentiwirusach (np. HIV, FIV lub EIAV) i maj¹ tê przewagê, e infekuj¹ tak e komórki nie dziel¹ce siê Mechanizmy nieswoistego dzia³ania sirna W przypadku projektowania si/shrna nale y zwracaæ szczególn¹ uwagê na ryzyko wyst¹pienia efektów niespecyficznych w komórkach. Efekty te mog¹ polegaæ na: degradacji innych genów ni docelowy (ang. off-target effects), wspomnianej toksycznoœci w przypadku wysycenia endogennych szlaków RNAi, zw³aszcza eksportyny 5 oraz indukcji odpowiedzi interferonowej. Dwuniciowe RNA d³u sze zarówno ni 30 pz, jak te zwykle u ywane 21-nukleotydowe, aktywuj¹ kinazê R (PKR) i indukuj¹ odpowiedÿ interferonow¹ (21). Têpo zakoñczone sirnas s¹ lepsze od tych maj¹cych na koñcach wolne nukleotydy (np. sirna transkrybowane przez Pol T7). Jednoniciowe koñce sirna mog¹ byæ wykrywane przez helikazê kodowan¹ przez gen RIG-I (ang. Retinoic Acid Gene 1) (22), która uczestniczy w procesach rozpoznawania obcego, zwykle wirusowego RNA i inicjowaniu odpowiedzi przeciwwirusowej. Syntetyczne sirna, które wchodz¹ do endosomów, mog¹ aktywowaæ receptory TLR (ang. Toll Like Receptors), g³ównie TLR7 and TLR8 (23,24). U ycie plazmidów koduj¹cych shrna pozwala omin¹æ i wykluczyæ aktywacjê receptorów TLR. Tak e modyfikacje nukleotydów, np. zast¹pienie urydyn odpowiednikami zmodyfikowanymi w pozycji 2 (2 -O-metyl urydynami) znosi rozpoznawanie sirna przez TLR7/8 i nie dopuszcza do stymulacji komórek uk³adu odpornoœciowego, co jest szczególnie istotne w doœwiadczeniach in vivo. 98 PRACE PRZEGL DOWE
6 Wykorzystanie interferencji RNA do opracowywania nowych terapii przeciwnowotworowych 3. Wykorzystanie zjawiska RNAi do specyficznego wyciszania ekspresji genów in vivo Spektakularne osi¹gniêcia w modulacji ekspresji genów z wykorzystaniem sirna przyczyni³y siê do szybkiego ich zastosowania w badaniach in vivo. W 2002 r. McCaffrey i wsp. opublikowali pierwsze wyniki pokazuj¹ce wyciszenie ekspresji genu za pomoc¹ sirna i shrna in vivo (25). Plazmid zawieraj¹cy gen koduj¹cy lucyferazê by³ wstrzykniêty do ylnie razem ze zsyntetyzowanymi chemicznie sirna lub plazmidem koduj¹cym shrna do myszy. Aktywnoœæ lucyferazy w w¹trobie zmierzono za pomoc¹ obrazowania ca³ego cia³a. Stwierdzono 80% redukcjê ekspresji lucyferazy w w¹trobie myszy otrzymuj¹cych sirna/shrna skierowane przeciwko lucyferazie (25). W 2003 r. po raz pierwszy zastosowano sirna jako czynnik potencjalnie terapeutyczny w mysim modelu zapalenia w¹troby (26). Zapalenie w¹troby wywo³ywano poprzez wstrzykniêcie konkanawaliny A lub przeciwcia³a aktywuj¹cego receptor Fas. Podanie do y³y ogonowej sirna wyciszaj¹cego ekspresjê Fas znosi³o toksyczny efekt czynników uszkadzaj¹cych w¹trobê. Myszy po podaniu przeciwcia³a aktywuj¹cego Fas umiera³y po 3 dniach, natomiast 80% myszy nastrzykniêtych sirna przeciwko Fas prze ywa³o 10 dni (26). Rys. 1. Metody zwiêkszania efektywnoœci dzia³ania sirna oraz sposoby ich dostarczania do organizmu. Metody zwiêkszania efektywnoœci dzia³ania sirna za (27), zmodyfikowane. BIOTECHNOLOGIA 3 (90)
7 Bo ena Kamiñska, Dorota Kulesza, Pawe³ Wiœniewski Podawane do krwiobiegu lub dootrzewnowo sirna, podobnie jak antysensowe oligonukleotydy, akumuluj¹ siê w w¹trobie, œledzionie i nerkach, natomiast ich stê- enie w innych tkankach jest niskie. Ponadto w surowicy krwi jednoniciowe RNA jest degradowane przez nukleazy w ci¹gu sekund, a sirna w czasie minut. Na przyk³ad niezmodyfikowane sirna podawane do ylnie szczurom za pomoc¹ pomp ciœnieniowych ma okres pó³trwania 6 min (27). Poprawê efektywnoœci wyciszenia mo na uzyskaæ poprzez modyfikacje chemiczne cz¹steczek sirna, zwiêkszaj¹ce ich stabilnoœæ i zdolnoœæ przenikania przez b³ony komórkowe, i inne bariery tkankowe (rys. 1) (28,29). Zwi¹zanie sirna lub plazmidowego DNA z cz¹steczkami cholesterolu zwiêksza ich transport do komórek zale ny od receptorów lipoprotein oraz stabilnoœæ w surowicy poprzez zwi¹zanie z albumin¹. Op³aszczenie plazmidowego DNA kationowymi noœnikami (PEG) zwi¹zanymi z liposomami i przeciwcia³em umo - liwi³o uzyskanie 90% wyciszenia ekspresji EGFR w mózgu po podaniu do ylnym w mysim modelu guza mózgu (28,29). 4. Opracowanie nowych terapii przeciwnowotworowych z wykorzystaniem interferencji RNA Komórki nowotworowe wykazuj¹ liczne i ró norodne zaburzenia genetyczne i epigenetyczne. Pomimo wielkiej ró norodnoœci i z³o onoœci zaburzeñ, wzrost i proliferacja komórek nowotworowych jest czêsto modyfikowana przez inaktywacjê pojedynczego onkogenu. Jest to zwi¹zane z przestawieniem siê metabolizmu komórki nowotworowej na dominuj¹cy szlak przekaÿnictwa zaburzony przez bia³ko onkogenne. Zjawisko to nosi nazwê uzale nienia od onkogenu (ang. Oncogene Addiction) (30). Potwierdzeniem istnienia tego zjawiska jest wzrastaj¹ca liczba wyników badañ wykazuj¹cych wysok¹ aktywnoœæ terapeutyczn¹ przeciwcia³ lub inhibitorów farmakologicznych wy³¹czaj¹cych funkcje poszczególnych bia³ek onkogennych. Wœród spektakularnych przyk³adów mo na wymieniæ: trastuzumab (Herceptyna) hamuj¹cy receptorow¹ kinazê HER-2/NEU u pacjentek z rakiem piersi, imatinib blokujacy kinazê tyrozynow¹ Bcr-abl w chronicznych bia³aczkach oraz gefitinib i erlotinib, blokuj¹ce receptor naskórkowego czynnika wzrostu EGFR w drobnokomórkowym raku p³uc, raku trzustki i glejakach (30). Choroby nowotworowe sta³y siê polem dzia³ania terapii bazuj¹cych na wykorzystaniu sirna ze wzglêdu na mo liwoœæ wyciszenia ekspresji onkogenów lub innych genów podstawowych dla progresji nowotworu. 100 PRACE PRZEGL DOWE
8 Wykorzystanie interferencji RNA do opracowywania nowych terapii przeciwnowotworowych Wyniki badañ nad wykorzystaniem RNAi w terapii przeciwnowotworowej in vivo Tabela 1 Onkogenne czynniki transkrypcyjne Apoptoza Gen docelowy Rodzaj RNAi Sposób dostarczenia Model badañ (nowotwór) Specyficznoœæ Docelowe komórki Literatura STAT3 sirna nagie sirna czerniak, jelita grubego olionukleotyd CpG (IDG, ID ) komórki TLR9+ (31) shrna elektroporacja prostaty NSD (IDG) NSD (32) shrna atenuowane prostaty NSD (ID ) NSD (33) S. typhimurium shrna elektroporacja prostaty NSD (IDG) NSD (34) sirna neutralne liposomy jajnika NSD (ID ) NSD (35) shrna elektroporacja w¹trobowo- NSD (IDG) NSD (36) -komórkowy sirna kationowy czerniak NSD (IDG) NSD (37) polimer PEI zmodyfikowany StA cmyc sirna protamina czerniak bia³ko F105 komórki gp160+ (38) (IDG, ID ) EWS-FLI1 sirna polikation na bazie miêsak Ewinga transferyna komórki transfe- (42) cyklodekstryny ryna+ RhoA sirna PIHCA piersi NSD (ID ) NSD (43) ANT2 shrna kationowy noœnik lipidowy piersi NSD (IDG) NSD (44) Bcl2 sirna kationowy czerniak, p³uc 3p-siRNA (ID ) komórki Rig-I+ (45) polimer PEI sirna aptamer prostaty aptamer (IDG) komórki PSMA+ (46) BCLXL shrna liposomy jamy NSD (IDG) NSD (47,48) nosowo-gard³owej PLK1 sirna aptamer prostaty aptamer (IDG) komórki PSMA+ (46) Bcl2L12 shrna stabilna linia glejak BD BD (49) retrowirus XIAP shrna elektroporacja piersi NSD (IDG) NSD (50) shrna adenowirus jelita grubego NSD (IDG) NSD (51) shrna stabilna linia trzustki BD BD (52) adenowirus shrna adenowirus w¹trobowokomórkowy NSD (IDG) NSD (53) MDM2 sirna protamina czerniak bia³ko F105 komórki gp160+ (38) (IDG, ID ) BIOTECHNOLOGIA 3 (90)
9 Bo ena Kamiñska, Dorota Kulesza, Pawe³ Wiœniewski Angiogeneza œcie ki sygna³owe VEGF sirna protamina czerniak bia³ko F105 (IDG, ID ) shrna liposomy jamy nosowo- -gard³owej sirna komórki gp160+ (38) NSD (IDG) NSD (47,48) nano-noœniki bazuj¹ce rak o³¹dka NSD (IDG) NSD (54) na CaCO 3 sirna lentiwirus trzustki NSD (IDG) NSD (55) shrna liposomy jelita grubego NSD (IDG) NSD (56) HIF-1 sirna kationowy polimer PEI HIF-2 sirna kationowy polimer PEI sirna kationowy polimer PEI EphA2 sirna neutralne liposomy EGFR shrna PEG-ylowane anionowe liposomy glejak COX-2 sirna kationowe liposomy TERT sirna kompleksy SWNTs shrna liposomy rak jamy nosowo- -gard³owej ab-crystallin sirna przejœciowa transfekcja liposomy Her-2 sirna kationowy liposomy elf4e shrna stabilna linia liposomy Wt1 shrna kationowy polimer PEI Akt2 shrna kationowy polimer PEI kras shrna kationowy polimer PEI TEL-PDGF R shrna stabilna linia retrowirus TGF shrna stabilna linia lipofekcja Riptor, Raptor shrna stabilna linia lentiwirus glejak NSD (IDG) NSD (57) p³uc (LLC) NXD (ID ) NSD (58) p³uc (LLC) NXD (ID ) NSD (58) rak jajnika NXD (ID ) NSD (59) HIRMab, mtrfmab (ID ) komórki HIR+ (60) rak piersi NSD (ID ) NSD (61) rak p³uc (LLC) NSD (IDG) NSD (62) NSD (IDG) NSD (47,48) glejak BD BD (49) rak piersi folacyna (IDG) komórki folacyna + (63) rak piersi BD BD (64) rak p³uc inhalacje aerozolem komórki p³uc (65) rak trzustki NSD (IDG) NSD (66) rak trzustki NSD (IDG) NSD (66) komórki Ba/F3 BD BD (48) glejak BD glejak C6 (67) rak jelita grubego BD BD (39) 102 PRACE PRZEGL DOWE
10 Wykorzystanie interferencji RNA do opracowywania nowych terapii przeciwnowotworowych Wirusowe onkogeny Iwazyjnoœæ Chemowra liwoœæ Adhezja FAK shrna neutralne liposomy shrna sirna/ shrna shrna kationowe liposomy przejœciowa transfekcja, kationowe liposomy zmodyfikowany polimer PEI rak jajnika NSD (IDO, ID ) NSD (68) rak prostaty, rak piersi rak prostaty, rak piersi NSD (IDG) NSD (69) BD BD (70) czerniak NSD (IDG) NSD (71) MDR1 shrna nagie DNA rak szyjki macicy NSD (IDG) NSD (72) shrna stabilna linia rak pr¹cia BD BD (73) kationowe liposomy shrna stabilna linia kationowe liposomy rak w¹trobowokomórkowy BD BD (74) upar shrna nagie DNA rak piersi NSD (IDG) NSD (75) sirna nagie DNA rak jamy ustnej NSD (IDG) NSD (76) (OSCC) MMP-9 shrna nagie DNA rak piersi NSD (IDG) NSD (75) sirna kationowe rak o³¹dka NSD (IDG) NSD (77) liposomy Her-2 sirna kationowe liposomy, PEG-ylowane kationowe liposomy rak g³owy i szyi NSD/folacyna (IDG) komórki folacyna+ HPV E6 sirna nagie DNA rak szyjki macicy NSD (IDG) NSD (78) sirna atelokolagen rak szyjki macicy NSD (IDG) NSD (79) hpv E7 sirna nagie DNA rak szyjki macicy NSD (IDG) NSD (78) sirna atelokolagen rak szyjki macicy NSD (IDG) NSD (79) EBV LMP-1 shrna stabilne linie -raav-2 rak nosogard³a BD BD (80) (63) NSD niespecyficzne dostarczenie; BD brak dostarczenia; IDG iniekcja doguzowa; IDO iniekcja dootrzewna; raav-2 (ang. Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Vector); Sta kwas stearynowy (ang. Stearic Acid); PEI polietylenoimina, PEG polietylenoglikol; DOPE fosfatydyloetanoloamina; PIHC poliizoheksylocyjanoakryl; SWNT (ang. Single-Walled Carbon Nanotubes). W tabeli 1 przedstawiono zestawienie wyników badañ, w których wykorzystano zjawisko interferencji RNA w celu zahamowania wzrostu i rozwoju nowotworów in vivo. Pomimo trudnoœci zwi¹zanych ze specyficznym i efektywnym dostarczaniem kwasów nukleinowych do komórek nowotworowych in vivo, pojawia siê wiele prac BIOTECHNOLOGIA 3 (90)
11 Bo ena Kamiñska, Dorota Kulesza, Pawe³ Wiœniewski wykazuj¹cych skutecznoœæ tego podejœcia w potencjalnej terapii przeciwnowotworowej. Narzêdzie RNAi we wspomnianych badaniach s³u y do wyciszania ekspresji onkogenów, których nadmierny poziom sprzyja progresji nowotworów. Szczególnie istotne jest, jak siê wydaje, wyciszanie ekspresji tych bia³ek onkogennych, dla których brak jest obecnie specyficznych inhibitorów, co uniemo liwia wykorzystanie ich, jako celów klasycznej terapii przeciwnowotworowej. Przyk³adem takiego podejœcia jest wyciszanie onkogennych czynników transkrypcyjnych np. STAT3 (31-37), cmyc (38), dla których nie istniej¹ adne farmakologiczne inhibitory, bêd¹ce choæby na etapie badañ klinicznych. Innym ciekawym podejœciem jest zahamowanie aktywnoœci aktualnie dobrze znanych w terapii przeciwnowotworowej onkogenów np. kompleksów bia³ka mtor (ang. Mammalian Target of Rapamycin) (39), dla których klasyczne inhibitory nie zawsze s¹ skuteczne. Bia³ko mtor wystêpuje w dwóch kompleksach: jako kompleks mtorc1, w którym jednym ze sk³adników jest bia³ko Raptor oraz jako mtorc2 zawieraj¹cy bia³ko Rictor. Pat Gulhati i wsp. (39) wykazali, e u ycie shrna do wyciszenia bia³ka Rictor i zahamowania aktywnoœci kompleksu mtorc2 hamuje ywotnoœæ komórek raka jelita grubego niewra liwych na rapamycynê (znanego leku hamuj¹cego poœrednio aktywnoœæ kompleksu mtorc1). Autorzy wykazali, e wyciszenie aktywnoœci kompleksu mtorc2 w komórkach raka jelita grubego, zarówno wra liwych jak i niewra liwych na rapamycynê, ma znacz¹cy wp³yw na wielkoœæ guza w eksperymentach in vivo. W komórkach wra liwych na rapamycynê wielkoœæ guza z oko³o ~9500 mm 3 (komórki z ekspresj¹ kontrolnego shrna) zmniejszy³a siê do mm 3 (shrna przeciwko mtorc1-raptor lub/oraz mtorc2-rictor) po 25 dniach od implantacji. W komórkach niewra liwych na rapamycynê wielkoœæ guza, w którym ulega³o ekspresji kontrolne shrna wynosi³a 690 mm 3. Zastosowanie shrna wyciszaj¹cego ekspresjê bia³ka Rictor (mtorc2) lub jednoczesne zahamowanie aktywnoœci mtorc1 i mtorc2 doprowadzi³o natomiast do dramatycznego zmniejszenia wielkoœci guza do mm 3. Doœwiadczenia stworzy³y podstawy do wykorzystania interferencji RNA w celu zahamowania aktywnoœci kompleksów bia³ka mtor. Jednym z g³ównych problemów skutecznego wykorzystania RNAi w doœwiadczeniach in vivo jest brak wysokiej specyficznoœci i wydajnoœci dostarczenia sirna do komórek docelowych. Dlatego ró ne grupy wykorzystuj¹ coraz nowsze systemy specyficznych i efektywnych noœników sirna lub plazmidów koduj¹cych shrna. Przyk³adem dobrze ilustruj¹cym optymalizacjê sposobów dostarczania sirna s¹ wyniki badañ nad wyciszeniem bia³ka STAT3 w zwierzêcym modelu raka prostaty (32-34). Wykorzystano tu dwa sposoby dostarczania plazmidów koduj¹cych shrna wyciszaj¹ce ekspresjê czynnika transkrypcyjnego STAT3: elektroporacjê (32,34) oraz pozbawiony aktywnoœci szczep S. typhimurium jako noœnik (33). W dwóch pierwszych pracach po doguzowym dostarczeniu sirna wyciszaj¹cego ekspresjê bia³ka STAT3 odnotowano 3-5-krotne zmniejszenie objêtoœci guza w porównaniu do myszy traktowanych kontrolnym sirna. W opisanych pracach nie zastosowano 104 PRACE PRZEGL DOWE
12 Wykorzystanie interferencji RNA do opracowywania nowych terapii przeciwnowotworowych noœnika plazmidowego, ani cz¹steczki kieruj¹cej go do komórek nowotworu. W jednej z prac zastosowano jednak dodatkowo efekt synergii wyciszenia równoczeœnie dwóch onkogenów: STAT3 i GRIM-19 (34). W tym wariancie doœwiadczalnym objêtoœæ guza zmala³a ponad 10-krotnie w porównaniu do wariantu wyciszenia poszczególnych onkogenów (STAT3 i GRIM-19) osobno. Takie podejœcie wskazuje na u ytecznoœæ wyciszania jednoczeœnie wiêkszej liczby onkogenów lub stosowania terapii ³¹czonej, gdzie sirna stanowi jeden ze sk³adników œrodka terapeutycznego. Podobne podejœcie synergii zosta³o wykorzystane przez Ling Zhang i wsp. (33), którzy wykorzystali atenuowany szczep S. typhimurium jako noœnik plazmidu koduj¹cego shrna, wyciszaj¹cego ekspresjê bia³ka STAT3 w zwierzêcym modelu raka prostaty. Pozbawione zjadliwoœci bakterie S. typhimurium same wykazuj¹ dzia³anie przeciwnowotworowe oraz maj¹ zdolnoœæ do preferencyjnej, 1000 razy czêstszej infekcji komórek nowotworowych w porównaniu do komórek prawid³owych, jak równie infekuj¹ tkankê nowotworu równomiernie (40,41). Dodatkowe wykorzystanie S. typhimurium, jako noœnika DNA koduj¹cego shrna wyciszaj¹cego ekspresjê onkogenów czyni go atrakcyjnym, efektywnym i do pewnego stopnia specyficznym wektorem komórek nowotworowych. Próby wykorzystania tego narzêdzia do transfekcji komórek raka prostaty in vivo doprowadzi³y do 12-krotnego zmniejszenia objêtoœci nowotworu (z 2458,51 mm 3 w myszach kontrolnych do 216,42 mm 3 wmyszach traktowanych do ylnie S. typhimurium_shrnastat3). Dodatkowo u myszy transfekowanych S. typhimurium koduj¹cym shrna wyciszaj¹cym STAT3 dosz³o do 84% spadku liczby przerzutów. Co wiêcej, u co trzeciej tak traktowanej myszy zosta³ odnotowany ca³kowity zanik tkanki nowotworowej. Podsumowuj¹c, wykorzystanie specyficznego i wydajnego systemu dostarczania shrna, który dodatkowo wykorzystuje efekt synergistyczny pobudzaj¹c odpowiedÿ odpornoœciow¹, skutkuje najlepszym wynikiem terapeutycznym. Wiele komórek nowotworowych, w³¹czaj¹c w to komórki glejaka, wydziela cytokinê transformuj¹cy czynnik wzrostowy TGF (ang. Transforming Growth Factor ). W komórkach ludzkich glejaków podwy szony poziom ekspresji TGF jest skorelowany z poziomem z³oœliwoœci nowotworu, a TGF modyfikuje podœcielisko guza, wspiera wzrost nowotworu bezpoœrednio albo poœrednio przez hamowanie odpowiedzi uk³adu odpornoœciowego, stymulacjê produkcji czynników angiogennych, regulacjê migracji i inwazyjnoœci. W grupie kierowanej przez Bo enê Kamiñsk¹ w Pracowni Regulacji Transkrypcji w Instytucie Biologii Doœwiadczalnej PAN, aby wyciszyæ przekaÿnictwo przez TGF w komórkach ludzkiego glejaka, skonstruowano plazmidy, które kodowa³y 4 ró ne shrna i mog³y specyficznie hamowaæ ekspresjê receptora TGF typu II (T RII) (67). Jako kontrolê wykorzystano plazmid koduj¹cy shrna bez znacz¹cej homologii z genami szczura i cz³owieka. Zaprojektowane shrna ró ni³y siê wydajnoœci¹ wyciszania ekspresji genu, ale wszystkie obni a³y ekspresjê mrna T RII o 40-70%, redukowa³y poziom bia³ka T RII oraz blokowa³y zale n¹ od tego receptora œcie kê sygna³ow¹ w transfekowanych komórkach (rys. 2). Wyciszenie ekspresji T RII w komórkach ludzkiego glejaka hamowa³o inwazyjnoœæ induko- BIOTECHNOLOGIA 3 (90)
13 Bo ena Kamiñska, Dorota Kulesza, Pawe³ Wiœniewski Rys. 2. Ocena dzia³ania zaprojektowanych shrna transkrybowanych z plazmidu na ekspresjê receptora TGF typu II (T RII). A. Schemat zaprojektowanych nukleotydów i plazmidu wyjœciowego psilencer; B. Lokalizacja sekwencji rozpoznawanych przez zaprojektowane shrna w obrêbie drugorzêdowej struktury mrna T RII; C. Ocena dzia³ania shrna kodowanych przez plazmidy na poziomie mrna (C), ekspresji bia³ka (D) oraz œcie ki sygna³owej Smad zale nej od aktywacji receptora (E); zmodyfikowane wed³ug rozprawy doktorskiej Aleksandry Weso³owskiej. 106 PRACE PRZEGL DOWE
14 Wykorzystanie interferencji RNA do opracowywania nowych terapii przeciwnowotworowych wan¹ przez cytokinê w badaniach in vitro. W badaniach nad regulacj¹ migracji i inwazyjnoœci komórek glejaka w modelu zwierzêcym wykorzystano stabilnie modyfikowane linie glejaka, w których za pomoc¹ zaprojektowanych shrna, trwale wyciszono ekspresjê receptora TGF- 1 typu II. Stwierdzono, e linie niezdolne do odpowiedzi na egzogenny TGF- 1 po wszczepieniu do zwierz¹t tworz¹ dwukrotnie mniejsze guzy (67). Plazmidy koduj¹ce shrna wyciszaj¹ce receptor TGF- 1 mog¹ byæ zatem nowym narzêdziem do terapii genowej. Wytworzone plazmidy s¹ obecnie testowane w zwierzêcym modelu zale nego od TGF- zw³óknienia p³uc. Nietypowe, bo nie poprzedzone badaniami na hodowanych in vitro komórkach czy zwierzêtach, jest zastosowanie dwuniciowego RNA przeciwko tenascynie w terapii guzów mózgu u ludzi (81,82). Mimo e opisane w pracach dwuniciowe ATN-RNA nie spe³nia regu³, autorzy opisuj¹ jego dzia³anie terapeutyczne oparte na mechanizmie RNAi. Glejaki s¹ najczêstszymi pierwotnymi guzami mózgu, a ich najbardziej z³oœliw¹ form¹ jest glejak wielopostaciowy (GBM, ang. Glioblastoma Multiforme). Nale ¹ one do najtrudniejszych do leczenia nowotworów. We wzmiankowanych badaniach podawano dwuniciowe RNA o sekwencji homologicznej do mrna tenascyny C, syntetyzowane enzymatycznie przez polimerazy T3 i T7, i przekszta³cane w dwuniciowe 164-nukleotydowe RNA (ATN-RNA). Wprowadzenie ATN-RNA do komórek glejakach wyizolowanych z guza i hodowanych in vitro ju po 24 godz. w 80% obni a³o poziom mrna tenascyny C. Bior¹c pod uwagê, e komórki glejaka wyizolowane z guzów s³abo siê transfekuj¹ (od kilku do kilkunastu procent), a efekty wyciszenia s¹ zwykle widoczne po godz., uzyskane takiego wyniku po 24 godzinach jest ma³o wiarygodne. Autorzy przeprowadzili œródoperacyjne podania dwuniciowego ATN-RNA do guzów o wysokim stopniu z³oœliwoœci (III i IV) u 10 chorych po chirurgicznym usuniêciu masy guza. Po 10 tygodniach oceniano wielkoœæ guzów za pomoc¹ tomografii komputerowej i wykazano, e wznowa wysoko z³oœliwego glejaka po podaniu ATN-RNA by³a zahamowana (81). W kolejnym badaniu liczba traktowanych pacjentów zosta³a zwiêkszona do 46 i stwierdzono przed³u enie okresu prze ycia o 3,5 tyg. w porównaniu z grup¹ chorych poddanych tylko brachyterapii (82). Ze wzglêdu na brak grupy kontrolnej, analizy statystycznej oraz brak przekonuj¹cych wyników z badañ na komórkach, ocena wyników badañ jest niemo - liwa. Bior¹c pod uwagê, e 164-nukleotydowe ATN-RNA jest doœæ d³ugie i posiada wolne koñce jako efekt syntezy enzymatycznej, najbardziej prawdopodobne jest to, e ma ono dzia³anie immunomoduluj¹ce i mo e indukowaæ odpowiedÿ interferonow¹, zatem nie mo na stwierdziæ, e chodzi tu o dzia³anie oparte na mechanizmie RNAi. Pomimo licznych i spektakularnych sukcesów specyficznego wyciszenia genów w komórkach nowotworowych in vitro i in vivo, identyfikacja efektywnie dzia³aj¹cych sirna/shrna i wykorzystanie optymalnych sposobów dostarczania sirna lub DNA plazmidowego pozostaje du ym wyzwaniem. BIOTECHNOLOGIA 3 (90)
15 Bo ena Kamiñska, Dorota Kulesza, Pawe³ Wiœniewski 5. Badania przedkliniczne i kliniczne czynników terapeutycznych wykorzystuj¹cych proces RNAi Technologia RNAi skupi³a uwagê przemys³u farmaceutycznego jako alternatywa dla konwencjonalnych zwi¹zków chemicznych u ywanych jako czynniki terapeutyczne. Podstawowym powodem jest niew¹tpliwie ³atwoœæ projektowania specyficznych sirna i wysoka specyficznoœæ dzia³ania cz¹steczek sirna, lecz równie istotnym, jak siê wydaje, jest relatywnie krótki czas rozwoju produktu leczniczego (17-28 miesiêcy) w porównaniu z tradycyjnymi, niskocz¹steczkowymi zwi¹zkami (42-66 miesiêcy), a tak e rekombinowanymi bia³kami czy przeciwcia³ami (27-50 miesiêcy). Pierwsze wyniki badañ przedklinicznych z wykorzystaniem syntetycznych cz¹steczek RNA zosta³y opublikowane przez Bitko i wsp. w roku 2005 na ³amach Nature Medicine (83). Badania te dotyczy³y wp³ywu sirna na dwa wirusowe patogeny uk³adu oddechowego: wirus RSV (ang. Respiratory Syncytial Virus) oraz PIV (ang. Parainfluenza Virus) wywo³uj¹ce wysok¹ œmiertelnoœci¹. Na podstawie wyników badañ przedklinicznych sugerowano, e lokalne podawanie sirna, zw³aszcza w okolicy nab³onka dróg oddechowych, mo e byæ bardziej skuteczne ni systemowe. Bitko i wsp. (83) podawali syntetyzowane chemicznie sirna przeciwko wirusom RSV i PIV do wnêtrza nosa zwierz¹t zaka onych wirusami, co w 99% zahamowa³o replikacjê wirusów i w konsekwencji ochroni³o przed uszkodzeniem p³uc. Nie stwierdzono efektów ubocznych i indukcji odpowiedzi interferonowej. Wyniki tych badañ zainicjowa³y wkrótce seriê badañ klinicznych z wykorzystaniem technologii RNAi. Ju pó³ roku póÿniej firma Sirna Therapeutics (Boulder, CO, USA) zaprezentowa³a wyniki badañ klinicznych z wykorzystaniem produktu opartego na tej technologii. Najbardziej zaawansowane programy kliniczne dotycz¹ obecnie zwi¹zanego z wiekiem zwyrodnienia plamki ó³tej. Choroby oczu zwróci³y uwagê badaczy g³ównie z powodu relatywnie niskiego poziomu rybonukleaz enzymów degraduj¹cych cz¹steczki RNA, w œrodowisku oka. Umo liwia³o to podawanie leków opartych na technologii RNAi w niezmienionej postaci wprost do miejsca, w którym lek ma dzia³aæ. Bezsprzeczn¹ korzyœci¹ w tym podejœciu jest eliminacja wszelkich kwestii zwi¹zanych z dostarczaniem cz¹steczek do organizmu i ich stabilnoœci¹. To z kolei sprawia, e cz¹steczki sirna czy shrna mog¹ staæ siê w bardzo krótkim czasie powszechnie wykorzystywanymi produktami leczniczymi stosowanymi w terapii chorób oczu. 108 PRACE PRZEGL DOWE
16 Wykorzystanie interferencji RNA do opracowywania nowych terapii przeciwnowotworowych Przegl¹d produktów wykorzystuj¹cych technologiê RNAi obecnie testowanych w badaniach klinicznych Firma Produkt Gen docelowy Choroba Acuity Pharmaceuticals /Opko Health Inc. Acuity Pharmaceuticals /Opko Health Inc. Sposób dostarczania Bevasiranib VEGF zwyrodnienie plamki ó³tej Bevasiranib VEGF cukrzycowy obrzêk plamki ó³tej Aegera Therapeutics AEG35156 XIAP limfocytarna bia³aczka przewlek³a, limfoma limfocytów B Allergan/Merck AGN receptor VEGF zwyrodnienie plamki ó³tej Alnylam Pharmaceuticals ALN-RSV01 bia³ko nukleokapsydu RSV wirusa RSV Benitec sidrzt Tat/rev, CCR5, HIV/AIDS TAR (3 shrna) Calando Pharmaceuticals CALAA-01 reduktaza rybonukleotydowa Merck/Sirna Therapeutics Sirna-027 zwyrodnienie plamki ó³tej Nucleonics NUC B100 Pre-gen./pre-C, Pre-S1, Pre-S2/S, X (4 shrna) Quark Pharmaceuticals /Pfizer Quark Pharmaceuticals /Pfizer œródocznie domiejscowo obwodowo œródocznie donosowo lub wziewnie wektor lentiwirusowy faza III Tabela 2 Status faza II zakoñczone faza I/II faza II faza II zakoñczone faza I guzy lite obwodowo faza I zapalenie w¹troby typu B RTP-801i-14 RTP-801 zwyrodnienie plamki ó³tej RTP-801i-14 RTP-801 cukrzycowy obrzêk plamki ó³tej obwodowo œródocznie domiejscowo faza II faza I faza I/II faza II Quark Pharmaceuticals AKIi-5 p53 ostra niewydolnoœæ nerek obwodowo faza I Santaris Pharmaceuticals SPC3649 wirusowe zapalenie faza I w¹troby typu C Senetec PLC ATN-RNA glejak wielopostaciowy faza I TransDerm Inc. TD101 keratyna 6a z mutacj¹ wrodzone zgrubienie œródskórnie faza I b N171K paznokci Silence Therapeutics AG Atu027 kinaza bia³kowa guzy lite infuzyjnie faza I N3 Tekmira Pharmaceuticals PRO ApoB hipercholesterolemia infuzyjnie faza I Corporation CombiMatrix wirusowe zapalenie faza przedkliniczna w¹troby typu C CombiMatrix HIV/AIDS faza przedkliniczna Merck & Co Inc. Sirna-034 wirusowe zapalenie w¹troby typu C faza przedkliniczna BIOTECHNOLOGIA 3 (90)
17 Bo ena Kamiñska, Dorota Kulesza, Pawe³ Wiœniewski Nastech genom wirusa grypy grypa Protiva genom wirusowy zapalenie w¹troby typu B i C, wirus Ebola, wirus Marbuga Tacere Therapeutics TT obszary genomu wirusa HCV zapalenie w¹troby typu C faza przedkliniczna faza przedkliniczna faza przedkliniczna W tabeli 2 zestawiono informacje o prowadzonych aktualnie badaniach klinicznych wykorzystuj¹cych sirna lub shrna. Dane pochodz¹ ze strony internetowej clinicaltrials.gov, doniesieñ prasowych umieszczonych w internecie oraz stron firm, które przeprowadza³y te badania. Wœród chorób zakaÿnych najdalej posuniête prace zwi¹zane s¹ z eliminacj¹ wirusa RSV wywo³uj¹cego infekcje zarówno górnych jak i dolnych dróg oddechowych. Pomyœlnie zakoñczone w lipcu 2009 r. badania kliniczne II fazy przeprowadzone przez firmê Alnylam Pharmaceuticals obejmowa³y grupê doros³ych pacjentów po przeszczepie p³uca, u których w naturalny sposób dochodzi³o do zaka enia tym wirusem. Badany produkt podawany by³ donosowo, co w du ej mierze redukowa³o problemy wystêpuj¹ce przy podawaniu tego typu cz¹steczek obwodowo. Ciekawe podejœcie do problemu eliminacji wirusów HIV i HBV wywo³uj¹cych odpowiednio: AIDS i wirusowe zapalenie w¹troby typu B, zaprezentowa³y firmy Benitec oraz Nucleonics. W przeciwieñstwie do wiêkszoœci produktów skierowanych przeciwko jednemu tylko genowi, umieœci³y one w wektorach, odpowiednio lentiwirusowym i plazmidowym, od 3 do 4 sekwencji shrna skierowanych przeciwko ró - nym genom w genomie wirusów HIV i HBV. Mimo e poziom wyciszenia genów prawie nigdy nie jest ca³kowity, jednoczesna degradacja transkryptów kilku genów podstawowych dla namna ania siê wirusów mo e okazaæ siê zaskakuj¹co dobr¹ strategi¹ i byæ wykorzystana w leczeniu pacjentów zaka onych tymi wirusami. Technologia RNAi, jak siê wydaje, posiada ogromny potencja³ do rozwoju produktów leczniczych o wysokiej specyficznoœci dzia³ania. Niemniej jednak pozostaje kilka kwestii do rozwi¹zania zanim bêdziemy mogli myœleæ o tej technologii jako substytucie obecnie stosowanych terapii. Podstawowym problemem s¹ trudnoœci w dostarczaniu cz¹steczek sirna do miejsc ich dzia³ania przy podawaniu ich bezpoœrednio do krwiobiegu, a co za tym idzie k³opoty z ich stabilnoœci¹ w tym œrodowisku. Badania nad stabilnoœci¹ sirna i ich aktywnoœci¹ prowadzone s¹ od wielu lat, co uwidacznia skalê podnoszonego problemu (84,85). Inn¹ nie w pe³ni wyjaœnion¹ kwesti¹ pozostaje problem ograniczenia niespecyficznego wp³ywu sirna/shrna na ekspresjê genów innych ni docelowe (ang. off-target effects), poza wczeœniej opisywan¹ indukcj¹ odpowiedzi interferonowej (86). Na podstawie wyników badañ Scacheri i wsp. (87) wykazano zmiany ekspresji p53 oraz p21 WAF1 przez niektóre 110 PRACE PRZEGL DOWE
18 Wykorzystanie interferencji RNA do opracowywania nowych terapii przeciwnowotworowych z 10 sirna wyciszaj¹cych ekspresjê MEN1 (ang. Multiple Endocrine Neoplasia, type I). Autorzy sugerowali, e sirna mog¹ wywo³ywaæ niespecyficzny, ale zale ny od sekwencji wp³yw dzia³aj¹c na nieznane cele komórkowe. Autorzy spekulowali, e czêœciowa komplementarnoœæ sekwencji sirna do genów innych ni docelowe mo e wp³ywaæ na translacjê, w sposób podobny do wywo³ywanego przez mirna (87). Te dwie kwestie, jak siê wydaje, s¹ g³ównymi przeszkodami na drodze opracowywania terapii opartych na technologii RNAi. Literatura 1. Fire A., Xu S., Montgomery M. K., Kostas S. A., Driver S. E., Mello C. C., (1998), Nature, 391, Hamilton A. J., Baulcombe D. C., (1999), Science, 286, Tuschl T., Zamore P. D., Lehmann R., Bartel D. P., Sharp P. A., (1999), Genes Dev., 13, Zamore P. D., Tuschl T., Sharp P. A., Bartel D. P., (2000), Cell, 101, Elbashir S. M., Lendeckel W., Tuschl T., (2001), Genes Dev., 15, Hammond S. M., Bernstein E., Beach D., Hannon G. J., (2000), Nature, 404, Elbashir S. M., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin A., Weber K., Tuschl T., (2001), Nature, 411, Szweykowska-Kuliñska Z., Szarzyñska B., Sobkowiak., Jarmo³owski A., (2009), Postêpy Biologii Komórki, 36, Mello C. C., Conte D., Jr., (2004), Nature, 431, Bernstein E., Caudy A. A., Hammond S. M., Hannon G. J., (2001), Nature, 409, Chendrimada T. P., Gregory R. I., Kumaraswamy E., Norman J., Cooch N., Nishikura K., Shiekhattar R., (2005), Nature, 436, Martinez J., Tuschl T., (2004), Genes Dev., 18, Azuma-Mukai A., Oguri H., Mituyama T., Qian Z. R., Asai K., Siomi H., Siomi M. C., (2008), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, Lee R. C., Ambros V., (2001), Science, 294, Jinek M., Doudna J. A., (2009), Nature, 457, Winter J., Jung S., Keller S., Gregory R. I., Diederichs S., (2009), Nat. Cell Biol., 11, Volpe T. A., Kidner C., Hall I. M., Teng G., Grewal S. I., Martienssen R. A., (2002), Science, 297, Hall I. M., Shankaranarayana G. D., Noma K., Ayoub N., Cohen A., Grewal S. I., (2002), Science, 297, Yuan B., Latek R., Hossbach M., Tuschl T., Lewitter F., (2004), Nucleic Acids Res., 32, W Reynolds A., Leake D., Boese Q., Scaringe S., Marshall W. S., Khvorova A., (2004), Nat. Biotechnol., 22, Jackson A. L., Bartz S. R., Schelter J., Kobayashi S. V., Burchard J., Mao M., Li B., Cavet G., Linsley P. S., (2003), Nat. Biotechnol., 21, Yoneyama M., Fujita T., (2008), Immunity, 29, Goodchild A., Nopper N., King A., Doan T., Tanudji M., Arndt G. M., Poidinger M., Rivory L. P., Passioura T., (2009), BMC Immunol., 10, Rossi J. J., (2009), Gene Ther., 16, McCaffrey A. P., Meuse L., Pham T. T., Conklin D. S., Hannon G. J., Kay M. A., (2002), Nature, 418, Song E., Lee S. K., Wang J., Ince N., Ouyang N., Min J., Chen J., Shankar P., Lieberman J., (2003), Nat. Med., 9, Aagaard L., Rossi J. J., (2007), Adv. Drug Deliv. Rev., 59, BIOTECHNOLOGIA 3 (90)
19 Bo ena Kamiñska, Dorota Kulesza, Pawe³ Wiœniewski 28. Ge Q., Dallas A., Ilves H., Shorenstein J., Behlke M. A., Johnston B. H., (2010), RNA, 16, Wang S. L., Yao H. H., Qin Z. H., (2009), Expert Opin. Biol. Ther., 9, Weinstein I. B., Joe A., (2008), Cancer Res., 68, Kortylewski M., Swiderski P., Herrmann A., Wang L., Kowolik C., Kujawski M., Lee H., Scuto A., Liu Y., Yang C., Deng J., Soifer H. S., Raubitschek A., Forman S., Rossi J. J., Pardoll D. M., Jove R., Yu H., (2009), Nat. Biotechnol., 27, Gao L., Zhang L., Hu J., Li F., Shao Y., Zhao D., Kalvakolanu D. V., Kopecko D. J., Zhao X., Xu D. Q., (2005), Clin. Cancer Res., 11, Zhang L., Gao L., Zhao L., Guo B., Ji K., Tian Y., Wang J., Yu H., Hu J., Kalvakolanu D. V., Kopecko D. J., Zhao X., Xu D. Q., (2007), Cancer Res., 67, Zhang L., Gao L., Li Y., Lin G., Shao Y., Ji K., Yu H., Hu J., Kalvakolanu D. V., Kopecko D. J., Zhao X., Xu D. Q., (2008), Clin. Cancer Res., 14, Landen C. N., Jr., Lin Y. G., Armaiz Pena G. N., Das P. D., Arevalo J. M., Kamat A. A., Han L. Y., Jennings N. B., Spannuth W. A., Thaker P. H., Lutgendorf S. K., Savary C. A., Sanguino A. M., Lopez-Berestein G., Cole S. W., Sood A. K., (2007), Cancer Res., 67, Li J., Piao Y. F., Jiang Z., Chen L., Sun H. B., (2009), World J. Gastroenterol., 15, Alshamsan A., Hamdy S., Samuel J., El-Kadi A. O., Lavasanifar A., Uludag H., (2010), Biomaterials, 31, Song E., Zhu P., Lee S. K., Chowdhury D., Kussman S., Dykxhoorn D. M., Feng Y., Palliser D., Weiner D. B., Shankar P., Marasco W. A., Lieberman J., (2005), Nat. Biotechnol., 23, Gulhati P., Cai Q., Li J., Liu J., Rychahou P. G., Qiu S., Lee E. Y., Silva S. R., Bowen K. A., Gao T., Evers B. M., (2009), Clin. Cancer Res., 15, Pawelek J. M., Low K. B., Bermudes D., (1997), Cancer Res., 57, Low K. B., Ittensohn M., Le T., Platt J., Sodi S., Amoss M., Ash O., Carmichael E., Chakraborty A., Fischer J., Lin S. L., Luo X., Miller S. I., Zheng L., King I., Pawelek J. M., Bermudes D., (1999), Nat. Biotechnol., 17, Hu-Lieskovan S., Heidel J. D., Bartlett D. W., Davis M. E., Triche T. J., (2005), Cancer Res., 65, Pille J. Y., Li H., Blot E., Bertrand J. R., Pritchard L. L., Opolon P., Maksimenko A., Lu H., Vannier J. P., Soria J., Malvy C., Soria C., (2006), Hum. Gene Ther., 17, Jang J. Y., Choi Y., Jeon Y. K., Kim C. W., (2008), Breast Cancer Res., 10, R Poeck H., Besch R., Maihoefer C., Renn M., Tormo D., Morskaya S. S., Kirschnek S., Gaffal E., Landsberg J., Hellmuth J., Schmidt A., Anz D., Bscheider M., Schwerd T., Berking C., Bourquin C., Kalinke U., Kremmer E., Kato H., Akira S., Meyers R., Hacker G., Neuenhahn M., Busch D., Ruland J., Rothenfusser S., Prinz M., Hornung V., Endres S., Tuting T., Hartmann G., (2008), Nat. Med., 14, McNamara J. O., 2 nd, Andrechek E. R., Wang Y., Viles K. D., Rempel R. E., Gilboa E., Sullenger B. A., Giangrande P. H., (2006), Nat. Biotechnol., 24, Wang Y., Tao Z. Z., Chen S. M., Xiao B. K., Zhou X. H., Liu J. P., (2008), Cancer Biol. Ther., 7, Chen J., Wall N. R., Kocher K., Duclos N., Fabbro D., Neuberg D., Griffin J. D., Shi Y., Gilliland D. G., (2004), J. Clin. Invest., 113, Stegh A. H., Kesari S., Mahoney J. E., Jenq H. T., Forloney K. L., Protopopov A., Louis D. N., Chin L., DePinho R. A., (2008), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, Zhang Y., Wang Y., Gao W., Zhang R., Han X., Jia M., Guan W., (2006), Breast Cancer Res. Treat., 96, Dai Y., Qiao L., Chan K. W., Yang M., Ye J., Zhang R., Ma J., Zou B., Lam C. S., Wang J., Pang R., Tan V. P., Lan H. Y., Wong B. C., (2009), Mol. Cancer Ther., 8, Vogler M., Walczak H., Stadel D., Haas T. L., Genze F., Jovanovic M., Gschwend J. E., Simmet T., Debatin K. M., Fulda S., (2008), Cancer Res., 68, Pan Q., Liu B., Liu J., Cai R., Liu X., Qian C., (2008), Acta Oncol., 47, He X. W., Liu T., Chen Y. X., Cheng D. J., Li X. R., Xiao Y., Feng Y. L., (2008), Cancer Gene Ther., 15, PRACE PRZEGL DOWE
20 Wykorzystanie interferencji RNA do opracowywania nowych terapii przeciwnowotworowych 55. Wang J., Shi Y. Q., Yi J., Ye S., Wang L. M., Xu Y. P., He M., Kong X. M., (2008), J. Dig. Dis., 9, He X. W., Yu X., Liu T., Yu S. Y., Chen D. J., (2008), Chin. Med. J. (Engl), 121, Gillespie D. L., Whang K., Ragel B. T., Flynn J. R., Kelly D. A., Jensen R. L., (2007), Clin. Cancer Res., 13, Kamlah F., Eul B. G., Li S., Lang N., Marsh L. M., Seeger W., Grimminger F., Rose F., Hanze J., (2009), Cancer Gene Ther., 16, Landen C. N., Jr., Chavez-Reyes A., Bucana C., Schmandt R., Deavers M. T., Lopez-Berestein G., Sood A. K., (2005), Cancer Res., 65, Zhang Y., Zhang Y. F., Bryant J., Charles A., Boado R. J., Pardridge W. M., (2004), Clin. Cancer Res., 10, Mikhaylova M., Stasinopoulos I., Kato Y., Artemov D., Bhujwalla Z. M., (2009), Cancer Gene Ther., 16, Zhang Z., Yang X., Zhang Y., Zeng B., Wang S., Zhu T., Roden R. B., Chen Y., Yang R., (2006), Clin. Cancer Res., 12, Yoshizawa T., Hattori Y., Hakoshima M., Koga K., Maitani Y., (2008), Eur. J. Pharm. Biopharm., 70, Dong K., Wang R., Wang X., Lin F., Shen J. J., Gao P., Zhang H. Z., (2009), Breast Cancer Res. Treat., 113, Zamora-Avila D. E., Zapata-Benavides P., Franco-Molina M. A., Saavedra-Alonso S., Trejo-Avila L. M., Resendez-Perez D., Mendez-Vazquez J. L., Isaias-Badillo J., Rodriguez-Padilla C., (2009), Cancer Gene Ther., 16, Shi X. H., Liang Z. Y., Ren X. Y., Liu T. H., (2009), Cancer Gene Ther., 16, Wesolowska A., Kwiatkowska A., Slomnicki L., Dembinski M., Master A., Sliwa M., Franciszkiewicz K., Chouaib S., Kaminska B., (2008), Oncogene, 27, Halder J., Kamat A. A., Landen C. N., Jr., Han L. Y., Lutgendorf S. K., Lin Y. G., Merritt W. M., Jennings N. B., Chavez-Reyes A., Coleman R. L., Gershenson D. M., Schmandt R., Cole S. W., Lopez-Berestein G., Sood A. K., (2006), Clin. Cancer Res., 12, Tsutsumi K., Yamaura T., Nakajima M., Honda T., Kasaoka T., (2009), Cancer Biol. Ther., 8, Tsutsumi K., Kasaoka T., Park H. M., Nishiyama H., Nakajima M., Honda T., (2008), Int. J. Oncol., 33, Li S., Dong W., Zong Y., Yin W., Jin G., Hu Q., Huang X., Jiang W., Hua Z. C., (2007), Mol. Ther., 15, Stein U., Walther W., Stege A., Kaszubiak A., Fichtner I., Lage H., (2008), Mol. Ther., 16, Shi Z., Liang Y. J., Chen Z. S., Wang X. W., Wang X. H., Ding Y., Chen L. M., Yang X. P., Fu L. W., (2006), Cancer Biol. Ther., 5, Pan G. D., Yang J. Q., Yan L. N., Chu G. P., Liu Q., Xiao Y., Yuan L., (2009), World J. Gastroenterol., 15, Kunigal S., Lakka S. S., Gondi C. S., Estes N., Rao J. S., (2007), Int. J. Cancer, 121, Zhou H., Tang Y., Liang X., Yang X., Yang J., Zhu G., Zheng M., Zhang C., (2009), Int. J. Cancer, 125, Zhao F., Zhang Q., Kang C., Cui X., Wang T., Xu P., Zhou X., Liu J., Song X., (2009), Med. Oncol., DOI , X. 78. Jonson A. L., Rogers L. M., Ramakrishnan S., Downs L. S., Jr., (2008), Gynecol. Oncol., 111, Fujii T., Saito M., Iwasaki E., Ochiya T., Takei Y., Hayashi S., Ono A., Hirao N., Nakamura M., Kubushiro K., Tsukazaki K., Aoki D., (2006), Int. J. Oncol., 29, Li X., Liu X., Li C. Y., Ding Y., Chau D., Li G., Kung H. F., Lin M. C., Peng Y., (2006), Int. J. Oncol., 29, Zukiel R., Nowak S., Wyszko E., Rolle K., Gawronska I., Barciszewska M. Z., Barciszewski J., (2006), Cancer Biol. Ther., 5, Rolle K., Nowak S., Wyszko E., Nowak M., Zukiel R., Piestrzeniewicz R., Gawronska I., Barciszewska M. Z., Barciszewski J., (2010), Cancer Biol. Ther., 9, (w druku). BIOTECHNOLOGIA 3 (90)
TERAPIA GENOWA. dr Marta Żebrowska
TERAPIA GENOWA dr Marta Żebrowska Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki, Zakładu Biochemii Farmaceutycznej, Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Źródło zdjęcia: httpblog.ebdna.plindex.phpjednoznajwiekszychzagrozenludzkosciwciazniepokonane
Bardziej szczegółowoBadanie funkcji genu
Badanie funkcji genu Funkcję genu można zbadać różnymi sposobami Przypadkowa analizy funkcji genu MUTACJA FENOTYP GEN Strategia ukierunkowanej analizy funkcji genu GEN 1. wprowadzenie mutacji w genie 2.
Bardziej szczegółowoTematy prac licencjackich w Zakładzie Fizjologii Zwierząt
Tematy prac licencjackich w Zakładzie Fizjologii Zwierząt Zegar biologiczny Ekspresja genów i białek zegara Rytmy komórkowe Rytmy fizjologiczne Rytmy behawioralne Lokalizacja neuroprzekźników w układzie
Bardziej szczegółowoBadanie funkcji genu
Badanie funkcji genu Funkcję genu można zbadać różnymi sposobami Przypadkowa analizy funkcji genu MUTACJA FENOTYP GEN Strategia ukierunkowanej analizy funkcji genu GEN 1. wprowadzenie mutacji w genie 2.
Bardziej szczegółowoNowe oblicze RNA. Józef Dulak. Zakład Biotechnologii Medycznej Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytet Jagielloński
Nowe oblicze RNA Józef Dulak DMB Zakład Biotechnologii Medycznej Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytet Jagielloński biotka.mol.uj.edu.pl/~hemeoxygenase 9 grudnia 2006 Regulacja ekspresji
Bardziej szczegółowoProducent P.P.F. HASCO-LEK S.A nie prowadził badań klinicznych mających na celu określenie skuteczności produktów leczniczych z ambroksolem.
VI.2 Podsumowanie danych o bezpieczeństwie stosowania produktów leczniczych z ambroksolem VI.2.1 Omówienie rozpowszechnienia choroby Wskazania do stosowania: Ostre i przewlekłe choroby płuc i oskrzeli
Bardziej szczegółowoGdzie chirurg nie może - - tam wirusy pośle. czyli o przeciwnowotworowych terapiach wirusowych
Gdzie chirurg nie może - - tam wirusy pośle czyli o przeciwnowotworowych terapiach wirusowych Wirusy zwiększające ryzyko rozwoju nowotworów HBV EBV HCV HTLV HPV HHV-8 Zmniejszenie liczby zgonów spowodowanych
Bardziej szczegółowoTEST dla stanowisk robotniczych sprawdzający wiedzę z zakresu bhp
TEST dla stanowisk robotniczych sprawdzający wiedzę z zakresu bhp 1. Informacja o pracownikach wyznaczonych do udzielania pierwszej pomocy oraz o pracownikach wyznaczonych do wykonywania działań w zakresie
Bardziej szczegółowoUrząd Miasta Bielsko-Biała - um.bielsko.pl Wygenerowano: 2016-06-17/10:16:18
Europejski Dzień Prostaty obchodzony jest od 2006 roku z inicjatywy Europejskiego Towarzystwa Urologicznego. Jego celem jest zwiększenie społecznej świadomości na temat chorób gruczołu krokowego. Gruczoł
Bardziej szczegółowoSPIS TREŚCI SPIS SKRÓTÓW... 1 WSTĘP... 3 POMIARY CUNÓW NA CZŁOWIEKU... 5 GŁĘBOKOŚĆ NAKŁUCIA PRZYŻEGANIE LOKALIZACJA PUNKTÓW
SPIS TREŚCI SPIS SKRÓTÓW... 1 WSTĘP... 3 POMIARY CUNÓW NA CZŁOWIEKU.... 5 GŁĘBOKOŚĆ NAKŁUCIA... 11 PRZYŻEGANIE... 11 LOKALIZACJA PUNKTÓW AKUPUNKTURY... 15 OPIS PUNKTÓW AKUPUNKTURY: WŁAŚCIWOŚCI I LOKALIZACJA...
Bardziej szczegółowoGenetyka niemendlowska
Genetyka niemendlowska Dziedziczenie niemendlowskie Dział genetyki zajmujący się dziedziczeniem cech/genów, które nie podporządkowuje się prawom Mendla/Morgana Chociaż dziedziczenie u wirusów, bakterii
Bardziej szczegółowoSeminarium 1: 08. 10. 2015
Seminarium 1: 08. 10. 2015 Białka organizmu ok. 15 000 g białka osocza ok. 600 g (4%) Codzienna degradacja ok. 25 g białek osocza w lizosomach, niezależnie od wieku cząsteczki, ale zależnie od poprawności
Bardziej szczegółowoKifoplastyka i wertebroplastyka
Opracowanie zawiera opis przebiegu operacji wraz ze zdjęciami śródoperacyjnymi. Zawarte obrazy mogą być źle tolerowane przez osoby wrażliwe. Jeśli nie jesteście Państwo pewni swojej reakcji, proszę nie
Bardziej szczegółowoSPIS SKRÓTÓW... 1 WSTĘP... 3 POMIARY CUNÓW NA CZŁOWIEKU
SPIS TREŚCI SPIS SKRÓTÓW... 1 WSTĘP... 3 POMIARY CUNÓW NA CZŁOWIEKU H. Dyczek.... 5 GŁĘBOKOŚĆ NAKŁUCIA H. Dyczek... 11 PRZYŻEGANIE H. Dyczek... 11 LOKALIZACJA PUNKTÓW AKUPUNKTURY H. Dyczek... 15 OPIS PUNKTÓW
Bardziej szczegółowoTomograficzne obrazowanie zmian ogniskowych w nerkach
Tomograficzne obrazowanie zmian ogniskowych w nerkach Zmiany ogniskowe w nerkach torbielowate łagodne guzy lite złośliwe guzy lite Torbielowate Torbiel prosta (niepowikłana) 50% populacji powyżej 50 r.ż.
Bardziej szczegółowoRNAi w terapii. 1. Wstêp. Katarzyna Kubiak, Barbara Nawrot. RNAi in therapy
PRACE PRZEGL DOWE RNAi w terapii Katarzyna Kubiak, Barbara Nawrot Zak³ad Chemii Bioorganicznej, Centrum Badañ Molekularnych i Makromolekularnych, Polska Akademia Nauk, ódÿ RNAi in therapy Summary The discovery
Bardziej szczegółowoTRANSLACJA II etap ekspresji genów
TRANSLACJA II etap ekspresji genów Tłumaczenie informacji genetycznej zawartej w mrna (po transkrypcji z DNA) na aminokwasy budujące konkretne białko. trna Operon (wg. Jacob i Monod) Zgrupowane w jednym
Bardziej szczegółowoOd redakcji. Symbolem oznaczono zadania wykraczające poza zakres materiału omówionego w podręczniku Fizyka z plusem cz. 2.
Od redakcji Niniejszy zbiór zadań powstał z myślą o tych wszystkich, dla których rozwiązanie zadania z fizyki nie polega wyłącznie na mechanicznym przekształceniu wzorów i podstawieniu do nich danych.
Bardziej szczegółowoKomunikat 16 z dnia 2015-05-07 dotyczący aktualnej sytuacji agrotechnicznej
Komunikat 16 z dnia 2015-05-07 dotyczący aktualnej sytuacji agrotechnicznej www.sad24.com Wszystkie poniższe informacje zostały przygotowane na podstawie obserwacji laboratoryjnych oraz lustracji wybranych
Bardziej szczegółowoPRAWA ZACHOWANIA. Podstawowe terminy. Cia a tworz ce uk ad mechaniczny oddzia ywuj mi dzy sob i z cia ami nie nale cymi do uk adu za pomoc
PRAWA ZACHOWANIA Podstawowe terminy Cia a tworz ce uk ad mechaniczny oddzia ywuj mi dzy sob i z cia ami nie nale cymi do uk adu za pomoc a) si wewn trznych - si dzia aj cych na dane cia o ze strony innych
Bardziej szczegółowoBadanie funkcji genu
Badanie funkcji genu Funkcję genu można zbadać różnymi sposobami Przypadkowa analizy funkcji genu MUTACJA FENOTYP GEN Strategia ukierunkowanej analizy funkcji genu GEN 1. wprowadzenie mutacji w genie 2.
Bardziej szczegółowoEfektywna strategia sprzedaży
Efektywna strategia sprzedaży F irmy wciąż poszukują metod budowania przewagi rynkowej. Jednym z kluczowych obszarów takiej przewagi jest efektywne zarządzanie siłami sprzedaży. Jak pokazują wyniki badania
Bardziej szczegółowoLECZENIE NIEDOKRWISTOŚCI W PRZEBIEGU PRZEWLEKŁEJ NIEWYDOLNOŚCI
Załącznik nr 14 do Zarządzenia Nr 41/2009 Prezesa NFZ z dnia 15 września 2009 roku Nazwa programu: LECZENIE NIEDOKRWISTOŚCI W PRZEBIEGU PRZEWLEKŁEJ NIEWYDOLNOŚCI NEREK ICD-10 N 18 przewlekła niewydolność
Bardziej szczegółowoUrząd Miasta Bielsko-Biała - um.bielsko.pl Wygenerowano: 2016-06-30/02:29:36. Wpływ promieni słonecznych na zdrowie człowieka
Wpływ promieni słonecznych na zdrowie człowieka Światło słoneczne jest niezbędne do trwania życia na Ziemi. Dostarcza energii do fotosyntezy roślinom co pomaga w wytwarzaniu tlenu niezbędnego do życia.
Bardziej szczegółowoprobiotyk o unikalnym składzie
~s~qoy[jg probiotyk o unikalnym składzie ecovag, kapsułki dopochwowe, twarde. Skład jednej kapsułki Lactobacillus gasseri DSM 14869 nie mniej niż 10 8 CFU Lactobacillus rhamnosus DSM 14870 nie mniej niż
Bardziej szczegółowoMłodzieńcze spondyloartropatie/zapalenie stawów z towarzyszącym zapaleniem przyczepów ścięgnistych (mspa-era)
www.printo.it/pediatric-rheumatology/pl/intro Młodzieńcze spondyloartropatie/zapalenie stawów z towarzyszącym zapaleniem przyczepów ścięgnistych (mspa-era) Wersja 2016 1. CZYM SĄ MŁODZIEŃCZE SPONDYLOARTROPATIE/MŁODZIEŃCZE
Bardziej szczegółowoProgramy badań przesiewowych Wzrok u diabetyków
Programy badań przesiewowych Wzrok u diabetyków Dokładniejsze badania i leczenie retinopatii cukrzycowej Closer monitoring and treatment for diabetic retinopathy Ważne informacje o ochronie zdrowia Important
Bardziej szczegółowoHormony płciowe. Macica
Hormony płciowe Macica 1 Estrogeny Działanie estrogenów Działanie na układ rozrodczy (macica, endometrium, pochwa) Owulacja Libido Przyspieszenie metabolizmu Zwiększenie ilości tkanki tłuszczowej Tworzenie
Bardziej szczegółowo1. Od kiedy i gdzie należy złożyć wniosek?
1. Od kiedy i gdzie należy złożyć wniosek? Wniosek o ustalenie prawa do świadczenia wychowawczego będzie można składać w Miejskim Ośrodku Pomocy Społecznej w Puławach. Wnioski będą przyjmowane od dnia
Bardziej szczegółowoRegulamin Konkursu Start up Award 9. Forum Inwestycyjne 20-21 czerwca 2016 r. Tarnów. Organizatorzy Konkursu
Regulamin Konkursu Start up Award 9. Forum Inwestycyjne 20-21 czerwca 2016 r. Tarnów 1 Organizatorzy Konkursu 1. Organizatorem Konkursu Start up Award (Konkurs) jest Fundacja Instytut Studiów Wschodnich
Bardziej szczegółowoHAŚKO I SOLIŃSKA SPÓŁKA PARTNERSKA ADWOKATÓW ul. Nowa 2a lok. 15, 50-082 Wrocław tel. (71) 330 55 55 fax (71) 345 51 11 e-mail: kancelaria@mhbs.
HAŚKO I SOLIŃSKA SPÓŁKA PARTNERSKA ADWOKATÓW ul. Nowa 2a lok. 15, 50-082 Wrocław tel. (71) 330 55 55 fax (71) 345 51 11 e-mail: kancelaria@mhbs.pl Wrocław, dnia 22.06.2015 r. OPINIA przedmiot data Praktyczne
Bardziej szczegółowoInterferencja RNA nowa technologia w leczeniu nowotworów
Interferencja RNA nowa technologia w leczeniu nowotworów RNA interference new technology in tumor treatment Marta Gabryelska 1, Stanis³aw Nowak 2, Ryszard ukiel 2, Jan Barciszewski 1 1 z Instytutu Chemii
Bardziej szczegółowoUKŁAD ROZRUCHU SILNIKÓW SPALINOWYCH
UKŁAD ROZRUCHU SILNIKÓW SPALINOWYCH We współczesnych samochodach osobowych są stosowane wyłącznie rozruszniki elektryczne składające się z trzech zasadniczych podzespołów: silnika elektrycznego; mechanizmu
Bardziej szczegółowoPROCEDURA OCENY RYZYKA ZAWODOWEGO. w Urzędzie Gminy Mściwojów
I. Postanowienia ogólne 1.Cel PROCEDURA OCENY RYZYKA ZAWODOWEGO w Urzędzie Gminy Mściwojów Przeprowadzenie oceny ryzyka zawodowego ma na celu: Załącznik A Zarządzenia oceny ryzyka zawodowego monitorowanie
Bardziej szczegółowoVI.2 Streszczenie planu zarządzania ryzykiem do publicznej wiadomości
VI.2 Streszczenie planu zarządzania ryzykiem do publicznej wiadomości VI.2.1 Epidemiologia Celovir jest lekiem zawierającym substancję czynną dizoproksyl tenofowiru w dawce 245 mg. Tenofowir w skojarzeniu
Bardziej szczegółowoAktywność ruchowa osób starszych Nordic Walking
Aktywność ruchowa osób starszych Nordic Walking Agnieszka Kwiatkowska II rok USM Proces starzenia Spadek beztłuszczowej masy ciała, wzrost procentowej zawartości tkanki tłuszczowej, Spadek siły mięśniowej,
Bardziej szczegółowoZałącznik do rozporządzenia Ministra Zdrowia z dnia 8 grudnia 2011 r.
Załącznik do rozporządzenia Ministra Zdrowia z dnia 8 grudnia 2011 r. ŚWIADCZENIOBIORCY 1. Leczenie zaawansowanego raka jelita grubego przy wykorzystaniu substancji czynnej bewacyzumab. 1.1 Kryteria kwalifikacji:
Bardziej szczegółowoWyniki przeszczepiania komórek hematopoetycznych od dawcy niespokrewnionego
Wyniki przeszczepiania komórek hematopoetycznych od dawcy niespokrewnionego W ramach realizacji projektu badawczego w³asnego finansowanego przez Ministerstwo Nauki igrano Szkolnictwa Wy szego (grant nr
Bardziej szczegółowoAutomatyczne przetwarzanie recenzji konsumenckich dla oceny użyteczności produktów i usług
Uniwersytet Ekonomiczny w Poznaniu Wydział Informatyki i Gospodarki Elektronicznej Katedra Informatyki Ekonomicznej Streszczenie rozprawy doktorskiej Automatyczne przetwarzanie recenzji konsumenckich dla
Bardziej szczegółowoEGZEMPLARZ ARCHIWALNY WZORU UŻYTKOWEGO (12,OPIS OCHRONNY. (19) PL di)62974 B62D 57/02 (2006.01) Dudek Piotr, Włocławek, PL
EGZEMPLARZ ARCHIWALNY RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12,OPIS OCHRONNY WZORU UŻYTKOWEGO (21) Numer zgłoszenia: 114126 (22) Data zgłoszenia: 11.06.2003 (19) PL di)62974
Bardziej szczegółowo3.2 Warunki meteorologiczne
Fundacja ARMAAG Raport 1999 3.2 Warunki meteorologiczne Pomiary podstawowych elementów meteorologicznych prowadzono we wszystkich stacjach lokalnych sieci ARMAAG, równolegle z pomiarami stê eñ substancji
Bardziej szczegółowoSPIS TREŒCI. Przedmowa przewodnicz¹cego Rady Naukowej Czasopisma Aptekarskiego... 13. Od Autora... 15. Rozdzia³ 1
SPIS TREŒCI Przedmowa przewodnicz¹cego Rady Naukowej Czasopisma Aptekarskiego........................... 13 Od Autora........................................... 15 Rozdzia³ 1 ROLA I ZNACZENIE FARMAKOEKONOMIKI
Bardziej szczegółowoWITAMINY. www.pandm.prv.pl
WITAMINY - wpływa na syntezę białek, lipidów, hormonów a szczególnie hormonów tarczycy - pomaga w utrzymaniu prawidłowej czynności uk.immunologicznego - pomaga w leczeniu : rozedmy płuc i nadczynności
Bardziej szczegółowoLaboratorium analityczne ZAPRASZA. do skorzystania
Laboratorium analityczne ZAPRASZA do skorzystania z promocyjnych PAKIETÓW BADAŃ LABORATORYJNYCH Pakiet I Pakiet II Pakiet III Pakiet IV Pakiet V Pakiet VI Pakiet VII Pakiet VIII Pakiet IX Pakiet X "CUKRZYCA"
Bardziej szczegółowoCENTRUM BADANIA OPINII SPOŁECZNEJ
CENTRUM BADANIA OPINII SPOŁECZNEJ SEKRETARIAT OŚRODEK INFORMACJI 629-35 - 69, 628-37 - 04 693-46 - 92, 625-76 - 23 UL. ŻURAWIA 4A, SKR. PT.24 00-503 W A R S Z A W A TELEFAX 629-40 - 89 INTERNET http://www.cbos.pl
Bardziej szczegółowoPrzewodnik dla instruktora dotyczący raka skóry. (Plany lekcyjne) POZNAJ NAJNOWSZE INFORMACJE NA TEMAT BADAŃ NAD ZDROWIEM FINANSOWANIE: AUTORZY
POZNAJ NAJNOWSZE INFORMACJE NA TEMAT BADAŃ NAD ZDROWIEM Przewodnik dla instruktora dotyczący raka skóry (Plany lekcyjne) AUTORZY FINANSOWANIE: Plan lekcyjny dla modułu 3 Rak skóry bez tajemnic I. Wprowadzenie
Bardziej szczegółowoProces wprowadzania nowo zatrudnionych pracowników
Proces wprowadzania nowo zatrudnionych pracowników poradnik dla bezpoêredniego prze o onego wprowadzanego pracownika WZMOCNIENIE ZDOLNOÂCI ADMINISTRACYJNYCH PROJEKT BLIèNIACZY PHARE PL03/IB/OT/06 Proces
Bardziej szczegółowoUSTAWA. z dnia 29 sierpnia 1997 r. Ordynacja podatkowa. Dz. U. z 2015 r. poz. 613 1
USTAWA z dnia 29 sierpnia 1997 r. Ordynacja podatkowa Dz. U. z 2015 r. poz. 613 1 (wybrane artykuły regulujące przepisy o cenach transferowych) Dział IIa Porozumienia w sprawach ustalenia cen transakcyjnych
Bardziej szczegółowoPromocja i identyfikacja wizualna projektów współfinansowanych ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego
Promocja i identyfikacja wizualna projektów współfinansowanych ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego Białystok, 19 grudzień 2012 r. Seminarium współfinansowane ze środków Unii Europejskiej w ramach
Bardziej szczegółowoTemat lekcji: Bakterie a wirusy.
Anna Tomicka Scenariusz lekcji biologii Dział: Różnorodność organizmów. Klasa: I b Temat lekcji: Bakterie a wirusy. 1.Cele lekcji: Cel ogólny: Uczeń: omawia budowę komórki bakterii oraz wirusów, wyjaśnia
Bardziej szczegółowoNagroda Nobla z fizjologii i medycyny w 2004 r.
Nagroda Nobla z fizjologii i medycyny w 2004 r. Receptory zapachu i organizacja systemu węchowego Takao Ishikawa, M.Sc. Zakład Biologii Molekularnej Instytut Biochemii Uniwersytetu Warszawskiego 10 mln
Bardziej szczegółowoZastosowanie technologii interferencji RNA w medycynie
Zastosowanie technologii interferencji RNA w medycynie Application of RNA interference in medicine Marta Gabryelska 1, Eliza Wyszko 1, Stanis³aw Nowak 2, Ryszard ukiel 2, Jan Barciszewski 1 1 z Instytutu
Bardziej szczegółowoDOPALACZE. - nowa kategoria substancji psychoaktywnych
DOPALACZE - nowa kategoria substancji psychoaktywnych CZYM SĄ DOPALACZE? Dopalacze stosowana w Polsce, potoczna nazwa różnego rodzaju produktów zawierających substancje psychoaktywne, które nie znajdują
Bardziej szczegółowoS YL AB US MODUŁ U ( PRZEDMIOTU) I nforma c j e ogólne
Załącznik Nr 3 do Uchwały Senatu PUM 14/2012 S YL AB US MODUŁ U ( PRZEDMIOTU) I nforma c j e ogólne Kod modułu Rodzaj modułu Wydział PUM Kierunek studiów Specjalność Poziom studiów Nazwa modułu INŻYNIERIA
Bardziej szczegółowoRekompensowanie pracy w godzinach nadliczbowych
Rekompensowanie pracy w godzinach nadliczbowych PRACA W GODZINACH NADLICZBOWYCH ART. 151 1 K.P. Praca wykonywana ponad obowiązujące pracownika normy czasu pracy, a także praca wykonywana ponad przedłużony
Bardziej szczegółowoPL 215455 B1. PRZEMYSŁOWY INSTYTUT MOTORYZACJI, Warszawa, PL 25.05.2009 BUP 11/09
PL 215455 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 215455 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 383749 (51) Int.Cl. B62M 23/02 (2006.01) B62M 6/60 (2010.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej
Bardziej szczegółowoOcena ekspresji genu ABCG2 i białka oporności raka piersi (BCRP) jako potencjalnych czynników prognostycznych w raku jelita grubego
Aleksandra Sałagacka Ocena ekspresji genu ABCG2 i białka oporności raka piersi (BCRP) jako potencjalnych czynników prognostycznych w raku jelita grubego Pracownia Biologii Molekularnej i Farmakogenomiki
Bardziej szczegółowoRoczne zeznanie podatkowe 2015
skatteetaten.no Informacje dla pracowników zagranicznych Roczne zeznanie podatkowe 2015 W niniejszej broszurze znajdziesz skrócony opis tych pozycji w zeznaniu podatkowym, które dotyczą pracowników zagranicznych
Bardziej szczegółowoKoszty obciążenia społeczeństwa. Ewa Oćwieja Marta Ryczko Koło Naukowe Ekonomiki Zdrowia IZP UJ CM 2012
Koszty obciążenia społeczeństwa chorobami układu krążenia. Ewa Oćwieja Marta Ryczko Koło Naukowe Ekonomiki Zdrowia IZP UJ CM 2012 Badania kosztów chorób (COI Costof illnessstudies) Ekonomiczny ciężar choroby;
Bardziej szczegółowoCzynniki ryzyka. Wewn trzne (osobnicze) czynniki ryzyka. Dziedziczne i rodzinne predyspozycje do zachorowania
Czynniki ryzyka Przez poj cie czynnika ryzyka rozumie si wszelkiego rodzaju uwarunkowania, które w znaczàcy (potwierdzony statystycznie) sposób zwi kszajà lub zmniejszajà prawdopodobieƒstwo zachorowania
Bardziej szczegółowoREGULAMIN WSPARCIA FINANSOWEGO CZŁONKÓW. OIPiP BĘDĄCYCH PRZEDSTAWICIELAMI USTAWOWYMI DZIECKA NIEPEŁNOSPRAWNEGO LUB PRZEWLEKLE CHOREGO
Załącznik nr 1 do Uchwały Okręgowej Rady Pielęgniarek i Położnych w Opolu Nr 786/VI/2014 z dnia 29.09.2014 r. REGULAMIN WSPARCIA FINANSOWEGO CZŁONKÓW OIPiP BĘDĄCYCH PRZEDSTAWICIELAMI USTAWOWYMI DZIECKA
Bardziej szczegółowoLp. Tematyka Liczba godzin I. Wymagania edukacyjne
Anna Ulrych Plan wynikowy Przedmiot: Materiały fryzjerskie Kierunek : Technikum Usług Fryzjerskich- rok szkolny 05/ 06 Liczba godzin: 76 Liczba godzin w roku szkolnym: KL.II Lp. Tematyka Liczba godzin
Bardziej szczegółowoPROTOKÓŁ. Kontrolę przeprowadzono w dniach : 24, 25, 31.05. 2005 roku oraz 10. 06. 2005 roku,
PROTOKÓŁ z kontroli w Warsztatach Terapii Zajęciowej Polskiego Stowarzyszenia na Rzecz Osób z Upośledzeniem Umysłowym Koło w Słupsku przeprowadzonej przez Głównego Specjalistę Wydziału Audytu i Kontroli
Bardziej szczegółowoZapobiec rakowi szyjki macicy
Zapobiec rakowi szyjki macicy http:// Iechyd Cyhoeddus Cymru Public Health Wales Celem tej broszury jest przekazanie informacji, które mogą zapobiec zachorowaniu na raka szyjki macicy. Regularne poddawanie
Bardziej szczegółowoPOLSKA IZBA TURYSTYKI POLISH CHAMBER OF TOURISM
Załącznik nr 1 do Uchwały Prezydium Polskiej Izby Turystyki nr 3/2015/P/E Regulamin powoływania i pracy Egzaminatorów biorących udział w certyfikacji kandydatów na pilotów wycieczek I. Postanowienia ogólne
Bardziej szczegółoworevati.pl Drukarnia internetowa Szybki kontakt z klientem Obs³uga zapytañ ofertowych rozwi¹zania dla poligrafii Na 100% procent wiêcej klientów
revati.pl rozwi¹zania dla poligrafii Systemy do sprzeda y us³ug poligraficznych w internecie Drukarnia Szybki kontakt z klientem Obs³uga zapytañ ofertowych Na 100% procent wiêcej klientów drukarnia drukarnia
Bardziej szczegółowoEpidemiologia weterynaryjna
Jarosław Kaba Epidemiologia weterynaryjna Testy diagnostyczne I i II i III Zadania 04, 05, 06 Warszawa 2009 Testy diagnostyczne Wzory Parametry testów diagnostycznych Rzeczywisty stan zdrowia chore zdrowe
Bardziej szczegółowoSTOWARZYSZENIE LOKALNA GRUPA DZIAŁANIA JURAJSKA KRAINA REGULAMIN ZARZĄDU. ROZDZIAŁ I Postanowienia ogólne
Załącznik do uchwały Walnego Zebrania Członków z dnia 28 grudnia 2015 roku STOWARZYSZENIE LOKALNA GRUPA DZIAŁANIA JURAJSKA KRAINA REGULAMIN ZARZĄDU ROZDZIAŁ I Postanowienia ogólne 1 1. Zarząd Stowarzyszenia
Bardziej szczegółowoGruntowy wymiennik ciepła PROVENT- GEO
Gruntowy wymiennik ciepła PROVENT- GEO Bezprzeponowy Płytowy Gruntowy Wymiennik Ciepła PROVENT-GEO to unikatowe, oryginalne rozwiązanie umożliwiające pozyskanie zawartego gruncie chłodu latem oraz ciepła
Bardziej szczegółowoWZORU UŻYTKOWEGO EGZEMPLARZ ARCHIWALNY. d2)opis OCHRONNY. (19) PL (n)62894. Centralny Instytut Ochrony Pracy, Warszawa, PL
RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej d2)opis OCHRONNY WZORU UŻYTKOWEGO (21) Numer zgłoszenia: 112772 (22) Data zgłoszenia: 29.11.2001 EGZEMPLARZ ARCHIWALNY (19) PL (n)62894 (13)
Bardziej szczegółowoCzerwona. Piwonia drzewiasta Ceny zł/szt+8% Vat. Odmiana. Cai Hui. Cao Zhou hong. Chen hong. Chun hong jiao yan. Cong zhong xiao.
Piwonia drzewiasta Ceny zł/szt+8% Vat Odmiana Czerwona 9 zł - kłącze po szczepieniu, 10 zł - kłącze z podziału, 14 zł- kłącze 2-3 oczka, Cai Hui Roślina karłowata, w części rozłożysta, nie wysoka o kwiatach
Bardziej szczegółowoCONSTRUCTOR. Kompaktowy magazyn z u yciem rega³ów wjezdnych. Deepstor P90 DRIVE -IN
CONSTRUCTOR Kompaktowy magazyn z u yciem rega³ów wjezdnych Deepstor P90 CONSTRUCTOR Magazyn w miejsce korytarzy Rega³y wjezdne P90 daj¹ mo liwoœæ zwiêkszenia powierzchni magazynowania nawet o 90% w porównaniu
Bardziej szczegółowoSpis treści 1 Komórki i wirusy Budowa komórki Budowa k
Spis treści 1 Komórki i wirusy.......................................... 1 1.1 Budowa komórki........................................ 1 1.1.1 Budowa komórki prokariotycznej.................... 2 1.1.2
Bardziej szczegółowotróżka Źródło: www.fotolia.pl
Ogród na tarasie Wiele bylin przeżywa właśnie pełnię swego rozkwitu, ale nie jest jeszcze za późno, aby dosadzić nowe efektowne rośliny i wzbogacić swój taras niezwykłymi aranżacjami. tróżka Źródło: www.fotolia.pl
Bardziej szczegółowoTemat: Czy świetlówki energooszczędne są oszczędne i sprzyjają ochronie środowiska? Imię i nazwisko
Temat: Czy świetlówki energooszczędne są oszczędne i sprzyjają ochronie środowiska? Karta pracy III.. Imię i nazwisko klasa Celem nauki jest stawianie hipotez, a następnie ich weryfikacja, która w efekcie
Bardziej szczegółowoPostanowienia ogólne. Usługodawcy oraz prawa do Witryn internetowych lub Aplikacji internetowych
Wyciąg z Uchwały Rady Badania nr 455 z 21 listopada 2012 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Uchwała o poszerzeniu możliwości
Bardziej szczegółowoZawory specjalne Seria 900
Zawory specjalne Prze³¹czniki ciœnieniowe Generatory impulsów Timery pneumatyczne Zawory bezpieczeñstwa dwie rêce Zawór Flip - Flop Zawór - oscylator Wzmacniacz sygna³u Progresywny zawór startowy Charakterystyka
Bardziej szczegółowoCo zrobić, jeśli uważasz, że decyzja w sprawie zasiłku mieszkaniowego lub zasiłku na podatek lokalny jest niewłaściwa
Polish Co zrobić, jeśli uważasz, że decyzja w sprawie zasiłku mieszkaniowego lub zasiłku na podatek lokalny jest niewłaściwa (What to do if you think the decision about your Housing Benefit or Council
Bardziej szczegółowoZASADY REKLAMOWANIA USŁUG BANKOWYCH
Załącznik do uchwały KNF z dnia 2 października 2008 r. ZASADY REKLAMOWANIA USŁUG BANKOWYCH Reklama i informacja reklamowa jest istotnym instrumentem komunikowania się z obecnymi jak i potencjalnymi klientami
Bardziej szczegółowoPrzygotowały: Magdalena Golińska Ewa Karaś
Przygotowały: Magdalena Golińska Ewa Karaś Druk: Drukarnia VIVA Copyright by Infornext.pl ISBN: 978-83-61722-03-8 Wydane przez Infornext Sp. z o.o. ul. Okopowa 58/72 01 042 Warszawa www.wieszjak.pl Od
Bardziej szczegółowoAPAp dla dzieci w zawiesinie
APAp dla dzieci w zawiesinie Paracetamol usp to skuteczny, wysokiej jakości lek o działaniu: II II przeciwgorączkowym przeciwbólowym Walory smakowe w przypadku leku dla dzieci są równie ważne jak skuteczność
Bardziej szczegółowoDE-WZP.261.11.2015.JJ.3 Warszawa, 2015-06-15
DE-WZP.261.11.2015.JJ.3 Warszawa, 2015-06-15 Wykonawcy ubiegający się o udzielenie zamówienia Dotyczy: postępowania prowadzonego w trybie przetargu nieograniczonego na Usługę druku książek, nr postępowania
Bardziej szczegółowoGminny Program Profilaktyki i Rozwiązywania Problemów Alkoholowych i Przeciwdziałania Narkomanii na rok 2015 w Gminie Opinogóra Górna.
Gminny Program Profilaktyki i Rozwiązywania Problemów Alkoholowych i Przeciwdziałania Narkomanii na rok 2015 w Gminie Opinogóra Górna. Gminny Program profilaktyki i Rozwiązywania Problemów Alkoholowych
Bardziej szczegółowoUCHWAŁA NR... RADY MIASTA KIELCE. z dnia... 2016 r.
Projekt UCHWAŁA NR... RADY MIASTA KIELCE z dnia... 2016 r. w sprawie ustalenia zasad udzielania i rozmiaru obniżek tygodniowego obowiązkowego wymiaru godzin zajęć nauczycielom, którym powierzono stanowiska
Bardziej szczegółowoRegulamin przeprowadzania rokowań na sprzedaż lub oddanie w użytkowanie wieczyste nieruchomości stanowiących własność Gminy Wałbrzych
Załącznik nr 2 do Zarządzenia nr 901/2012 Prezydenta Miasta Wałbrzycha z dnia 19.11.2012 r. Regulamin przeprowadzania rokowań na sprzedaż lub oddanie w użytkowanie wieczyste nieruchomości stanowiących
Bardziej szczegółowoAutomatyczne Systemy Infuzyjne
Automatyczne Systemy Infuzyjne Wype nienie luki Nie ma potrzeby stosowania skomplikowanych i czasoch onnych udoskonaleƒ sprz tu infuzyjnego wymaganych do specjalistycznych pomp. Pompy towarzyszàce pacjentowi
Bardziej szczegółowoOgólna charakterystyka kontraktów terminowych
Jesteś tu: Bossa.pl Kurs giełdowy - Część 10 Ogólna charakterystyka kontraktów terminowych Kontrakt terminowy jest umową pomiędzy dwiema stronami, z których jedna zobowiązuje się do nabycia a druga do
Bardziej szczegółowoTkanka łączna. Komórki i bogata macierz. Funkcje spaja róŝne typy innych tkanek zapewnia podporę narządom ochrania wraŝliwe części organizmu
Komórki i bogata macierz Substancja międzykomórkowa przenosi siły mechaniczne Tkanka łączna Funkcje spaja róŝne typy innych tkanek zapewnia podporę narządom ochrania wraŝliwe części organizmu Tkanka łączna
Bardziej szczegółowo- o zmianie o Krajowym Rejestrze Sądowym
Warszawa, dnia 28 sierpnia, 2012 rok Grupa Posłów na Sejm RP Klubu Poselskiego Ruch Palikota Szanowna Pani Ewa Kopacz Marszałek Sejmu Rzeczypospolitej Polskiej Na podstawie art. 118 ust. 1 Konstytucji
Bardziej szczegółowo2 Ocena operacji w zakresie zgodno ci z dzia aniami KSOW, celami KSOW, priorytetami PROW, celami SIR.
1 Ocena formalna. Prowadzona jest przez CDR/WODR i odpowiada na pytania: 1. Czy wniosek zosta z ony przez partnera SIR. Negatywna ocena tego punktu skutkuje odrzuceniem wniosku? 2. Czy wniosek zosta z
Bardziej szczegółowoProblemy w realizacji umów o dofinansowanie SPO WKP 2.3, 2.2.1, Dzia anie 4.4 PO IG
2009 Problemy w realizacji umów o dofinansowanie SPO WKP 2.3, 2.2.1, Dzia anie 4.4 PO IG Jakub Moskal Warszawa, 30 czerwca 2009 r. Kontrola realizacji wska ników produktu Wska niki produktu musz zosta
Bardziej szczegółowoGeny letalne. Cuenot (Francja), 1904 rok
Geny letalne Cuenot (Francja), 1904 rok 1 Geny letalne Geny letalne Srebrzysty Dziki Platynowy Biały 2 Geny letalne P: Platynowy (Pp) x Platynowy (Pp) F1: Białe (PP) Platynowe (PP) Srebrzyste (pp) 25%
Bardziej szczegółowoTechniki korekcyjne wykorzystywane w metodzie kinesiotapingu
Techniki korekcyjne wykorzystywane w metodzie kinesiotapingu Jak ju wspomniano, kinesiotaping mo e byç stosowany jako osobna metoda terapeutyczna, jak równie mo e stanowiç uzupe nienie innych metod fizjoterapeutycznych.
Bardziej szczegółowoZałącznik nr 1 do instrukcji I-01/PO-21/LEI/D
Załącznik nr 1 do instrukcji I-01/PO-21/LEI/D Zalecenia dotyczące pobierania, przechowywania i transportu materiałów klinicznych przeznaczonych do badań diagnostycznych w Pracowni Diagnostycznej Laboratorium
Bardziej szczegółowoFORMULARZ POZWALAJĄCY NA WYKONYWANIE PRAWA GŁOSU PRZEZ PEŁNOMOCNIKA NA NADZWYCZAJNYM WALNYM ZGROMADZENIU CODEMEDIA S.A
FORMULARZ POZWALAJĄCY NA WYKONYWANIE PRAWA GŁOSU PRZEZ PEŁNOMOCNIKA NA NADZWYCZAJNYM WALNYM ZGROMADZENIU Z SIEDZIBĄ W WARSZAWIE ZWOŁANYM NA DZIEŃ 2 SIERPNIA 2013 ROKU Niniejszy formularz przygotowany został
Bardziej szczegółowoRozdział 1 Postanowienia ogólne
Załącznik do zarządzenia Rektora nr 59 z dnia 20 lipca 2015 r. REGULAMIN PRZYZNAWANIA ZWIĘKSZENIA STYPENDIUM DOKTORANCKIEGO Z DOTACJI PROJAKOŚCIOWEJ ORAZ ZASADY PRZYZNAWANIA STYPENDIUM DOKTORANCKIEGO W
Bardziej szczegółowoKWALIFIKACJA I WERYFIKACJA LECZENIA DOUSTNEGO STANÓW NADMIARU ŻELAZA W ORGANIZMIE
Opis świadczenia KWALIFIKACJA I WERYFIKACJA LECZENIA DOUSTNEGO STANÓW NADMIARU ŻELAZA W ORGANIZMIE 1. Charakterystyka świadczenia 1.1 nazwa świadczenia Kwalifikacja i weryfikacja leczenia doustnego stanów
Bardziej szczegółowoWykres 1. Płeć respondentów. Źródło: opracowanie własne. Wykres 2. Wiek respondentów.
Ogółem w szkoleniach wzięły udział 92 osoby, które wypełniły krótką ankietę mającą na celu poznanie ich opinii dotyczących formy szkolenia, osób prowadzących, a także przydatności przekazywanych informacji.
Bardziej szczegółowoModyfikowane chemicznie dupleksy sirna
PRACE PRZEGL DOWE Modyfikowane chemicznie dupleksy sirna Ma³gorzata Sierant Centrum Badañ Molekularnych i Makromolekularnych, Polska Akademia Nauk, ódÿ Chemically modified sirna duplexes Summary RNA interference
Bardziej szczegółowoZARZĄDZENIE Nr Or/9/Z/05
ZARZĄDZENIE Nr Or/9/Z/05 Burmistrza Gminy i Miasta Lwówek Śląski z dnia 6 kwietnia 2005r. w sprawie udzielenia dnia wolnego od pracy Działając na podstawie art. 33 ust. 5 ustawy z dnia 8 marca 1990 r.
Bardziej szczegółowo