RNAi w terapii. 1. Wstêp. Katarzyna Kubiak, Barbara Nawrot. RNAi in therapy

Transkrypt

1 PRACE PRZEGL DOWE RNAi w terapii Katarzyna Kubiak, Barbara Nawrot Zak³ad Chemii Bioorganicznej, Centrum Badañ Molekularnych i Makromolekularnych, Polska Akademia Nauk, ódÿ RNAi in therapy Summary The discovery of RNA interference caused a revival of the concept of short nucleic acids application as molecular tools for therapeutic control of gene expression. After almost a decade of intensive research by leading pharmaceutical companies, there is only a limited number of clinical trials of synthetic sirnas. In this review, we shall summarize the present status of knowledge of RNAi mechanism of action and discuss the potential of the use of sirna in theraphy. We shall also provide data on recent achievements in current clinical trials based on RNAi techniques. Key words: sirna, RNAi therapy, chemical modification, clinical trial. 1. Wstêp Adres do korespondencji Barbara Nawrot, Zak³ad Chemii Bioorganicznej, Centrum Badañ Molekularnych i Makromolekularnych, Polska Akademia Nauk, ul. Sienkiewicza 112, ódÿ; bnawrot@bio.cbmm.lodz.pl 1 (84) Prawie 20 lat temu poczyniono pierwsze obserwacje zjawiska potranskrypcyjnego wyciszania genów w organizmach roœlin (PTGS, ang. posttranscriptional gene silencing) (1,2) i grzybów (ang. quelling) (3). Wówczas te systemy, zabezpieczaj¹ce przed inwazj¹ transpozonów i wirusów, uwa ano za specyficzne wy³¹cznie dla ni szych organizmów. Termin interferencja RNA (RNAi, ang. RNA interference) zosta³ po raz pierwszy u yty przez Andrew Fire a i Craiga Mello do opisu wyciszenia genów, wywo³anego wbrew za³o eniom prowadzonego doœwiadczenia, po podaniu do organizmu nicienia Caernohabditis elegans (C. elegans) d³ugich, dwuniciowych cz¹steczek RNA (4). Fire i Mello zostali w 2006 r. wyró nieni Nagrod¹ Nobla w dziedzinie medycyny, poniewa jako

2 RNAi w terapii pierwsi wskazali dwuniciowe cz¹steczki RNA jako czynnik wywo³uj¹cy wyciszanie homologicznego genu. Trzy lata po opublikowaniu tej prze³omowej pracy, grupie badaczy kierowanej przez Thomasa Tuschla uda³o siê zidentyfikowaæ w ekstraktach komórek owadów wycinane z d³ugich RNA cz¹steczki efektorowe, tzw. krótkie interferuj¹ce RNA (sirna, ang. short interfering RNA) (5,6). Odkrycie to otworzy³o drogê do wyciszania genów w komórkach ssaków za poœrednictwem syntetycznych sirna (7). Zastosowanie krótkich dupleksów RNA pozwala na pominiêcie obrony przeciwwirusowej, indukowanej przez cz¹steczki dwuniciowego RNA d³u sze ni 30 par zasad (8). W miarê postêpu badañ nad interferencj¹ RNA wykazano œcis³y zwi¹zek tego zjawiska z opisanym wczeœniej PTGS. Tak e mechanizm dzia³ania tzw. mikrorna (mirna) ma szereg wspólnych elementów z RNAi (9). MikroRNA s¹ cz¹steczkami regulatorowymi, kontroluj¹cymi poziom ekspresji wielu genów. Od ich aktywnoœci zale y przebieg tak istotnych procesów jak ró nicowanie komórek, czy nowotworzenie (10). W regulacji ekspresji genów na drodze RNAi, indukowanej za pomoc¹ zarówno sirna jak i mirna, uczestnicz¹ enzymy nale ¹ce do jednej rodziny bia³ek Argonaute (11,12). Istniej¹ liczne dowody œwiadcz¹ce tak e o udziale krótkich RNA w procesach kondensacji heterochromatyny (13). Dok³adne poznanie tych nowo odkrytych, ale starych ewolucyjnie mechanizmów byæ mo e otworzy w niedalekiej przysz³oœci mo liwoœæ ingerencji terapeutycznej w ekspresjê genów z u yciem krótkich cz¹steczek RNA. Ju dziœ sirna s¹ powszechnie stosowanymi narzêdziami do badania funkcji genów, a jako potencjalne terapeutyki znajduj¹ siê w centrum zainteresowania koncernów farmaceutycznych. Przegl¹d ten ma na celu przybli enie czytelnikowi stanu wiedzy na temat tej niezwykle dynamicznie rozwijaj¹cej siê dziedziny badañ. 2. Mechanizm interferencji RNA Uproszczony schemat mechanizmu interferencji RNA przedstawiono na rysunku 1. W organizmach ssaków jednym z procesów kontroli ekspresji genów jest interferencja RNA indukowana za pomoc¹ mikrorna (mirna). Cz¹steczki mirna powstaj¹ w wyniku hydrolizy kodowanych w genomie prekursorów d³ugoœci kilkudziesiêciu nukleotydów, nosz¹cych nazwê pri-mikrorna. W j¹drze prekursory te s¹ hydrolizowane za pomoc¹ nukleazy Drosha do pre-mikrorna (o strukturze niedoskona³ej spinki do w³osów), a nastêpnie eksportowane z j¹dra z udzia³em eksportyny 5. W cytoplazmie pre-mirna jest poddawane dalszej hydrolizie przez nukleazê Dicer. Bia³ko to poœredniczy w tworzeniu kompleksu efektorowego RISC (ang. RNA-induced silencing complex). Wybór aktywnej nici mirna, która zostaje w³¹czona do RISC zale y od wzglêdnej trwa³oœci termodynamicznej koñców dupleksu przejœciowego produktu hydolizy katalizowanej przez Dicer (14). Wiod¹c¹ staje siê ta niæ, której koniec 5 jest s³abiej zaanga owany w wi¹zania Watsona-Cricka z drug¹ nici¹ w tym dupleksie (15). Po zwi¹zaniu z bia³kami kompleksu RISC cz¹steczka BIOTECHNOLOGIA 1 (84)

3 Katarzyna Kubiak, Barbara Nawrot Rys. 1. Mechanizm interferencji RNA wywo³ywany za pomoc¹ sirna i mirna. Cz¹steczki mirna (mir) s¹ kodowane w genomie i transkrybowane do pri-mirna. Prekursory te s¹ hydrolizowane przez nukleazê Drosha do pre-mirna, które s¹ transportowane przez eksportynê 5 z j¹dra do cytoplazmy. Cz¹steczki d³ugich dwuniciowych RNA (dsrna) i pre-mirna o strukturze spinki do w³osów (trzon-pêtla) s¹ substratami dla rybonukleazy Dicer. W wyniku hydrolizy powstaj¹ krótkie dupleksy RNA (sirna i mirna) rozpoznawane przez kompleks bia³kowy RISC. Jeœli niæ RNA w³¹czona do RISC jest w pe³ni komplementarna do docelowej cz¹steczki mrna nastêpuje ujawnienie rybonukleazowej aktywnoœci RISC i hydroliza mrna. Jeœli natomiast niæ wiod¹ca nie jest w pe³ni komplementarna, nastêpuje wyciszenie genu poprzez zahamowanie procesu translacji. mirna staje siê sond¹, s³u ¹c¹ do rozpoznania sekwencji czêœciowo komplementarnej w obszarach 3 -UTR (ang. untranslated region) docelowego mrna (16,17). Cz¹steczki mrna zwi¹zane z aktywnym kompleksem RISC nie podlegaj¹ translacji s¹ kierowane do cia³ek P, w których mo e nast¹piæ ich enzymatyczna degradacja lub tymczasowe wy³¹czenie z translacji (18). 134 PRACE PRZEGL DOWE

4 RNAi w terapii Rys. 2. Metody generowania dupleksów sirna stosowanych do wyciszania ekspresji genów w komórkach ssaków. Cz¹steczki sirna lub shrna mog¹ byæ otrzymywane chemicznie, enzymatycznie, lub generowane wewn¹trzkomórkowo poprzez ekspresjê koduj¹cych je wektorów. Cz¹steczki shrna, bêd¹ce produktami ekspresji wektorów, jak i te podawane z zewn¹trz, s¹ substratami dla rybonukleazy Dicer. Cz¹steczki d³ugich dwuniciowych RNA indukuj¹ RNAi u ni szych organizmów, jak np. u C. elegans. W komórkach ssaków mo liwe jest wywo³anie RNAi za pomoc¹ syntetycznych dupleksów sirna lub hydrolizowanych przez nukleazê Dicer cz¹steczek RNA o strukturze typu spinki do w³osów (shrna, ang. short hairpin RNA) (rys. 2). Podczas tworzenia kompleksu RISC nastêpuje hydroliza jednej z nici dupleksu sirna. Druga niæ, zwana antysensow¹ lub wiod¹c¹ (ang. guide) s³u y do odnalezienia komplementarnej sekwencji w obszarze koduj¹cym docelowego mrna. Hydroliza wi¹zania fosfodiestrowego w sekwencji mrna nastêpuje zawsze naprzeciwko wi¹zania pomiêdzy 10 a 11 nukleotydem nici wiod¹cej, licz¹c od jej 5 -terminalnej grupy fosforanowej (6). Za aktywnoœæ nukleazow¹ kompleksu RISC odpowiada bia³ko Ago2 z rodziny Argonaute (19-21). Cz¹steczka mrna, w której nast¹pi³a hydroliza jednego wi¹zania internukleotydowego pozbawiona jest ochrony w miejscu przeciêcia, dlatego staje siê celem nukleaz komórkowych i zostaje przez nie zdegradowana. Wykazano, e raz utworzony, aktywny, nukleinowo-bia³kowy kompleks RISC* nie rozdysocjowuje po hydrolizie jednej cz¹steczki mrna, lecz katalizuje kolejne reakcje, co przyczynia siê do wysokiej wydajnoœci mechanizmu RNAi (22,23). Dwoma etapami RNAi decyduj¹cymi o specyficznoœci wywo³anego efektu wyciszenia jest wybór nici guide z dupleksu sirna (lub pre-mirna) oraz odnalezienie komplementarnej sekwencji w docelowym mrna. Selekcji nici wiod¹cej dokonuje Dicer w kompleksie z dwoma bia³kami wi¹ ¹cymi dwuniciowe motywy RNA, tzw. bia³kami dsrbp (ang. double stranded-rna binding protein). Bia³ka te wi¹ ¹ bardziej trwa³y termodynamicznie koniec dupleksu sirna (26). Bia³kami dsrbp w kompleksie BIOTECHNOLOGIA 1 (84)

5 Katarzyna Kubiak, Barbara Nawrot Rys. 3. Schemat wi¹zania antysensowej (wiod¹cej) nici sirna w kompleksie z bia³kami RISC do cz¹steczki mrna (na podstawie cytowanej pracy (10)). (a) Schematyczna struktura aktywnego kompleksu RISC ze zwi¹zan¹ cz¹steczk¹ nici wiod¹cej sirna. Niæ antysensowa sirna tworzy kompleks z bia³kiem Ago2; 5 -terminalna grupa fosforanowa jest rozpoznawana przez domenê PIWI, zaœ dwunukleotydowy koniec 3 jest wi¹zany przez domenê PAZ. (b) Rozpoznanie pomiêdzy cz¹steczk¹ mrna i koñcem 5 nici wiod¹cej nastêpuje w tzw. regionie seed; wa na jest komplementarnoœæ 7 nukleotydów od 2 do 8. (c) Po utworzeniu w pe³ni komplementarnego dupleksu nici guide sirna/mrna ujawnia siê nukleazowa aktywnoœæ kompleksu RISC i nastêpuje hydroliza œciœle okreœlonego wi¹zania fosfodiestrowego w mrna, znajduj¹cego siê naprzeciwko wi¹zania pomiêdzy nukleozydami 10 i 11 nici antysensowej. ludzkiego Dicera s¹ bia³ko TRBP (ang. human immunodeficiency virus transactivating response (HIV-1 TAR) RNA-binding protein) (24) i bia³ko PACT (ang. protein activator of protein kinase PKR) (25). Podobnie jak w przypadku mirna, nici¹ wiod¹c¹ staje siê ta, której 5 -koniec jest s³abiej zaanga owany w wi¹zania Watsona-Cricka z komplementarn¹ nici¹ w dupleksie. Dla prawid³owego rozpoznania docelowej sekwencji w mrna decyduj¹ce znaczenie ma jej komplementarnoœæ z siedmioma nukleotydami w pozycjach 2-8 od 5 -koñca nici wiod¹cej sirna, w tzw. rejonie seed (27,28) (rys. 3). 3. Krótkie RNA jako potencjalne terapeutyki Jest wiele mo liwych sposobów wykorzystania potencja³u krótkich cz¹steczek RNA w medycynie. Oczywistym celem dla terapii opartych na interferencji RNA s¹ choroby, za których powstanie odpowiadaj¹ mutacje pojedynczego genu, jak np. fenyloketonuria, anemia sierpowata, hemofilia. Obecnie szeroko prowadzone s¹ badania nad zastosowaniem sirna specyficznych dla genów, stanowi¹cych dobrze zdefiniowany cel w terapii chorób, których etiopatologia jest znana. Obszar tych badañ jest bardzo szeroki i obejmuje wiele chorób wirusowych, nowotworowych, neurodegeneracyjnych, a tak e metabolicznych. W kilku przypadkach pokazano mo liwoœæ allelospecyficznego wyciszania zmutowanego genu w systemie komórkowym (29). Powsta³o kilkadziesi¹t firm biotechnologicznych pracuj¹cych nad rozwojem techniki RNAi, w wiêkszoœci korzystaj¹cych z wczeœniejszych doœwiadczeñ w zakresie chemii kwasów nukleinowych. Trudno obecnie wskazaæ obszary medycyny, w których nie d¹ y siê do zastosowania RNAi. Pomimo to, trwaj¹cych badañ klinicznych jest zaledwie kilka (tab.). Do najbardziej zaawansowanych nale ¹ terapie oparte na miejscowej aplikacji sirna, które zostan¹ omówione w dalszej czêœci tego przegl¹du. 136 PRACE PRZEGL DOWE

6 RNAi w terapii Tabela Prowadzone lub zapowiedziane badania kliniczne z zastosowaniem interferencji RNA Schorzenie Etap Czynnik RNAi; nazwa Sposób podania Zaanga owane firmy CHOROBY OCZU AMD (starcze zwyrodnienie plamki) badania klin. faza I/II badania klin. faza II badania klin. faza II/III sirna na RTP801; RTP801i-14 sirna na VEGFR; Sirna027/AGN sirna na VEGF; Cand5 INFEKCJE WIRUSOWE HBV, HCV badania klin. faza I eirna na 4 geny wirusa HCV przedkliniczny LNA-antimiR na mir122; SPC3649 RSV (wirus zapalenia oskrzeli) wirus grypy iniekcja do ga³ki ocznej, 2 -OMe zmodyfikowane sirna w liposomach (AtuPLEX) iniekcja do ga³ki ocznej, zmodyfikowane chemicznie sirna w roztworze soli iniekcja do ga³ki ocznej, zmodyfikowane chemicznie sirna w roztworze soli wektory plazmidowe koduj¹ce dwuniciowe RNA mixmery LNA i DNA, do ylnie badania klin. faza II sirna w areozolu donosowo, op³aszczone liposomami (SNALP) Silence Therapeutics/ Atugen AG/Quark Pharma/Pfizer Sirna/Merck/Allergan Acuity/Opko Nucleonics Santaris Pharma/Enzon Alnylam, Protiva wirus grypy przedkliniczny sirna na konserwatywne inhalacja Nastech sekwencje CMV (2005) przedkliniczny miejscowo CytRx (2005) HIV-1 badania klin. faza I shrna lentiwirus koduj¹cy Benitec/City of Hope tak e rybozym i TAR NOWOTWORY guzy lite badania klin. faza I sirna na RRM2; CALAA-01 guzy lite (angiogeneza) nowotwory (angiogeneza) przedkliniczny (IND w 2008) sirna na VEGF i VEGFR; ICS-283 do ylnie, niezmodyfikowane sirna w nanocz¹steczkach do ylnie, sirna op³aszczone nanocz¹steczkami (Nonoplex ) przedkliniczny sirna zmodyfikowane chemicznie sirna, do ylnie w liposomach (AtuPLEX) Calando Intradigm Silence Therapeutics BIOTECHNOLOGIA 1 (84)

7 Katarzyna Kubiak, Barbara Nawrot bia³aczka szpikowa ostra (AML), inne nowotwory, immunostymulacja przedkliniczny sirna na bia³ko li sirna w areozolu w roztworze z surfaktantami (RapidMist ) glejaki mózgu badania kliniczne dsrna iniekcja œródoperacyjna roztworu d³ugiego dwuniciowego RNA bia³aczka limfocytowa (CLL) badania klin. faza I/II RNA Antagonist na Bcl2; SPC2996 NOWOTWORY z³oœliwe guzy lite przedkliniczny RNA Antagonist na surwiwinê; SPC3042 ró ne nowotwory badania klin. faza I/II RNA Antagonist na HIF-1; SPC2968 ALS (stwardnienie zanikowe boczne) hipercholesterolemia oty³oœæ i cukrzyca typu 2 przedkliniczny przedkliniczny u naczelnych przedkliniczny przedkliniczny przedkliniczny w myszach CHOROBY UK ADU NERWOWEGO sirna allelospecyficzne na zmutowane SOD1 CHOROBY METABOLICZNE sirna na PCSK9 RNA Antagonist na apob100 LNA-antimiR na mir122; SPC3649 Gapmer LNA i DNA, 2h wlew do ylny Gapmer LNA i DNA, do ylnie Gapmer LNA i DNA, do ylnie chemicznie zmodyfikowane sirna, miejscowo u myszy do ylnie, sirna op³aszczone liposomami Gapmer LNA i DNA, do ylnie mixmery LNA i DNA, do ylnie Antigen Express/ Generex Biotech IChB PAN/AM Poznañ Santaris Pharma/ Enzon Santaris Pharma/ Enzon Santaris Pharma/ Enzon CytRx Alnylam Santaris Pharma/ Enzon Santaris Pharma/ Enzon sirna na RIP140 N/A CytRx INNE CHOROBY stany zapalne przedkliniczny sirna na TNF-alfa formulacja z peptydami, podawane do ylnie ostra niewydolnoœæ nerek (ARF, AKI) autopourazowa utrata s³uchu (AHL) przewlek³a obstruacyjna choroba p³uc (COPD) badania klin. faza I sirna na p53; AKIi-5 przedkliniczny (status IND) przedkliniczny sirna na p53; AHLi-11 sirna na RTP801; CTPi-1 2 -OMe zmodyfikowane sirna w liposomach (AtuPLEX), do ylnie 2 -OMe zmodyfikowane sirna w liposomach (AtuPLEX), do ylnie 2 -OMe zmodyfikowane sirna w liposomach (AtuPLEX), do ylnie Nastech Silence Ther/Atugen AG/Quark Pharma Atugen AG/Quark Pharma Atugen AG/Quark Pharma/Pfizer 138 PRACE PRZEGL DOWE

8 RNAi w terapii Zastosowanie w praktyce leków opartych na kwasach nukleinowych jest bardzo trudne, co dobrze ilustruje ponad dwudziestoletnia historia badañ w obszarze strategii antysensowych. Jedynie w dwóch przypadkach leki oligonukleotydowe doczeka³y siê akceptacji przez FDA (ang. Food and Drug Administration). S¹ to: Vitravene (oligonukleotyd antysensowy stosowany w terapii zaka eñ wirusem cytomegalii u chorych na AIDS) i Macugen (aptamer VEGF, (ang. vascular enothelial growth factor), stosowany w terapii zwyrodnienia plamki ó³tej zwi¹zanego z wiekiem (AMD, ang. age-related macular degeneration). Jedn¹ z przeszkód w terapeutycznym zastosowaniu sirna jest ograniczony czas trwania efektu wyciszenia. Nadziej¹ na unikniêcie wielokrotnego podawania dawek leku jest zastosowanie wektorów wirusowych, zapewniaj¹cych stabiln¹ ekspresjê kaset koduj¹cych shrna (30,31). Do tej grupy nale ¹ wektory lentiwirusowe, które integruj¹ do genomu gospodarza i w zwi¹zku z tym ich stosowanie niesie ryzyko uaktywnienia onkogenów. Natomiast wektory oparte na adenowirusach lub AAV (ang. adeno-associated virus) s¹ bezpieczniejsze pod tym wzglêdem poniewa ulegaj¹ ekspresji episomalnej, przejœciowej. Obydwa typy wektorów s¹ zdolne do infekowania komórek zarówno dziel¹cych siê, jak i nie dziel¹cych siê (32,33). Najczêœciej w celu zapewnienia wydajnej ekspresji krótkich RNA stosuje siê promotory dla polimerazy RNA typu III (U6 i H1). Jednak e du a skutecznoœæ tych promotorów mo e w niektórych przypadkach byæ niepo ¹dana. Istnieje ryzyko wysycenia aparatu enzymatycznego RNAi, a co za tym idzie, zak³ócenia naturalnych szlaków regulacji ekspresji genów za poœrednictwem mirna (34). Dotychczas tylko jeden wektor lentiwirusowy, koduj¹cy shrna razem z rybozymem i oligonukleotydem decoy, zosta³ zakwalifikowany przed FDA do I fazy badañ klinicznych w terapii zaka enia HIV (35). 4. W³aœciwoœci farmakokinetyczne syntetycznych sirna Wiêkszoœæ prowadzonych obecnie badañ klinicznych (tab.) wykorzystuje syntetyczne sirna. Cz¹steczki te, ze wzglêdu na wielkoœæ i polianionowy charakter, nie s¹ zdolne do przenikania przez b³ony cytoplazmatyczne bez pomocy transporterów. Ponadto s¹ ³atwo hydrolizowane przez nukleazy komórkowe, broni¹ce organizm przed obcym materia³em genetycznym. Trzecim ograniczeniem dla wdro enia technologii sirna do zastosowañ praktycznych s¹ obserwowane efekty uboczne. ród³em tych niepo ¹danych efektów s¹ niespecyficzne wyciszenia genów (tzw. off-target silencing) oraz indukcja wydzielania interferonu przez sirna zawieraj¹ce sekwencje immunostymuluj¹ce (z motywem CpG). Wprowadzanie modyfikacji chemicznych do syntetycznych sirna pozwala przezwyciê yæ czêœæ z wymienionych trudnoœci. Skutecznym zabezpieczeniem cz¹steczek RNA przed hydroliz¹ nukleolityczn¹ s¹ modyfikacje wi¹zania fosfodiestrowego atomem siarki lub borowodorem (36-38) oraz pozycji C2 pierœcienia rybozy np. grupami 2 -OMe oraz 2 -F. (39-42). Wzmo one przenikanie przez b³ony komórkowe jest osi¹gane przez koniugowanie BIOTECHNOLOGIA 1 (84)

9 Katarzyna Kubiak, Barbara Nawrot sirna z grupami lipofilowymi (np. z grup¹ cholesterolow¹ (43)). ¹czenie sirna z peptydami bêd¹cymi ligandami receptorów tkankowych (44,45) lub z przeciwcia³ami dla tych receptorów (46) umo liwia transport tkankowospecyficzny. Du ym osi¹gniêciem, opublikowanym w Nature w lipcu 2007 r., by³o opracowanie warunków formulacji sirna z peptydem, zapewniaj¹cym selektywny transport do neuronów po podaniu do ylnym (47). Peptyd ten pochodzi z glikoproteiny otoczki wirusa wœcieklizny, i umo liwia efektywne przekraczanie bariery krew-mózg. Kolejnym wyzwaniem w technologii RNAi jest poznanie przyczyn powstawania obserwowanych efektów ubocznych i ograniczenie ich skutków. Niespecyficznoœæ cz¹steczek sirna do pewnego stopnia mo e byæ ograniczona poprzez dobór sekwencji docelowych. Do tego celu mog¹ s³u yæ stale uaktualniane algorytmy selekcji, dostêpne w sieci Internet (48-51). Jednak e nawet starannie zaprojektowane sirna mog¹ powodowaæ obni enie lub podwy szenie poziomu ekspresji genów innych ni docelowy. Takie niespecyficzne efekty zosta³y zaobserwowane w szeregu badañ z u yciem mikromacierzy DNA (52-57). W wiêkszoœci cytowanych doniesieñ zademonstrowano wyraÿn¹ zale noœæ poziomu efektów ubocznych od stê enia u ytych sirna. Fakt ten daje nadziejê na przezwyciê enie problemu niespecyficznych wyciszeñ poprzez udoskonalanie cz¹steczek sirna (np. na drodze modyfikacji chemicznych) w taki sposób, aby osi¹gn¹æ wysok¹ skutecznoœæ dzia³ania przy minimalnej dawce. Przyczyn¹ zmian w poziomie ekspresji genów off-target mo e byæ czêœciowa komplementarnoœæ 5 -koñca nici wiod¹cej sirna (region seed) do innych ni docelowe mrna. Istnieje tak e niebezpieczeñstwo w³¹czenia do aktywnego kompleksu bia³kowego RISC nici sensowej sirna, (a zatem komplementarnej do nici zaprojektowanej jako wiod¹ca). W naszych badaniach zaproponowaliœmy oryginalne podejœcie do zwiêkszania termodynamicznej asymetrycznoœci dupleksu poprzez wprowadzanie naturalnych, zmodyfikowanych nukleozydów (2-tiourydyny s 2 U, pseudourydyny lub dihydrourydyny D) w terminalnych pozycjach obu nici sirna. Wspomniano ju, e po ¹dane jest wprowadzenie zró nicowania termodynamicznego w taki sposób, aby koniec 5 nici wiod¹cej by³ mniej zaanga owany w wi¹zania Watsona-Cricka. Za³o enie to mo na zrealizowaæ przez umieszczenie jednostki D w pozycji 19 nici sensowej ( otwarcie koñca 5 dupleksu) oraz wprowadzenie jednostek s 2 Ui na 3 -koñcu nici antysensowej lub 5 -koñcu nici sensowej (zwiêkszenie termodynamicznej trwa³oœci tego koñca dupleksu) (rys. 4) (58). W naszych badaniach wskazujemy, e zwiêkszenie zró nicowania trwa³oœci termodynamicznej koñców dupleksów przez wprowadzenie pojedynczych zmodyfikowanych nukleozasad zwiêksza specyficznoœæ i aktywnoœæ sirna. Modyfikacje takie mog¹ znaleÿæ zastosowanie do zwiêkszenia aktywnoœci allelospecyficznych sirna. Selekcja nici wiod¹cej takiego dupleksu nie mo e byæ zaplanowana przez wybór odpowiedniej sekwencji zgodnie z algorytmem wyszukiwarki, gdy sirna musi byæ skierowane na obszar mrna zawieraj¹cy mutacjê punktow¹. 140 PRACE PRZEGL DOWE

10 RNAi w terapii Rys. 4. (a) Struktury zmodyfikowanych nukleozydów, wbudowanych do cz¹steczek sirna; (b) Schemat wp³ywu modyfikacji na parametry termodynamiczne koñców dupleksu sirna i wybór nici antysensowej do kompleksu RISC (58). Ka da z nici symetrycznego sirna mo e byæ rozpoznawana przez kompleks RISC jako niæ wiod¹ca. Wprowadzenie s 2 U lub na koniec 3 dupleksu (zgodnie z polaryzacj¹ nici guide) powoduje wzrost oddzia³ywañ pomiêdzy niæmi ( zamkniêcie dupleksu ), zaœ obecnoœæ D na koñcu 5 dupleksu obni a jego trwa³oœæ termodynamiczn¹ ( otwarcie dupleksu ). W ten sposób wzrasta termodynamiczna asymetrycznoœæ sirna i wybór nici wiod¹cej jest jednoznaczny. 5. sirna w badaniach klinicznych 5.1. Choroby oczu Obecnie najbardziej zaawansowane (II i III faza badañ klinicznych) s¹ testy cz¹steczek sirna hamuj¹cych neowaskularyzacjê w terapii mokrej postaci AMD. Omawiana jednostka chorobowa objawia siê utrat¹ wzroku u osób w podesz³ym wieku, spowodowan¹ uszkodzeniem siatkówki (dok³adnie plamki ó³tej) przez nadmiernie przerastaj¹ce i pêkaj¹ce naczynia krwionoœne. Najpowszechniej stosowan¹ terapi¹ AMD jest operacja z u yciem lasera metoda bardzo inwazyjna i rzadko skutkuj¹ca trwa³ym zatrzymaniem procesu utraty wzroku. Dotychczas najlepsze rezultaty uzyskano po zastosowaniu leków blokuj¹cych aktywnoœæ VEGF (np. wprowadzonego do lecznictwa oligonukleotydu o strukturze aptameru o nazwie Macugen). Podobn¹ strategiê przyjêto projektuj¹c sirna do terapii AMD. W 2004 r. dwie konkurencyjne firmy og³osi³y pocz¹tek badañ klinicznych swoich sirna. Cand5 z Acuity Pharmaceuticals (obecnie Opko), jest skierowane na mrna bia³ka VEGF. Natomiast celem dla 027sirna z Sirna Therapeutics (przejêtej przez Merck, wspó³pracuj¹cej BIOTECHNOLOGIA 1 (84)

11 Katarzyna Kubiak, Barbara Nawrot obecnie z Allergan) jest mrna receptora tego bia³ka VEGFR. Wstêpne wyniki s¹ na tyle obiecuj¹ce, e obydwa zwi¹zki zosta³y wprowadzone do dalszych faz badañ klinicznych (odpowiednio II i III). Kolejn¹ firm¹, która og³osi³a zakoñczenie wstêpnych badañ I fazy i rozpoczêcie II fazy badañ klinicznych dla swojego sirna w terapii AMD jest Atugen AG (we wspó³pracy z firmami Silence Therapeutics, Quark Pharma i Pfizer). Podejœcie terapeutyczne w tym przypadku ró ni siê od omówionego. Dupleksy sirna skierowane s¹ na gen RTP801, odkryty przez naukowców zwi¹zanych z Quark Biotech (59). Gen ten ulega nadekspresji w warunkach niedotlenienia, stresu oksydacyjnego i niedokrwienia. Takie warunki pojawiaj¹ siê w komórkach siatkówki podczas mikrowylewów w mokrej postaci AMD. Wstêpne wyniki terapii, polegaj¹cej na iniekcji do cia³ka szklistego roztworu sirna RTP801i-14, jak siê wydaje, s¹ bardziej obiecuj¹ce ni terapie skierowane na VEGF. Wed³ug komunikatu prezentowanego podczas Keystone Symposium w lutym 2007 r. badan¹ cz¹steczk¹ jest sirna o tzw. têpych koñcach, zawieraj¹ce jednostki 2 -OMe w pozycjach naprzemiennych (co drugi nukleotyd). Miejscowe podawanie tego leku bezpoœrednio do ga³ki ocznej pozwala na ograniczenie jego degradacji w p³ynach ogólnoustrojowych i zwiêksza szansê na wprowadzenie tych sirna na rynek farmaceutyczny. Lokalne podawanie leków do ga³ki ocznej wykorzystano ju wczeœniej w przypadku wspomnianych leków oligonukleotydowych, Vitravene i Macugen. W trakcie redagowania tego przegl¹du w Nature z kwietnia 2008 (452: 591-7) ukaza³a siê publikacja, w której w w¹tpliwoœæ poddano sekwencyjniespecyficzny mechanizm dzia³ania Sirna 027, prowadzacy do wyciszenia genu VEGFR1. Sugeruje siê raczej immunostymuluj¹ce dzia³anie tego sirna zachodz¹ce poprzez aktywacjê receptora toll-like typu 3(TLR3) Infekcje wirusowe Geny wirusów s¹ atrakcyjnym celem w strategiach antysensowych, chocia i w tym przypadku mo liwoœæ praktycznego zastosowania technologii RNAi zale y od sposobu dostarczenia aktywnych cz¹steczek do komórek. Stosunkowo ³atwe do wdro enia s¹ terapie stosuj¹ce aplikacjê miejscow¹, np. skierowane na geny wirusów wywo³uj¹cych zapalenie oskrzeli RSV (ang. Respiratory Syncytial Virus). Badania takie, prowadzone przez firmê Alnylam, dotycz¹ sirna o symbolu ALN-RSV01 skierowanego na mrna bia³ka nukleokapsydu (N) wirusa RSV. Lek podawany jest w postaci aerozolu aplikowanego do nosa lub inhalowanego do dolnych dróg oddechowych. Po potwierdzeniu braku toksycznoœci tak przygotowanego preparatu (dwuletnie badania kliniczne I fazy, prowadzone równolegle w Europie i w Stanach Zjednoczonych), jesieni¹ 2007 r. rozpoczêto badania kliniczne II fazy. W badaniach tych bior¹ udzia³ zdrowi ochotnicy, poddawani kontrolowanemu zaka eniu RSV i nastêpnie leczeni preparatem ALN-RSV01. Alnylam prowadzi równie badania na etapie 142 PRACE PRZEGL DOWE

12 RNAi w terapii przedklinicznym nad terapi¹ skojarzonego zaka enia RSV i wirusem grypy (60). Podjêto tak e próby konstrukcji sirna specyficznych dla najbardziej zjadliwych szczepów wirusa grypy, takich jak np. H5N1. Trwaj¹ intensywne badania nad opracowaniem terapii RNAi przeciwko dwóm najgroÿniejszym, a wci¹ niepokonanym wirusom: HIV-1 i HBV (ang. hepatitis B virus). W przypadku zaka eñ tymi wirusami droga do sukcesu jest jednak trudniejsza ze wzglêdu na koniecznoœæ aplikacji ogólnoustrojowej. W obszarze badañ przedklinicznych uda³o siê wywo³aæ wyciszenie praktycznie wszystkich genów wirusa HIV-1 (61). Jednak e dopiero jeden (wspomniany ju ) wektor lentiwirusowy, koduj¹cy kasetê shrna, skierowan¹ na konserwatywn¹ sekwencjê mrna genu tat/rev wirusa HIV-1 zosta³ dopuszczony przez FDA do badañ na pacjentach. W terapii tej zak³ada siê transfekcjê ex vivo leukocytów CD34+ pobranych od chorego i ponowne ich wprowadzenie do organizmu pacjenta (tab.). Wektor ten, wytworzony w firmie Benitec, ma istotn¹ zaletê, gdy koduje jednoczeœnie kilka sekwencji aktywnych, oprócz shrna, tak e rybozym typu hammerhead i oligonukleotyd decoy bia³ka Tat (tzw. sekwencjê TAR). Inhibitory te skierowane s¹ na trzy ró ne cele, co ma zapobiegaæ szybkiemu uodpornianiu siê wirusa na terapeutyk (62). Zastosowany w tym wektorze rybozym jest skierowany na ludzki gen koreceptora cytokinowego CCR5 (ang. chemokine (C-C motif) receptor 5). Jest to przyk³ad podejœcia, w którym jako docelowe wybiera siê geny gospodarza, koduj¹ce bia³ka bior¹ce udzia³ w procesach wnikania lub replikacji wirusów. Gen CCR5 jest obiecuj¹cym celem, poniewa udowodniono, e delecja 32 nukleotydów w jego sekwencji powoduje odpornoœæ na infekcjê HIV-1 (63). Badania nad opracowaniem terapii przeciwko wirusowemu zapaleniu w¹troby typu B s¹ na etapie przedklinicznym. Niedawno doniesiono o skutecznym zahamowaniu infekcji HBV u myszy po podaniu sirna op³aszczonych nanocz¹steczkami lipidowymi (64) (tab.). Do dupleksów tych wprowadzono modyfikacje chemiczne, zapewniaj¹ce stabilnoœæ RNA w surowicy i ograniczaj¹ce skutki uboczne dzia³ania sirna (aktywacjê odpowiedzi interferonowej) (64). Interesuj¹ce s¹ równie badania, w których wykazano, e wektory AAV koduj¹ce 49 ró nych shrna, skierowanych na 6 genów wirusowych, wywo³uj¹ skuteczne zahamowanie infekcji HBV u m³odych myszy (do 5 miesiêcy) (34). Jednak e jednoczeœnie zaobserwowano bardzo powa ne skutki uboczne zastosowanej terapii, ³¹cznie ze œmierci¹ zwierz¹t w przypadku podania 23 z 49 testowanych konstruktów. Efekt ten zale a³ zarówno od sekwencji shrna, jak i stosowanych dawek wektora. Przyczyny takiego wyniku autorzy upatruj¹ w zbyt d³ugiej i wysokiej ekspresji shrna, która spowodowa³a nasycenie systemu RNAi i zak³ócenie naturalnych szlaków mikrorna w w¹trobach myszy. Jest to istotna wskazówka dla projektowania nowych terapii z wykorzystaniem technologii RNAi, opartych na ekspresji wysoko wydajnych wektorów wirusowych. BIOTECHNOLOGIA 1 (84)

13 Katarzyna Kubiak, Barbara Nawrot 5.3. Choroby nowotworowe W wielu oœrodkach naukowych prowadzone s¹ intensywne badania zarówno nad identyfikacj¹ dobrych celów terapeutycznych (65), jak i nad zastosowaniem technik RNAi w terapii nowotworów (66). Odnotowano przyk³ady zmniejszenia wielkoœci guza w mysich modelach ró nych nowotworów po podaniu sirna bezpoœrednio do zmienionej tkanki. Stosunkowo nieliczne s¹ przyk³ady uzyskania podobnego efektu po aplikacji ogólnoustrojowej. Jednym z pierwszych jest zastosowanie nanocz¹steczek zawieraj¹cych cyklodekstryny i znacznik transferynowy, zapewniaj¹cy specyficzny transport sirna do komórek nowotworowych w modelu in vivo (67). Ta sama firma, Calando Pharmaceuticals, og³osi³a w maju 2007 r. planowane rozpoczêcie I fazy badañ klinicznych nad sirna, oznaczonym symbolem CALAA-01, skierowanym na podjednostkê M2 reduktazy rybonukleinowej (68). Lek podano do ylnie makakom jawajskim, nale ¹cym do naczelnych (69) i za pomoc¹ obrazowania in vivo zbadano lokalizacjê nanocz¹steczek cyklodekstrynowych oraz nanocz¹steczek zawieraj¹cych dodatkowo na powierzchni znacznik transferynowy (70). Nie stwierdzono istotnych ró nic w lokalizacji obu tych noœników, natomiast wykazano, e sirna zawieraj¹ce znacznik transferynowy wykazuj¹ aktywnoœæ wy sz¹ o oko³o 50%. Prawdopodobn¹ przyczyn¹ zwiêkszonego potencja³u tak przygotowanych sirna jest skuteczniejsze ich wnikanie do komórek rakowych. G³ównym konkurentem Calando w poszukiwaniu leków RNAi w zakresie onkologii jest Silence Therapeutics (firma brytyjska znana wczeœniej pod nazw¹ SR Pharma), która wspó³pracuje z firm¹ Atugen. Firma ta zapowiedzia³a wprowadzenie do badañ klinicznych cz¹steczek sirna podawanych w liposomach projektowanych dla ograniczenia angiogenezy, (71). Inn¹ firm¹ licz¹c¹ siê w wyœcigu o przeciwnowotworowe sirna jest Intradigm. Firma ta dysponuje technologi¹ zapewniaj¹c¹ komórkowospecyficzny transport sirna (72) i pracuje nad zahamowaniem ekspresji genów bia³ka VEGF i jego receptora, w celu ograniczenia procesu angiogenezy. Interesuj¹ce podejœcie do terapii przeciwnowotworowej (z zastosowaniem oryginalnej techniki formulacji leków w formie areozoli) prezentuje konsorcjum z³o- one z firmy Antigen Express i Generex. Badacze pracuj¹cy w pierwszej z tych firm zidentyfikowali sirna zdolne do wyciszenia ekspresji bia³ka li, odpowiedzialnego za powstrzymywanie komórek MHC klasy II od prezentacji w³asnych antygenów przez komórki nowotworowe. Obni enie aktywnoœci bia³ka li umo liwia rozwiniêcie odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko komórkom guza (73). Po obiecuj¹cych wynikach badañ na mysich modelach ró nych nowotworów firmy zapowiedzia³y szybkie rozpoczêcie badañ klinicznych w Chinach. Warte odnotowania s¹ pionierskie badania prowadzone w Polsce przez zespó³ prof. Barciszewskiego we wspó³pracy z Klinik¹ Neurochirurgii i Neurotraumatologii Akademii Medycznej w Poznaniu nad zastosowaniem RNAi w terapii guzów mózgu (74). Do badañ kwalifikowani s¹ pacjenci ze zdiagnozowanymi nowotworami mózgu glejakami wielopostaciowymi. W tych przypadkach œrednie prze ycie po opera- 144 PRACE PRZEGL DOWE

14 RNAi w terapii cyjnym usuniêciu guza wynosi 8-10 miesiêcy, natomiast tych pacjentów, u których wyst¹pi wznowa 8 tygodni. Zespó³ prof. Barciszewskiego stosuje iniekcjê roztworu dwuniciowego RNA o d³ugoœci 164 par zasad, homologicznego do genu tenascyny C. Gen docelowy ulega ekspresji g³ównie w trakcie rozwoju, natomiast w zró nicowanych tkankach, tylko w tych z reakcj¹ zapaln¹ na infekcjê oraz w nowotworzeniu. W przypadku glejaków poziom ekspresji tenascyny C dobrze koreluje ze stopniem rozwoju guza. Iniekcje z roztworu RNA o objêtoœci 200 L podawano po operacji usuniêcia guza w nacieki, których nie mo na usun¹æ chirurgicznie. Wstêpne wyniki badañ s¹ bardzo obiecuj¹ce nie zaobserwowano nawrotu nowotworu w miejscach podania RNA (tak e w przypadkach, gdy w rejonach odleg³ych od miejsca iniekcji guz narasta³ ponownie) (74). Opublikowane wyniki maj¹ charakter wstêpny, a badania nad dopracowaniem metody trwaj¹. Jest to jedyna jak dot¹d praca, w której pokazano zastosowanie interferencji RNA w terapii guzów mózgu u ludzi Choroby metaboliczne Alnylam og³osi³ bardzo obiecuj¹ce wyniki badañ przedklinicznych z sirna skierowanym na gen PCSK9 (ALN-PCS01) na makakach jawajskich, u których we krwi uzyskano obni enie poziomu cholesterolu LDL o 30-40%. Zespó³ ju wczeœniej odnotowa³ sukcesy na polu wyciszania innego genu zwi¹zanego z metabolizmem cholesterolu apolipoproteiny B w modelu mysim za pomoc¹ dostarczanych do ylnie, sirna modyfikowanych chemicznie i op³aszczonych liposomami (75). Planowane jest wprowadzenie sirna skierowanego na gen PCSK9 do badañ klinicznych w terapii hipercholesterolemii. Oty³oœæ i cukrzyca typu 2 s¹ chorobami spo³ecznymi o coraz wiêkszym zasiêgu na œwiecie. Uzasadnione jest zatem, jak siê wydaje, zainteresowanie firmy CytRx cz¹steczkami sirna, skierowanymi na gen RIP140. Gen ten zosta³ zidentyfikowany jako odpowiedzialny za oty³oœæ u myszy bêd¹cych na diecie wysokokalorycznej (76) Choroby uk³adu nerwowego adna z firm farmaceutycznych, jak dotychczas, nie og³osi³a rozpoczêcia badañ klinicznych w obszarze schorzeñ centralnego uk³adu nerwowego. Przyczyn¹ trudnoœci w opracowaniu skutecznej terapii opartej na sirna jest transport tak du ych zwi¹zków przez barierê krew-mózg. W licznych badaniach, przeprowadzonych na zwierzêtach, potwierdzono skutecznoœæ technik RNAi w wyciszaniu genów w neuronach, jednak opiera³y siê one g³ównie na dostarczeniu miejscowym, aktywnych cz¹steczek (iniekcja bezpoœrednio do mózgu). W najbli szym czasie mo na siê spodziewaæ prze³omu w rozwoju metod specyficznego transportu sirna, zw³aszcza po BIOTECHNOLOGIA 1 (84)

15 Katarzyna Kubiak, Barbara Nawrot ukazaniu siê cytowanej ju wczeœniej pracy (46), dotycz¹cej zastosowania formulacji w RNA z peptydem pochodzenia wirusowego. Jednym z potencjalnie obiecuj¹cych celów terapeutycznych dla zastosowañ RNAi jest gen SOD1, którego mutacja punktowa wywo³uje stwardnienie zanikowe boczne. Badania w modelu mysim nad allelospecyficznym sirna, aplikowanym miejscowo prowadzi zespó³ zwi¹zany z firm¹ CytRx (77) (tab.). Wiele oœrodków jest zaanga- owanych w badania w obszarze chorób neurodegeneracyjnych. Nasze laboratorium ma udzia³ w opracowaniu potencjalnej terapii choroby Alzheimera (AD), opartej na hipotezie kaskady amyloidowej. Zgodnie z t¹ hipotez¹ przyczyn¹ degradacji neuronów, prowadz¹cej do demencji, jest powstawanie w przestrzeniach miêdzykomórkowych p³ytek z³o onych g³ównie z peptydu zwanego beta-amyloidem (AB42). Potencjalnymi celami terapeutycznymi s¹ zatem bia³ka uczestnicz¹ce w jego sekrecji m.in. beta-sekretaza (bia³ko BACE1) (78-81). 6. Perspektywy wykorzystania mikrorna w terapii W miarê poznawania funkcji ró nych mirna odkryto, e zaburzenia w poziomie ich ekspresji s¹ zwi¹zane z rozwojem niektórych chorób. Rozwa aj¹c terapie wykorzystuj¹ce tê wiedzê mo na przyj¹æ dwie strategie: eliminowanie cz¹steczek mirna, które ulegaj¹ nadekspresji w stanach patologicznych ( anty-mirna ) lub dodawanie dodatkowych kopii tych mirna, których niedobór powoduje zaburzenia w komórce. Przyk³adem firmy rozwijaj¹cej badania w kierunku wyciszania mirna, które ulega nadekspresji w komórkach nieprawid³owo funkcjonuj¹cej w¹troby (mir-122 reguluj¹ce oko³o 100 genów zaanga owanych w metabolizm cholesterolu) jest Santaris Pharma. Firma ta zapowiada zastosowanie podejœcia anty-mir-122 w terapii zaka enia HCV oraz w hipercholesterolemii. Badane przez tê firmê cz¹steczki to analogi oligonukleotydów z³o one z jednostek DNA i LNA. Oligonukleotydy stabilizowane rozmaitymi modyfikacjami chemicznymi maj¹ za zadanie blokowanie aktywnoœci mirna na zasadzie komplementarnoœci (bez aktywacji RNazy H) (82). Innym rozwa anym podejœciem do obni enia iloœci niepo ¹danego mikrorna w komórce jest blokowanie pri-mirna za pomoc¹ oligonukleotydu TFO (ang. triplex forming oligonucleotide). Strategia taka jest obiecuj¹ca, zw³aszcza w przypadku policistronowych pri-mirna, takich jak np. mir-17-92, ulegaj¹cych nadekspresji w kilku nowotworach. Jedno takie pri-mirna staje siê Ÿród³em ca³ej rodziny efektorowych cz¹steczek mirna, reguluj¹cych ekspresjê jednego genu. Drugie z wymienionych podejœæ terapeutycznych (zwiêkszenie iloœci konkretnego mirna w komórce) mo e znaleÿæ zastosowanie w leczeniu kilku rodzajów nowotworów, jednak jest trudniejsze do osi¹gniêcia. Dostarczenie jednoniciowych oligonukleotydów, maj¹cych uzupe³niæ poziom brakuj¹cego mirna jest trudniejsze ni podanie dupleksów sirna, ze wzglêdu na ich nisk¹ trwa³oœæ chemiczn¹ i enzymatyczn¹. Bardziej prawdopodobne, jak siê wydaje, jest wykorzystanie do tego celu 146 PRACE PRZEGL DOWE

16 RNAi w terapii wektorów koduj¹cych cz¹steczki prekursorowe pre-mirna. W tym przypadku istotne jest zachowanie odpowiedniego poziomu ekspresji takiego transgenu, ze wzglêdu na wspomniane ryzyko zaburzenia dzia³aj¹cych poprawnie szlaków mirna poprzez wysycenie komponentów bia³kowych mechanizmu RNAi. Najwiêksze znaczenie limituj¹ce ma prawdopodobnie eksportyna 5, odpowiedzialna za transport pre-mirna z j¹dra do cytoplazmy (82). Obecnie manipulowanie poziomami naturalnie wystêpuj¹cych mirna pozostaje raczej w sferze œmia³ych projektów. Poza ograniczeniami wspólnymi z technologi¹ sirna tak e obecny stan wiedzy limituje wybór celów i mo liwoœæ przewidzenia efektów ubocznych. Jedna cz¹steczka mirna bierze z jednej strony udzia³ w regulacji ekspresji kilku genów, a z drugiej jeden gen mo e byæ regulowany przez ró ne mirna. Zmiana iloœci konkretnego mirna mo e doprowadziæ zatem do trudnej do przewidzenia, z³o onej odpowiedzi komórki lub efekt mo e byæ niezauwa alny w fenotypie, bo zostanie zrekompensowany aktywnoœci¹ innych mirna (82). 7. Podsumowanie Interferencja RNA to niew¹tpliwie jedno z najwa niejszych odkryæ ostatnich lat, które otworzy³o wiele mo liwoœci zastosowañ w medycynie. Rzeczywisty postêp spowodowany tym odkryciem bêdziemy mogli oceniæ ju w ci¹gu kilku najbli szych lat, w czasie których spodziewana jest rejestracja pierwszych leków opartych na technologii RNAi. Liczba nowych terapii prawdopodobnie bêdzie siê sukcesywnie zwiêkszaæ, w miarê poznawania naturalnych funkcji krótkich RNA w naszych organizmach i ich roli w powstawaniu ró nych stanów patologicznych. Obiecuj¹ce s¹ wstêpne wyniki badañ klinicznych po miejscowym zastosowaniu sirna, jednak dopóki pierwsze cz¹steczki nie przejd¹ pomyœlnie III fazy badañ klinicznych zainteresowania firm farmaceutycznych t¹ technologi¹ bêd¹ ograniczone. Podstawowym problemem, ograniczaj¹cym praktyczne zastosowania terapii opartych na RNAi, pozostaje opracowanie skutecznych sposobów specyficznego transportu aktywnych cz¹steczek do tkanek. Zastosowanie nanocz¹steczek op³aszczonych ligandami dla receptorów powierzchniowych, specyficznych dla danego typu komórek, do tej pory budzi najwiêksze nadzieje na podawanie cz¹steczek sirna ogólnoustrojowo. Innym zagadnieniem do rozwi¹zania jest przed³u enie czasu trwania efektu wyciszenia. Opracowanie bezpiecznych wektorów zapewniaj¹cych stabiln¹ ekspresjê sirna umo liwi³oby unikniêcie czêstego podawania leku i zmniejszy³oby ryzyko wzbudzenia odpowiedzi immunologicznej organizmu. Obydwa wymienione wyzwania s¹ podejmowane przez wiele zespo- ³ów badawczych zarówno zajmuj¹cych siê chemi¹ kwasów nukleinowych, jak i chemi¹ polimerów, mog¹cych tworzyæ nanocz¹steczki. Tak e w obszarze konstrukcji wektorów mo liwych do zastosowania w terapii genowej daje siê zauwa yæ du e o ywienie i postêpy w testowaniu nowych metod wywo³ywania ekspresji shrna w komórkach ssaków. Jedn¹ z bardziej oryginalnych innowacji w tej dziedzinie jest tzw. baktofek- BIOTECHNOLOGIA 1 (84)

17 Katarzyna Kubiak, Barbara Nawrot cja (83). Polega ona na dostarczeniu plazmidów, koduj¹cych wyciszaj¹ce cz¹steczki do organizmu ssaka razem z po ywieniem zawieraj¹cym niepatologiczne bakterie. Mikroorganizmy wraz z plazmidami wch³aniane s¹ przez komórki nab³onka jelit (np. E. coli) (84) lub samodzielnie wnikaj¹ do wnêtrza komórek (np. L. monocytogenes) (85). Bakterie s¹ nastêpnie niszczone z u yciem odpowiedniego antybiotyku, a uwolnione setki plazmidów ulegaj¹ ekspresji. Skutecznoœæ takiego podejœcia pokazano w myszach, których jelita zosta³y w wyniku opisanej terapii uwolnione od groÿnych polipów (nieleczone polipy uz³oœliwiaj¹ siê do nowotworów) (84). Po przezwyciê eniu wspomnianych problemów mo liwoœci zastosowañ terapeutycznych RNAi bêd¹ ograniczone wy³¹cznie wiedz¹ na temat genetycznych przyczyn chorób. Praca powsta³a w wyniku realizacji projektu CRP/POL04-01 pt. Beta-site APP cleaving enzyme (BACE) as therapeutic target for prevention of Alzheimer s disease finansowanego przez ICGEB i projektu PBZ-MNiSW-07/I/2007 pt. Modulacja aktywnoœci wyciszaj¹cej krótkich interferuj¹cych RNA (sirna) za pomoc¹ modyfikacji chemicznych finansowanego ze œrodków MNiSzW na naukê w latach Jedna z autorek (Katarzyna Kubiak (Sipa)) otrzymywa³a w 2007 r. stypendium L Oreal Polska dla Kobiet i Nauki przy wsparciu Polskiego Komitetu ds. UNESCO. Literatura 1. van der Krol A. R., Mur L. A., de Lange P., Mol J. N., Stuitje A. R., (1990), Plant Mol. Biol., 14, Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R., (1990), Plant Cell, 2, Romano N., Macino G., (1992), Mol. Microbiol., 6, Fire A., Xu Si Q., Montgomery M. K., Kostas S. A., Driver S. E., Mello C. C., (1998), Nature, 391, Elbashir S., Lendeckel W., Tuschl T., (2001a), Genes Dev., 15, Elbashir S. M., Martinez J., Patkaniowska A., Lendecel W., Tuschl T., (2001b), EMBO J., 20, Elbashir S. M., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin A., Weber K., Tuschl T., (2001), Nature, 411, Caplen N. J., Parrish S., Imani F., Fire A., Morgan R. A., (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, Lee R. C., Feinbaum R. L., Ambros V., (1993), Cell, 75, Rane S., Sayed D., Abdellatif M., (2007), Cell Cycle, 6, Hammond S. M., (2005), FEBS Lett., 579, Collins R. E., Cheng X., (2005), FEBS Lett., 579, Mathieu O., Bender J., (2004), J. Cell. Sci., 117, Maniataki E., Mourelatos Z., (2005) Genes Dev., 19, Khvorova A., Reynolds A., Jayasena S. D., (2003), Cell, 115, Olsen P. H., Ambros V., The (1999), Dev. Biol., 216, Zeng Y., Wagner E. J., Cullen B. R., (2002), Mol. Cell., 9, Chan S. P., Slack F. J., (2006), RNA Biol., 3, Song J. J., Smith S. K., Martienssen R. A., Hannon G. J., Joshua-Tor L., (2004), Science, 305, Meister G., Landthaler M., Patkaniowska A., Dorsett Y., Teng G., Tuschl T., (2004), Mol. Cell, 15, PRACE PRZEGL DOWE

18 RNAi w terapii 21. Liu J., Carmell M. A., Rivas F. V., Marsden C. G., Thomson J. M., Song J. J., Hammond S. M., Joshua-Tor L., Hannon G. J., (2004), Science, 305, Martinez J., Patkaniowska A., Urlaub H., Luhrmann R., Tuschl T., (2002), Cell, 110, Schwarz D. S., Hutvagner G., Haley B., Zamore P. D., (2002), Mol. Cell., 10, Chendrimada T. P., Gregory R. I., Kumaraswamy E., Norman J., Cooch N., Nishikura K., Shiekhattar R., (2005), Nature, 436, Lee Y., Hur I., Park S. Y., Kim Y. K., Suh M. R., Kim V. N., (2006), EMBO J., 25, Schwarz D. S., Hutvagner G., Du T., Xu Z., Aronin N., Zamore P. D., (2003), Cell, 115, Parker J. S., Roe S. M., Barford D., (2005), Nature, 434, Ma J. B., Yuan Y. R., Meister G., Pei Y., Tuschl T., Patel D. J., (2005), Nature, 434, Miller V. M., Xia H., Marrs G. L., Gouvion C. M., Lee G., Davidson B. L., Paulson H. L., (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, Wadhwa R., Kaul S. C., Miyagishi M., Taira K., (2004), Curr. Opin. Mol. Ther., 6, Amarzguioui M., Rossi J. J., Kim D., (2005), FEBS Lett., 579, Zentilin L., Giacca M., (2004), Curr. Pharm. Biotechnol., 5, Clayton J., (2004), Nature, 431, Grimm D., Streetz K. L., Jopling C. L., Storm T. A., Pandey K., Davis C. R., Marion P., Salazar F., Kay M. A., (2006), Nature, 441, Li Z. Y., Mao H., Kallick D. A., Gorenstein D. G., (2005), Biochem. Biophys. Res. Commun., 329, Braasch D. A., Paroo Z., Contantinescu A., Ren G., Oz O. K., Mason R. P., Corey D. R., (2004), Bioorg. Med. Chem. Lett., 14, Hall A. H. S., Wan J., Shaughnessy E. E., Ramsay Shaw B., Alexander K. A., (2004), Nucleic Acids Res., 32, Prakash T. P., Allerson C. R., Dande P., Vickers T. A., Sioufi N., Jarres R., Baker B. F., Swayze E. E., Griffey R. H., Bhat B., (2005), J. Med. Chem., 48, Amarzguioui M., Holen T., Babaie E., Prydz H., (2003), Nucleic Acids Res., 31, Braasch D. A., Jensen S., Liu Y., Kaur K., Arar K., White M. A., Corey D. R., (2003), Biochemistry, 42, Chiu Y. L., Rana T. M., (2003), RNA, 9, Soutschek J., Akinc A., Bramlage B., Charisse K., Constein R., Donoghue M., Elbashir S., Geick A., Hadwiger P., Harborth J., John M., Kesavan V., Lavine G., Pandey R. K., Racie T., Rajeev K. G., Rohl I., Toudjarska I., Wang G., Wuschko S., Bumcrot D., Koteliansky V., Limmer S., Manoharan M., Vornlocher H. P., (2004), Nature, 432, Zhang Y., Boado R., Pardridge W., (2003), J. Gene Med., 5, Pardridge W. M., (2004), Expert Opin. Biol. Ther., 4, Song E., Zhu P., Lee S. K., Chowdhury D., Kussman S., Dykxhoorn D. M., Feng Y., Palliser D., Weiner D. B., Shankar P., Marasco W. A., Lieberman J., (2005), Nat. Biotechnol., 23, Kumar P., Wu H., McBride J. L., Jung K-E., Kim M. H., Davidson B. L., Lee S. K., Shankar P., Manjunath N., (2007), Nature, 448, Naito Y., Yamada T., Ui-Tei K., Morishita S., Saigo K., (2004), Nucleic Acids Res., 32, W Jackson A. L., Linsley P. S., (2004), Trends Genet., 20, Jackson A. L., Bartz S. R., Schelter J., Kobayashi S. V., Burchard J., Mao M., Li B., Cavet G., Linsley P. S., (2003), Nat. Biotech., 21, Chi J. T., Chang H. Y., Wang N. N., Chang D. S., Dunphy N., Brown P. O., (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, Semizarov D., Frost L., Sarthy A., Kroeger P., Halbert D. N., Fesik S. W., (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, BIOTECHNOLOGIA 1 (84)

19 Katarzyna Kubiak, Barbara Nawrot 56. Persengiev S. P., Zhu X., Green M. R., (2004), RNA, 10, Sledz C. A., Holko M., de Veer M. J., Silverman R. H., Williams B. R. G., (2003), Nat. Cell Biol., 5, Sipa K., Sochacka E., KaŸmierczak-Barañska J., Maszewska M., Janicka M., Nowak G., Nawrot B., (2007), RNA, 13, Shoshani T., Faerman A., Mett I., Zelin E., Tenne T., Gorodin S., Moshel Y., Elbaz S., Budanov A., Chajut A., Kalinski H., Kamer I., Rozen A., Mor O., Keshet E., Leshkowitz D., Einat P., Skaliter R., Feinstein E., (2002), Mol. Cel. Biol., 22, Bitko V., Musieyenko A., Shulyayeva O., Barik S., (2005), Nature Med., 11, Rossi J. J., (2006), Biotechniques, 40, Li M. J., Kim J., Li S., Zaia J., Yee J. K., Anderson J., Akkina R., Rossi J. J., (2005), Mol. Ther., 12, Huang Y., Paxton W. A., Wolinsky S. M., Neumann A. U., Zhang L., He T., Kang S., Ceradini D., Jin Z., Yazdanbakhsh K., Kunstman K., Erickson D., Dragon E., Landau N. R., Phair J., Ho D. D., Koup R. A. (1996), Nat. Med., 2, Morrissey D. V., Lockridge J. A., Shaw L., Blanchard K., Jensen K., Breen W., Hartsough K., Machemer L., Radka S., Jadhav V., Vaish N., Zinnen S., Vargeese C., Bowman K., Shaffer C. S., Jeffs L. B., Judge A., Mac Lachlan I., Polisky B., (2005), Nat. Biotechnol., 23, Iorns E., Lord C. J., Turner N., Ashworth A., (2007), Nature Rev., 6, Pai S. I. Lin Y. Y., Macaes B., Meneshian A., Hung C. F., Wu T. C., (2006), Gene Ther., 13, Hu-Lieskovan S., Heidel J. D., Bartlett D. W., Davis M. E., Triche T. J., (2005), Cancer Res., 65, Heidel J. D., Liu J. Y., Yen Y., Zhou B., Heale B. S., Rossi J. J., Bartlett D. W., Davis M. E., (2007), Clin. Cancer Res., 13, Heidel J. D., Yu Z., Liu J. Y., Rele S. M., Liang Y., Zeidan R. K., Kornbrust D. J., Davis M. E., (2007), Proc. Natl. Acad. Sci., 104, Bartlett D. W., Su H., Hildebrandt I. J., Weber W. A., Davis M. E., (2007), Proc. Natl. Acad. Sci., 104, Santel A., Aleku M., Keil O., Endruschat J., Esche V., Fisch G., Dames S., Löffler K., Fechtner M., Arnold W., Giese K., Klippel A., Kaufmann J., (2006), Gene Ther., 13, Schiffelers R. M, Ansari A., Xu J., Zhou Q., Tang Q., Storm G., Molema G., Lu P. Y., Scaria P. V., Woodle M. C., (2004), Nucleic Acids Res., 32, e Xu M., Lu X., Kallinteris N. L., Wang Y., Wu S., von Hofe E., Gulfo J. V., Humphreys R. E., Hillman G. G., (2004), Curr. Opin. Mol. Ther., 6, Zukiel R., Nowak S., Wyszko E., Rolle K., Gawroñska I., Barciszewska M. Z., Barciszewski J., (2006), Cancer Biol. Ther., 5, Zimmermann T. S., Lee A. C., Akinc A., Bramlage B., Bumcrot D., Fedoruk M. N., Harborth J., Heyes J. A., Jeffs L. B., John M., Judge A. D., Lam K., McClintock K., Nechev L. V., Palmer L. R., Racie T., Röhl I., Seiffert S., Shanmugam S., Sood V., Soutschek J., Toudjarska I., Wheat A. J., Yaworski E., Zedalis W., Koteliansky V., Manoharan M., Vornlocher H. P., MacLachlan I., (2007), Nature, 441, Powelka A. M., Seth A., Virbasius J. V., Kiskinis E., Nicoloro S. M., Guilherme A., Tang X., Straubhaar J., Cherniack A. D., Parker M. G., Czech M. P., (2006), J. Clin. Invest., 116, Ding H. L., Schwarz D. S. Keene A., Affar E., Fenton L., Xia X. G., Shi Y., Zamore P. D., Xu Z. S., (2003), Aging Cell., 2, Kao S., Krichevsky A., Kosik K., Tsai L., (2004), 279, Nawrot B., Sipa K., Widera K., Antoszczyk A., Sierant M., Wojcik M., Maszewska M., (2005), Proceedings of JMMC, Eds. P. Ettmayer, G. Ecker, Medimond S.r.l., Vienna, Nawrot B., (2004), Acta Biochim. Pol., 51, Nawrot B., Antoszczyk S., Maszewska M., Kuwabara T., Warashina M., Taira K., Stec W. J., (2003), Eur. J. Biochem., 270, Esau C. C., Monia B. P., (2007), Adv. Drug Discov. Rev., 59, Palffy R., Gardlik R., Hodosy J., Behuliak M., Resko P., Radvansky J., Celec P., (2006), Gene Ther., 13, PRACE PRZEGL DOWE

20 RNAi w terapii 84. Xiang S., Fruehauf J., Li C. J., (2006), Nat. Biotechnol., 24, Hense M., Domann E., Krusch S., Wachholz P., Dittmar K. E., Rohde M., Wehland J., Chakraborty T., Weiss S., (2001), Cell Microbiol., 3, Kleinman M. E., Yamada K., Takeda A., Chandrasekaran V., Nozaki M., Baffi J. Z., Albuquerque R. J., Yamasaki S., Itaya M., Pan Y., Appukuttan B., Gibbs D., Yang Z., Karikó K., Ambati B. K., Wilgus T. A., DiPietro L. A., Sakurai E., Zhang K., Smith J. R., Taylor E. W., Ambati J., (2008), Nature, 452, BIOTECHNOLOGIA 1 (84)