Interferencja RNA nowa technologia w leczeniu nowotworów

Transkrypt

1 Interferencja RNA nowa technologia w leczeniu nowotworów RNA interference new technology in tumor treatment Marta Gabryelska 1, Stanis³aw Nowak 2, Ryszard ukiel 2, Jan Barciszewski 1 1 z Instytutu Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu 2 z Katedry i Kliniki Neurochirurgii i Neurotraumatologii A.M. im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu kierownik: prof. dr Stanis³aw Nowak Streszczenie Interferencja RNAi jest naturalnym mechanizmem odpowiedzialnym za ochronê genomu oraz kontrolê ekspresji genów. W procesie tym uczestnicz¹ ma³e interferuj¹ce RNA, które rozpoznaj¹ komplementarny RNA i prowadz¹ do jego degradacji. RNAi mo e byæ wykorzystany jako metoda terapeutyczna. Choroby nowotworowe, genetyczne czy wirusowe zwi¹zane s¹ z ekspresj¹ okreœlonych genów. Mo liwoœæ ich wyciszenia daje nadziejê na skuteczne leczenie. Summary RNA interference is a natural mechanism responsible for genome protection and control of gene expression. Short interfering RNAs, which participate in this process, guide the recognition and cleavage of complementary RNA. RNAi can be adapted as therapeutic tool. Cancer or genetic, viruses diseases are connected with expression of definite genes. Possibility of gene silencing gives hope for effective treatement. S³owa kluczowe: interferencja RNA, wyciszanie genów, terapia Key words: RNA interference, gene silencing, therapy Wstêp Zjawisko interferencji RNA (ang. RNA interference, RNAi) po raz pierwszy zdefiniowano u roœlin (37). Porównanie produktów genów bior¹cych udzia³ w procesie wyciszania, wystêpuj¹cych u ró nych klas organizmów, potwierdza, e proces ten nazywany potranskrypcyjnym wyciszaniem ekspresji genu (ang. Post Transcriptional Gene Silencing, PTGS), wspó³blokowaniem (ang. co-suppression), t³umieniem (ang. quelling) oraz RNAi, bazuje na tym samym mechanizmie. Jego rozpowszechnienie w œwiecie istot ywych, wskazuje na prastare pochodzenie od eukariotycznego przodka (24). Interferencja RNA jest to proces, w którym d³ugie odcinki dwuniciowych RNA ulegaj¹ hydrolizie do krótkich dupleksów RNA o d³ugoœci 21 do 28 nukleotydów. Umo - liwiaj¹ one rozpoznanie i degradacjê komplementarnych jednoniciowych RNA (ang. single stranded RNA, ssrna), takich jak mrna lub wirusowe RNA. Niezale nie od pochodzenia i funkcji mo emy wyró niæ trzy rodzaje ma³ych RNA: krótkie interferuj¹ce RNA (ang. short interference RNA, sirna), powtórzone towarzysz¹ce krótkie interferuj¹ce RNA (ang. repeat-associated short interfering RNA, rasirna) oraz mikro RNA (mirna). W komórce dwuniciowy RNA (ang. doublestranded RNA, dsrna) jest syntetyzowany przez polimerazê RNA zale n¹ od RNA (np. niektóre wirusy) lub mo e powstawaæ na drodze hybrydyzacji nachodz¹cych na siebie transkryptów (np. sekwencje powtórzone szeregu transgenów lub transpozony). Endogenne transkrypty zawieraj¹ce komplementarne lub prawie komplementarne odcinki o d³ugoœci 20 do 50 par zasad oddzielone sekwencj¹ ³¹cznikow¹, mog¹ zwijaæ siê i tworzyæ struktury dwuniciowe typu spinka do w³osów (ang. short hairpin, sh RNA) (23). Mechanizm interferencji RNA W procesie interferencji RNA mo na wyró niæ etapy, w których nastêpuje przekszta³canie prekursorowych dsrna w sirna, degradacja docelowego mrna b¹dÿ zahamowanie transkrypcji DNA. Istnieje równie mo liwoœæ rozprzestrzeniania siê sygna³u wyciszania i jego dziedziczenie. Etap ekspansji RNAi jest charakterystyczny tylko dla niektórych klas organizmów. Na etapie inicjacji interferencji RNA cz¹steczka prekursorowego dsrna ulega hydrolizie do fragmentów Neuroskop 2005, nr 7 27

2 Rycina 1. Mechanizm interferencji RNA. a. etap inicjacyjny, b. etap efektorowy. Dicer kompleks bia³kowy zawieraj¹cy rybonukleazê specyficznê dla dwuniciowego RNA (dsrna), RISC wyciszaj¹cy kompleks bia³ek, sirna ma³y interferencyjny RNA. o d³ugoœci nukleotydów sirna (ryc.1). S¹ to dwuniciowe cz¹steczki RNA o sekwencji homologicznej do fragmentów docelowego mrna. Degradacja katalizowana jest przez specyficzn¹ rybonukleazê dla dsrna zwan¹ Dicer enzym typu RNazy III (ang. RNase III-like) (4). W reakcji katalizowanej przez Dicer, dsrna jest rozpoznawany przez domenê wi¹ ¹c¹ RNA, a helikaza RNA rozplata obie nici. Ka da z dwóch podjednostek RNazy III hydrolizuje wi¹zanie fosfodiestrowe, prowadz¹c do powstania sirna. Podobnie jak produkty innych RNaz III, równie sirna maj¹ przy koñcu 3' grupê hydroksylow¹, a przy koñcu 5' grupê fosforanow¹ oraz niesparowane dwa nukleotydy przy koñcu 3'. sirna zawieraj¹ce têpe koñce lub pozbawione grupy fosforanowej przy koñcu 5' s³abo aktywuj¹ proces RNAi (40). Jest to zwi¹zane ze s³abym oddzia³ywaniem z enzymem. D³ugoœæ sirna wydaje siê byæ cech¹ gatunkowo specyficzn¹ i mo- e odzwierciedlaæ zmiany w strukturze obu domen RNazy III. Na kolejnym etapie zale nym od ATP, sirna bêd¹cy ju czêœci¹ RISC (ang. RNA-Induced Silencing Complex), ulega rozpleceniu. Obecnoœæ krótkich, jednoniciowych fragmentów RNA aktywuje kompleks RISC. Antysensowny RNA wewn¹trz RISC ³¹czy siê z komplementarn¹ sekwencj¹ docelowego mrna, gdzie nastêpuje hydroliza transkryptu przez endorybonukleazê, w odleg³oœci oko³o nukleotydów od koñca 3' sirna. Lokalizacja wi¹zania ulegaj¹cego hydrolizie jest zdeterminowana odleg³oœci¹ od koñca 5' sirna, który jest rozpoznawany przez bia³ko wchodz¹ce w sk³ad kompleksu RISC (12). Ca³kowita degradacja pierwotnego produktu hydrolizy wymaga tak e aktywnoœci innych egzonukleaz (4). U C. elegans, grzybów i roœlin efekt wyciszania rozprzestrzenia siê poza komórki, w których proces ten zosta³ zainicjowany. W etapie tym uczestniczy polimeraza RNA zale na od RNA (ang. RNA-dependent RNA polymerase, RDR, RdRP). W wyniku dzia³ania tego enzymu powstaj¹ znaczne iloœci dsrna, komplementarne do regionu docelowego genu, które zwiêkszaj¹ efektywnoœæ i zakres wyciszania. Proces amplifikacji mo e mieæ istotne znaczenie dla infekcji wirusowej, poniewa iloœæ sir- NA bêdzie siê zwiêkszaæ adekwatnie do replikacji i akumulacji wirusowego RNA. Ma to ogromne znaczenie w ochronie genomu przed transpozonami, zapewniaj¹c wyciszanie chromatyny na wystarczaj¹cym poziomie do powstrzymania wszystkich ich kopii. Dla rozprzestrzeniania siê sygna³u wyciszania u C. elegans konieczne jest bia³ko SID1, transportuj¹ce dsrna przez b³ony komórkowe (3). W neuronach ekspresja genu sid-1 nie nastêpuje i dlatego w tym typie komórek nicienia nie obserwuje siê rozprzestrzeniania sygna³u wyciszania. Homologi SID1 nie wystêpuj¹ u Drosophila, co t³umaczy brak powy szego efektu. W komórkach ssaków bia³ka SID1 s¹ obecne, co zwiêksza prawdopodobieñstwo rozprzestrzeniania wyciszania, chocia do tej pory nie zosta³o zaobserwowane (13). U roœlin rozprzestrzenianie siê efektu RNAi jest u³atwione w plazmodesmie. Klasa mikrorna jest du ¹ grup¹ zidentyfikowan¹ w transkryptomach roœlin, jak i zwierz¹t. Niektóre mikrorna wykazuj¹ zachowawczoœæ ewolucyjn¹ u organizmów znacznie oddalonych filogenetycznie (21). Ponad 250 ludzkich mirna zosta³o zidentyfikowanych równie u myszy. Oko³o 55 mirna ma identyczn¹ sekwencjê u cz³owieka i ryby ugu sp., a 80 wykazuje du e podobieñstwo sekwencji miêdzy tymi gatunkami. 28 z 78 zidentyfikowanych mirna u Drosophila ma swoje homologi u ssaków. Sekwencje mirna wskazuj¹ na jednoczesne podobieñstwo fragmentów docelowych mrna, ich genów oraz mechanizmu dzia³ania (19). Pojedynczy organizm mo e zawieraæ setki cz¹steczek mirna, generowanych w ca³ym organizmie lub ulegaj¹cych ekspresji w sposób swoisty dla danego etapu cyklu komórkowego, typu komórki czy rodzaju tkanki. Naturalnie wystêpuj¹ce mirna s¹ oligomerami o d³ugoœci nukleotydów. Powstaj¹ one z prekursora pre-mirna. 28 Neuroskop 2005, nr 7

3 Ma on strukturê typu spinki do w³osów. Wszystkie mirna wydaj¹ siê byæ zaanga owane w potranskrypcyjn¹ regulacjê ekspresji swoistych docelowych mrna. Wiêkszoœæ danych dotycz¹cych mechanizmu dzia³ania mirna pochodzi z badañ nad ma³ymi przejœciowymi RNA (ang. small temporal RNA, strna), reguluj¹cymi fazy rozwoju nicienia C. elegans. Geny mirna ulegaj¹ transkrypcji katalizowanej przez polimerazy II (pol II) i III (pol III). Powstawanie aktywnych cz¹steczek mirna jest procesem z³o onym. Pocz¹tkowo cz¹steczka prekursora powstaje z d³ugiego pierwotnego transkryptu mikrorna (ang. primary mirna, primirna) generowanego w j¹drze komórkowym jako produkt genów mir. Te przypuszczalne pri-mirna zawieraj¹ wewnêtrzne ci¹gi poliurydynowe, co wskazuje na przedwczesn¹ terminacjê transkrypcji katalizowanej przez polimerazê III. Wiele mirna ulega zró nicowanej ekspresji w trakcie rozwoju, co jest charakterystyczne dla produktów pol II, a nie pol III (2). Prekursor ten mo e byæ przepisywany jako mono- lub policistronowy RNA (21). Wiêkszoœæ znanych mikrorna powstaje w sposób asymetryczny z pre-mikrorna, którego region helikalny zawiera odcinki jednoniciowe w postaci wybrzuszeñ i pêtli wewnêtrznych. Pri-miRNA ulega hydrolizie przez enzym Drosha, bêd¹cy RNaz¹ III. W ten sposób powstaje pre-mirna o d³ugoœci oko³o nukleotydów i strukturze typu spinka do w³osów (ryc. 2). Drosha wycina dupleks RNA w sposób typowy dla RNaz III, zostawiaj¹c resztê fosforanow¹ przy koñcu 5' i dwa niesparowane nukleotydy przy koñcu 3'. Swoista struktura prekursora mirna jest rozpoznawana przez bia³ko transportuj¹ce Ran-GTP i eksportynê-5, które eksportuje pre-mirna do cytoplazmy, gdzie jest on poddany dzia³aniu rybonukleazy Dicer (2, 21). W cytoplazmie pre-mirna hydrolizowany jest przez rybonukleazê Dicer z wytworzeniem dojrza³ego mirna o d³ugoœci oko³o 22 nukleotydów. Ludzkie mirna tworz¹ kompleksy mirnp (ang. mirna-containing effector complex) z bia³kami Gemin3, Gemin4 i ei 2C2 (eukariotyczny czynnik inicjacji translacji). Kiedy dupleks mirna:mirna* wi¹ e siê z kompleksem bia³kowym, mirna* zostaje odrzucony i ulega degradacji. mirnp zawieraj¹cy funkcjonalny mirna rozpoznaje docelowy mrna i wi¹ ¹c siê w rejonie 3' UTR, hamuje translacjê najprawdopodobniej po inicjacji syntezy bia³ka. Aktywnoœæ mirna nie wymaga ca³kowitej komplementarnoœci pomiêdzy sekwencj¹ mirna a mrna (21). MikroRNA ulegaj¹ ekspresji w ró nych stadiach rozwojowych, wykazuj¹c du ¹ specyficznoœæ tkankow¹ lub komórkow¹. Geny koduj¹ce lsy-6 i mir-273 ulegaj¹ ekspresji w neuronach C. elegans, natomiast w grasicy i szpiku kostnym M. musculus nastêpuje ekspresja genu mir Taki profil ekspresji sugeruje udzia³ mirna w ró - Rycina 2. Biosynteza mirna z cz¹steczki prekursorowej. pri-mirna transkrypt genu mir, Drosha, Dicer rybonukleazy, pre-mirna prekursor mirna. nych procesach komórkowych, takich jak: regulacja rozwoju, przestrzenne ró nicowanie komórek, fizjologia komórkowa i ustrojowa (21), (tab. 1). Mutanty nie wykazuj¹ce ekspresji wybranych genów mirna, charakteryzuj¹ siê licznymi negatywnymi cechami obni aj¹cymi ywotnoœæ i podnosz¹cymi wra liwoœæ na stresy. Niektóre z takich mutacji s¹ letalne. Przypuszcza siê, e mirna zwiêkszaj¹ stabilnoœæ mrna w komórce (21). Czynnikami wp³ywaj¹cymi na aktywnoœæ mirna nie s¹ jedynie kwasy nukleinowe. U roœlin w regulacjê aktywnoœci mirna mog¹ byæ zaanga owane fitohormony (3). Niekontrolowan¹ ekspresjê pewnych mirna ³¹czy siê z niektórymi chorobami zwi¹zanymi z zaburzeniami proliferacji, takimi jak przewlek³a bia³aczka limfocytów B oraz powstawanie nowotworu okrê nicy (19). Na fakt ten wskazuje analiza rozmieszczenia genów mirna, których ponad 50 procent znajduje siê w regionach zwi¹zanych z nowotworami. Geny mir-15 oraz mir-16 zlokalizowane s¹ w regionie chromosomu 13q14 wielkoœci 30-kb. Brak tego regionu obserwuje siê w 50 procentach przypadków przewlek³ej bia³aczki leukocytalnej (ang. chro- Neuroskop 2005, nr 7 29

4 Tabela 1. unkcje mirna w procesach komórkowych. Cel - Gen docelowy lub bia³ko kodowane przez gen docelowy. Ce C. elegans, Dm D. melanogaster, Mm M. musculus, Hs H. sapiens (1, 2, 19). Gen mirna cel funkcja genu wywo³any efekt organizm /bia³ka docelowego lin-4 lin-14 rozwój larwalny, przejœcie do kolejnego Ce (mir-125 prawdopodobnie czynnik stadium larwalnego kregowców) transkrypcyjny let-7 lin-41 rozwój larwalny, przejœcie z formy Ce hbl-1 bia³ko wi¹ ¹ce RNA larwalnej do doros³ej czynnik transkrypcyjny bantam hid rozwój, apoptoza, prawid³owe Dm namna anie komórek procesy komórkowe mir-181? wzrost i ró nicowanie prawid³owy rozwój Mm limfocytów B i T i funkcjonowanie limfocytów mir-1 BDN czynnik wzrostowy, Hs rozwój neuronalny mir-15/16 geny zwi¹zane udzia³ w transformacji prawid³owy rozwój Hs z powstawaniem nowotworowej i funkcjonowanie nowotworu leukocytów mir-127 transpozony wywo³ywanie du ych ochrona przed szkodliwym Mm, Hs mir-136 zmian w strukturze genów dzia³aniem transpozonów (inwersji, delecji, duplikacji i innych) mir-bart2 BAL 5 wirusowa (Epstein Barr) obni enie poziomu wirusa ssaki polimeraza DNA w organizmie nic lymphocitic leukemia, CLL), w 50 procentach przypadków ch³oniaka siatkówkowego (ang. retinal lymphocytoma), w procentach przypadków szpiczaków (ang. myeloma) z³o onych oraz w 60 procentach przypadków raka prostaty (19). Mo na dostrzec du e podobieñstwo pomiêdzy mirna i sirna. Obydwa rodzaje cz¹steczek powstaj¹ w wyniku dzia³ania tych samych mechanizmów enzymatycznych i stanowi¹ czêœæ maszynerii RNAi. Pod wzglêdem struktury i funkcji ró ni¹ siê jednak w wielu aspektach. Na du ¹ skutecznoœæ interferencji RNA jako metody terapeutycznej mo e wskazywaæ wystêpowanie w organizmie naturalnych elementów maszynerii, zaanga owanych w kontrolê ekspresji genów poprzez mirna. Komórkowe funkcje RNAi Interferencja RNA jest naturalnym mechanizmem wystêpuj¹cym u wiêkszoœci organizmów. Jest to specyficzny stra nik genomu oraz regulator ekspresji genów (37). Roœliny i zwierzêta nie posiadaj¹ce funkcjonuj¹cych komponentów maszynerii RNAi wykazuj¹ wiele negatywnych zmian, odmiennych od ich naturalnej fizjologii. Mutacja w genie Ago-1 u Arabidopsis przejawia siê zaburzeniami rozwojowymi zwi¹zanymi ze zmianami w ró nicowaniu komórek (13). U tej samej roœliny mutacja genu homologu Dicer prowadzi do defektów rozwoju liœci oraz nadmiernej proliferacji merystemów kwiatowych (13). W konsekwencji mutacji zak³ócaj¹cych proces dzia³ania mirna, dochodzi do nadekspresji docelowych genów. Niektóre z mutacji wp³ywaj¹ na PTGS, ale nie na procesy rozwojowe (13). Interferencja RNA chroni genom tak e przed transpozonami. Stwierdzono, e w wyniku mutacji genów Mut-7 (homolog RNazy D), Rde-1 i Rde-4 nale ¹cych do rodziny Argonaute nastêpuje zaburzenie procesu RNAi u C. elegans, prowadz¹ce do nadmiernej aktywnoœci transpozonów, podobnie jak u Chlamydomonas reinhardtii po zmutowaniu genu Mut-6 homologicznego do helikazy RNA (40). Interferencja RNA mo e zapobiegaæ transpozycji ruchomych elementów genetycznych poprzez de- 30 Neuroskop 2005, nr 7

5 gradacjê RNA lub wyciszanie chromatyny. Transpozony mog¹ stanowiæ Ÿród³o dsrna. Posiadaj¹ one czêsto sekwencje o charakterze odwróconych powtórzeñ, co pozwala³oby ich transkryptom przyjmowaæ dwuniciow¹ strukturê (40). W komórkach ssaków powtórzenia centromerowe i retrotranspozonowe maj¹ takie same modyfikacje DNA i chromatyny (32). RNAi jest zaanga owany w wyciszanie chromatyny zarówno w uk³adzie trans (32) jak i cis (8, 28). Proces RNAi jest zaanga owany w modulacjê struktury chromatyny u Drosophila, C. elegans i grzybów (40). Badania chromatyny u dro d y, muszek owocowych i roœlin stanowi¹ podstawê rozwa añ na temat roli, jak¹ odgrywa struktura chromatyny, a szczególnie epigenetyka w procesach biologicznych i patologicznych (17). Nie wykluczone, e wiele chorób mo e byæ zwi¹zanych z wadliwie dzia³aj¹cym systemem metylacji i wyciszania chromatyny, prowadz¹cym do zaburzeñ naturalnych procesów komórkowych. U organizmów modelowych podzia³y komórkowe, ró nicowanie, apoptoza i homeostaza s¹ regulowane przez zale n¹ od sekwencji aktywacjê lub inaktywacjê genów, nastêpuj¹c¹ poprzez kontrolowane zmiany w strukturze chromatyny, w których poœrednicz¹ procesy zale nego od ATP przemodelowania chromatyny oraz kowalencyjna modyfikacja histonów (17). Czêœæ z tych procesów mo e byæ zale na od sprawnie dzia³aj¹cego mechanizmu interferencji i to zarówno u organizmów modelowych, jak i u ludzi. Inhibicja interferencji RNA Niektóre wirusy wykszta³ci³y sposób przeciwdzia³ania interferencji dziêki syntezie specyficznych inhibitorów. Takie przystosowanie znane jest u wielu roœlinnych wirusów oraz wirusa HV (ang. flock house virus) atakuj¹cego owady (23). Bia³ka te prawdopodobnie wyewoluowa³y niezale nie u ró nych grup wirusów. Œwiadczyæ mo e o tym ich ró norodnoœæ strukturalna i brak wspólnych motywów sekwencji (3). Teoretycznie wirusy mog¹ hamowaæ proces interferencji poprzez: i) hamowanie powstawania antywirusowego sirna, ii) zapobieganie w³¹czaniu sirna do kompleksów wyciszaj¹cych lub iii) oddzia³ywanie z kompleksami wyciszaj¹cymi (34). Jednym z bia³ek hamuj¹cych dzia³anie RNAi jest p19 z roœlinnego wirusa TBSV (ang. tomato bushy stunt virus), hamuj¹cego rozwój pomidorów (3). Homodimer p19 wi¹ e siê do szkieletu RNA dwoma á-helisami przy ostatniej parze zasad dupleksu RNA. Nastêpuje inaktywacja dupleksów sirna lub mirna. Nie mog¹ one wejœæ w sk³ad kompleksu wyciszaj¹cego. Podobnie dzia³a inhibitor p21 kodowany przez wirusa BWYV (ang. beet western yellow virus) (3). Inhibitor HC-Pro ogranicza wyciszanie poprzez inhibicjê kompleksów efektorowych RISC, jednak e mechanizm jego dzia³ania pozostaje nieznany (34). Ludzkie wirusy wykszta³ci³y pewn¹ formê ochrony genomu przed interferencj¹ RNA, opart¹ o oddzia³ywania pomiêdzy kapsydem a genomem (30). Nukleokapsyd wirusa miêsaka Rous a (ang. Rous sarcoma virus) ochrania wirusowy RNA przed degradacj¹, a efektywne zastosowanie sirna zale y od wybranego docelowego fragmentu (36). Podobna sytuacja ma miejsce w przypadku wirusa RSV (ang. respiratory syncytial virus), gdzie genom mo e byæ niedostêpny dla sirna z powodu zamkniêcia w kompleksie rybonukleoproteinowym (22). Podobna sytuacja wystêpuje u innych wirusów, np. HIV. Z powodu takiej ochrony, proces degradacji docelowego RNA musi rozpocz¹æ siê w odpowiednim momencie cyklu rozwojowego wirusa. Mimo e wszystkie opisane do tej pory inhibitory RNAi s¹ bia³kami, nie mo na wykluczyæ innych sposobów autoprotekcji wirusów przed negatywnym dla nich efektem interferencji. Wirusy mog¹ kodowaæ w³asne mirna, które mog¹ byæ wykorzystane przeciwko aparatowi komórkowemu, w³¹czaj¹c w to sk³adniki maszynerii RNAi (22). Inhibitory oparte na RNA mog¹ przyczyniaæ siê do ró - nego typu procesów chorobowych. Wirusy roœlinne oraz niektóre wirusy zwierzêce wykszta³ci³y molekularne mechanizmy zapobiegania skutkom dzia³ania RNAi. Roœliny wykszta³ci³y w³asny system przeciwdzia³ania (30). Synteza specyficznych inhibitorów zak³ócaj¹cych mechanizm interferencji jest poœrednim dowodem na jej antywirusowy charakter. Nie poznano przypadków podobnych interakcji w przypadku ssaków i wirusów je atakuj¹cych. Zwierzêta tej grupy systematycznej nie stosowa³y RNAi w celach obronnych, a wirusy nie wykszta³ci³y strategii przeciwdzia³ania. Stwarza to mo liwoœæ sztucznej indukcji RNAi przeciwko tym wirusom, które nie syntetyzuj¹ specyficznych inhibitorów. Wykorzystanie interferencji RNA w terapii Powa ne zagro enie dla zdrowia cz³owieka stanowi¹ miêdzy innymi wirusy, takie jak HIV (ang. human immunodeficiency virus) czy wirusowego zapalenia w¹troby typu B (ang. hepatitis B virus, HBV) i C (HCV). Podobne zagro enia stwarzaj¹ pierwotniaki, wywo³uj¹ce szereg chorób (36). Efekt RNAi mo e byæ skierowany przeciwko wirusom ich transkryptom lub materia³owi genetycznemu. dsrna mo e byæ wykorzystany przeciwko ka - demu czynnikowi powoduj¹cemu chorobê, zarówno endogennemu jak i egzogennemu. Jego dzia³anie mo e byæ bardziej efektywne od obecnie stosowanych metod leczenia (36). Terapeutyczne zastosowanie RNAi wi¹ e siê z zapewnieniem trwa³oœci wyciszenia, ³atwoœci szybkiego rozprzestrzeniania siê sirna w obrêbie chorej tkanki, pozostania w aktywnej biologicznie formie do czasu osi¹gniêcia celu i brak efektów ubocznych. Neuroskop 2005, nr 7 31

6 Choroby wirusowe Terapeutyczne dzia³anie RNAi sprawdzono miêdzy innymi na myszach. Do badañ wykorzystano wirusa powoduj¹cego wirusowe zapalenie w¹troby typu B. W¹troby badanych myszy transfekowano plazmidem zawieraj¹cym ca³y genom wirusa, co wywo³a³o u nich chorobê. Nastêpnie myszy transfekowane by³y innym plazmidem zawieraj¹cym geny, których ekspresja prowadzi³a do powstania RNA o strukturze spinki do w³osów, komplementarnego do wirusowego mrna. Spowodowa³o to silne ograniczenie ekspresji genów HBV na poziomie RNA i bia³ek oraz znacz¹cego zahamowania namna ania (10). Celem RNAi mog¹ byæ endogenne transkrypty komórkowe, obejmuj¹ce czynniki u³atwiaj¹ce inwazjê lub patogennoœæ, takie jak specyficzne receptory komórkowe (36) czy czynniki transkrypcyjne (np. N -KB j¹drowy czynnik kappa B, ang. nuclear factor kappa B). Tak¹ strategiê zastosowano wobec wirusa HIV-1. Znacz¹ca odpornoœæ na infekcjê tym wirusem zosta³a uzyskana poprzez u ycie sirna skierowanych przeciwko receptorom CD4 i CCR5 niezbêdnych do infekcji. Wirus HIV i SIV (ang. simian immunodeficiency virus) zawieraj¹ w swych genomach geny regulatorowe rev, tat; strukturalne gag, pol, env; oraz pomocnicze nef, vif, vpr, vpu (lub vpx) (6), które mog¹ stanowiæ potencjalne miejsce ataku RNAi (ryc. 3). sirna ukierunkowano na sekwencje obejmuj¹ce d³ugie terminalne powtórzenia w genomie HIV oraz na piêæ genów kodowanych przez wirusa (22). Przyczyni³o siê to do zredukowania poziomu wirusa do razy (22). G³ówn¹ przeszkod¹ w leczeniu chorób infekcyjnych jest opornoœæ na stosowane leki. Wykorzystanie RNA skierowanego przeciwko wielu regionom wirusowego genomu mo e pomóc w rozwi¹zaniu tego problemu (36). Atakowanie wirusa wieloma interferuj¹cymi RNA zmniejsza jego szanse na unikniêcie efektu RNAi poprzez spontaniczne mutacje (36). Celem dzia- ³ania RNAi w takim przypadku powinny byæ konserwatywne sekwencje w genomie wirusa, stanowi¹ce jego piêtê Achillesow¹ (30). Taka metoda terapeutyczna mog³aby mieæ zastosowanie wobec szybko mutuj¹cych wirusów, opornych na konwencjonalne leki. Rycina 3. Zastosowanie RNAi do inhibicji HIV. Degradacja wirusowego transkryptu p24 (bia³ko p³aszcza, produkt genu gag) za pomoc¹ egzogennego komplemntarnego sirna, na etapie w³¹czania siê genomu wirusa do genomu nosiciela lub podczas wbudowywania siê go w nowe otoczki. Degradacja endogennego transkryptu, którego produktem bia³kowym jest receptor (CD4) niezbêdny dla wirusa w fazie adsorpcji. Choroby nowotworowe Interferencja RNA mo e byæ wykorzystana tak e do leczenia chorób nowotworowych. Jedn¹ z przyczyn powstania nowotworu jest inaktywacja obu kopii genu supresorowego nowotworu. Taka sytuacja jest czêsto spowodowana przez mutacjê jednego allelu i delecjê drugiego. Do najlepiej poznanych genów supresorowych u ludzi zaliczamy miedzy innymi gen p53, którego mutacja prowadzi do rozwoju raka sutka, okrê nicy, p³uc i kostniakomiêsaka, gen WT1- guza Wilms a u dzieci, gen BRCA1- raka sutka, jajnika, gen VHL raka nerki, naczyniaka p³odowego. Wirusy mog¹ aktywowaæ onkogeny komórkowe przez wbudowanie swojego genomu w genom komórki gospodarza. Ich negatywne dzia³anie mo e równie polegaæ na syntezie specyficznych 32 Neuroskop 2005, nr 7

7 Tabela 2. Potencjalne cele dla terapii nowotworowej z udzia³em sirna (13). Geny lub mutacja mowotwór geny po³¹czone RAS mutacja punktowa rak trzustki, przewlek³a bia³aczka, rak okrê nicy, rak p³uc c-myc, N-MYC nadekspresja, translokacja, ch³oniak Burkitt a, nerwiak niedojrza³y mutacja punktowa, amplifikacja ERBB nadekspresja rak piersi ERBB2 nadekspresja rak piersi Po³¹czone geny MLL translokacja ostra bia³aczka BCR-ABL translokacja ostra i przewlek³a bia³aczka TEL-AML1 translokacja dzieciêca ostra bia³aczka EWS- LI1 translokacja miêsak Ewing a TLS- US translokacja œluzopodobny t³uszczakomiêsak PAX3- KHR translokacja miêœniakomiêsak pr¹ kowany BCL-2 nadekspresja, translokacja rak p³uc, ch³oniak non-hodghkin, rak prostaty AML1-ETO translokacja ostra bia³aczka bia³ek, które oddzia³uj¹c z genami supresorowymi, mog¹ powodowaæ ich inaktywacjê, prowadz¹c¹ do transformacji nowotworowej. W przypadku nowotworów indukowanych przez HPV (ang. human papilloma virus), w warunkach doœwiadczalnych uda³o siê doprowadziæ do apoptozy ludzkich komórek raka szyjki macicy. Wirus ten koduje trzy onkogenne bia³ka, z czego dwa E6 i E7 zosta³y dobrze poznane. Bia³ko E6 oddzia³uje na gen supresorowy p53, a E7 na bia³ko retinoblastomy (prb) (25). Wykorzystanie sirna skierowanego przeciwko E7 prowadzi do apoptozy zmienionych komórek. Okaza³o siê, e E7 sirna nie powoduje adnego wp³ywu na niezainfekowane komórki, co wskazuje na jego wysok¹ selektywnoœæ. Strategia dzia³ania antywirusowego opiera siê o sirna skierowane przeciwko wirusowym homologom komórkowych genów antyapoptotycznych (np. Bcl-2), specyficznym bia³kom wirusowym lub specyficznym fragmentom genomu tak jak w przypadku innych wirusów nieonkogennych. Mutacjami prowadz¹cymi do nowotworzenia s¹ bardzo czêsto translokacje. Mog¹ one prowadziæ do zestawienia odcinków genów, normalnie wystêpuj¹cych na innych chromosomach, prowadz¹c do powstania po³¹czonych genów (ang. fusion genes). Translokacje tego typu le ¹ u podstaw takich schorzeñ jak przewlek³a bia³aczka szpikowa (ang. chronic myelogenous leukemia) czy ostra bia³aczka limfoblastyczna (ang. acute lymphoblastic leukemia) (39). Translokacja prowadzi do po³¹czenia genu BCR, le ¹cego na chromosomie 22, z genem ABL le ¹cym na chromosomie 9, prowadz¹c do powstania onkogenu BCR-ABL (tab. 2), którego produkt bia³kowy zwiêksza aktywnoœæ kinazy tyrozynowej, prowadz¹c do zwiêkszonej od normy fosforylacji kilku cz¹steczek (39). Ze wzglêdu na powsta³¹ w wyniku mutacji charakterystyczn¹ sekwencjê, mo liwe jest dok³adne zaprojektowanie wysoce specyficznego sirna. Pomimo dostêpnoœci specyficznego inhibitora kinazy tyrozynowej STI571 (Imatinib ), badania nad leczeniem z u yciem RNAi wydaj¹ siê byæ konieczne ze wzglêdu na wykszta³cenie opornoœci lekowej na STI571 u niektórych pacjentów. W eksperymentach in vitro terapia sirna powiod³a siê, prowadz¹c do zredukowania ekspresji BCR-ABL mrna, zmniejszenia poziomu onkobia³ka i apoptozy komórek bia³aczkowych (13). Przyczyn¹ niepowodzeñ w leczeniu nowotworów jest w wielu przypadkach opornoœæ wielolekowa (ang. multidrug resistance, MDR). Cech¹ charakterystyczn¹ nowotworów wykazuj¹cych MDR jest nadekspresja genu mdr-1, którego produktem jest glikoproteina-p (16). Przypuszcza siê, e funkcj¹ tego bia³ka jest wyrzucanie z komórek toksyn, a w przypadku leczenia leków. Leczenie nowotworów tego typu za pomoc¹ MDR-1 sirna prowadzi do zmniejszenia poziomu MDR-1 RNA i bia³ka kilka razy, co wspólnie zwiêksza wra liwoœæ takich komórek na leki, takie jak daunorubicyna czy doxorubicyna (16). Do innych onkogenów, których nadekspresja prowadzi do po- Neuroskop 2005, nr 7 33

8 wstania nowotworów nale ¹ miêdzy innymi -katenina, zaanga owana w regulacjê proliferacji i cyklina E, odgrywaj¹ca rolê w cyklu komórkowym. W przypadku tych dwóch bia³ek uda³o siê zastosowaæ sirna, doprowadzaj¹c do zmniejszenia proliferacji lub do apoptozy zmienionych komórek. Choroby wywo³ane przez mutacje Du a precyzja dzia³ania sirna, mo e umo liwiaæ leczenie chorób wywo³anych przez mutacje punktowe, insercje czy delecje. Zaprojektowany sirna móg³by dzia- ³aæ na chory, zmutowany allel, nie wp³ywaj¹c na prawid³owy ze wzglêdu na odmienn¹ sekwencjê. Dawa³oby to nadziejê na zastosowanie RNAi jako leku w przypadku chorób dziedzicznych przekazywanych przez dominuj¹cy allel. W niektórych przypadkach sirna kieruje selektywn¹ degradacj¹ tylko zmutowanych transkryptów, pozostawiaj¹c niezmutowane transkrypty nietkniête. Badania nad stwardnieniem zanikowym bocznym (ang. amyotrophic lateral sclerosis, ALS) wykaza³y, e choroba ta spowodowana jest przez mutacje w genie SOD1, koduj¹cym dysmutazê (Cu, Zn) ponadtlenkow¹ (14). Poniewa enzym ten odgrywa istotn¹ rolê w komórce, wa ne jest aby unieczynniæ tylko wadliw¹ jego kopiê. Wiele mutacji SOD polega na zmianach w pojedynczych nukleotydach. W przeprowadzonych eksperymentach in vitro uzyskano selektywn¹ degradacjê transkryptów, pochodz¹cych ze zmutowanego allelu (14). Du ym wyzwaniem dla RNAi s¹ schorzenia wywo³ane przez wzrost iloœci powtórzeñ niestabilnych sekwencji trinukleotydowych. Powtórzenia te powszechnie wystêpuj¹ w ca³ym genomie i nie mo na przeciwko nim skierowaæ sirna. Wzrost iloœci powtórzeñ tego typu wystêpuje w przypadku pl¹sawicy Huntingtona (powtórzenia CAG). Dostarczenie sirna i wektorów wirusowych wykazuj¹cych ekspresjê sirna do chorobowo zmienionych regionów w mózgu jest technicznie mo liwe, co po³¹czone z selektywnym dzia³aniem przeciw polimorfizmowi pojedynczych nukleotydów (ang. single nucleotide polimorfism, SNP) w zmutowanych transkryptach, daje nadziejê na kliniczne zastosowanie RNAi w leczeniu zwyrodnieniowych chorób neurologicznych (14). Gen docelowy Gen docelowy powinien charakteryzowaæ siê mo liwie ma³¹ zmiennoœci¹ (na przyk³ad u wirusów), aby populacja sirna by³a wobec niego skuteczna. Niewiele wiadomo na temat specyficznych regionów docelowego mrna, najbardziej dostêpnych dla sirna (26). Wybór odpowiedniej sekwencji w transkrypcie docelowym jest bardzo wa ny. Wybrany sirna przechodzi ka dy z etapów interferencji, od wnikniêcia kwasu nukleinowego do komórki a po skuteczn¹ degradacjê docelowego mrna. 34 Neuroskop 2005, nr 7 sirna uwa any jest za skuteczny, je eli powoduje efektywne i specyficzne wyciszenie genu (ponad 90% redukcji poziomu bia³ek) przy stê eniu 1-20 nm (26). Wybrany sirna powinien byæ tak e zmodyfikowany, co chroni³oby go przed strawieniem przez nukleazy i prawdopodobnie po³¹czony z ligandem, który doprowadzi³by sirna do specyficznej tkanki (36). Modyfikacja chemiczna mo e wykluczyæ jednak wykorzystanie takich sirna u ludzi. Dupleksy RNA w kulturach komórkowych powinny byæ stabilne i bez chemicznych modyfikacji, zwiêkszaj¹cych toksycznoœæ. Eksperymenty in vivo wskazuj¹ na zmniejszenie stabilnoœci sirna w surowicy. Modyfikacje chemiczne mog¹ zwiêkszaæ stabilnoœæ termiczn¹, opornoœæ na trawienie nukleazami, redukcjê efektów niespecyficznych, u³atwiaæ rozprowadzanie sirna do docelowych tkanek oraz poprawienia w³aœciwoœci farmakokinetycznych sirna (29). Cz¹steczki te zachowuj¹ swoj¹ aktywnoœæ indukowania interferencji RNA in vitro pod warunkiem doboru odpowiedniej modyfikacji w odpowiednim miejscu (29). sirna nie powinien byæ skierowany przeciwko intronom, regionom 5'UTR i 3'UTR, fragmentom w pobli u sekwencji startowej (AUG), regionom zawieraj¹cym powy ej 70 procent oraz poni ej 30 procent par guaninacytozyna (31). Korzystna jest obecnoœæ dwóch 2'-deoksytymidyn jako dwunukleotydowych niesparowanych koñców 3', w celu zabezpieczenia sirna przed dzia³aniem egzonukleaz (26). RISC preferencyjnie przy³¹cza niæ sirna, która jest termodynamicznie mniej stabilna przy koñcu 5' (26). Struktury przestrzenne mrna mog¹ wp³ywaæ na skutecznoœæ dzia³ania sirna poprzez ograniczenie dostêpnoœci docelowych fragmentów mrna. Dok³adne przewidywanie struktury drugorzêdowej docelowego transkryptu ma zasadnicze znaczenie. Przy znajomoœci sekwencji, z pomoc¹ odpowiedniego programu komputerowego mo na wykluczyæ pewne obszary mrna jako miejsca ataku sirna. W tym celu mo liwe jest zastosowanie RNazy H, pierwotnie stosowanej do identyfikacji miejsc mo liwego ataku dla rybozymów (26). Wra liwoœæ na trawienie okreœla dostêpnoœæ danego miejsca w mrna oraz pomaga przewidywaæ dzia³anie sirna. Inn¹ metod¹ oszacowania u ytecznoœci danego sirna jest wykonanie eksperymentów na komórkach poddanych transfekcji. Efektywnoœæ sirna w tej metodzie okreœla siê na podstawie jego zdolnoœci do zredukowania ekspresji spokrewnionych sekwencji po³¹czonych z genem reporterowym (26). Mo liwe jest zastosowanie sirna lub shrna jako induktorów RNAi. S¹ one testowane w ró nych laboratoriach ró ni¹ siê rozmiarem i struktur¹. D³ugoœæ trzonu cz¹steczki waha siê od 19 do 29 nukleotydów, z ró nym stopniem strukturalnego podobieñstwa do naturalnego mirna (14).

9 Metody wprowadzania dsrna do komórki i ich efektywnoœæ Zastosowanie sirna jest ograniczone ze wzglêdu na nietrwa³y efekt wyciszenia, który zale y od tempa podzia³ów komórkowych. Komórki ssaków nie maj¹ mechanizmu zwielokrotniania RNAi (jak w przypadku C. elegans i roœlin) (14). Niektóre typy komórek s¹ oporne na transfekcjê, chocia jest to prawdopodobnie najszybsza i najprostsza stosowana metoda wy³¹czania ekspresji genów za pomoc¹ RNAi w kulturach komórkowych (14). Jednym z pierwszych etapów przy zastosowaniu shrna jest przygotowanie odpowiednio skonstruowanych wektorów, których ekspresja w komórce bêdzie prowadzi³a do powstania efektywnych cz¹steczek shrna. Zalet¹ shrna jest mo liwoœæ utrzymania trwa³ego wyciszenia oraz dostarczenia cz¹steczek zarówno poprzez konwencjonaln¹ transfekcjê, jak równie z zastosowaniem zaawansowanych wektorów wirusowych, co pozwala na stabiln¹ integracjê z genomem (14). Oba typy cz¹steczek zosta³y wykorzystane praktycznie in vivo miedzy innymi u myszy. Poœród metod produkcji sirna mo emy wyró - niæ syntezê in vitro oraz ekspresjê in vivo. Synteza in vitro obejmuje syntezê chemiczn¹, transkrypcjê in vitro oraz trawienie d³ugich dsrna enzymami RNazaIII/Dicer. Podwójnoniciowy RNA mo e zostaæ wprowadzony do komórki na drodze elektroporacji, mikroiniekcji, zanurzanie organizmu w roztworze dsrna, drog¹ pokarmow¹ lub z wykorzystaniem wektorów. Metody te by³y stosowane w stosunku do ró nych organizmów. Istnieje mo liwoœæ wprowadzenia sirna do organizmu drog¹ inhalacji. Wprowadzony w ten sposób sirna u myszy zahamowa³ infekcjê wywo³an¹ wirusami RSV (ang. respiratory syncytial virus) oraz PIV (ang. parainfluenza virus) (5). Ekspresjê in vivo mo na uzyskaæ za pomoc¹ plazmidów lub wektorów wirusowych. Budzi to du e nadzieje ze wzglêdu na mo liwoœæ uzyskania d³ugoterminowego wyciszenia. Posiadaj¹ one wiele zalet, jak wewn¹trzkomórkowa ekspresja sirna, która daje mo liwoœæ tañszej, wysoce efektywnej oraz prawdopodobnie stabilnej ekspresji cz¹steczek RNA w komórkach. Kasety ekspresyjne mog¹ podlegaæ regulacji dziêki obecnoœci indukowanych promotorów. Mog¹ byæ w³¹czane do wektorów wirusowych dla uzyskania wysokiego poziomu transferu i ekspresji genów dla potencjalnego zastosowania terapeutycznego in vivo (41). Wykorzystanie wektorów umo liwia selekcjê transfekowanych komórek. Jednoczesna ekspresja dwóch sirna skierowanych przeciwko dwóm rejonom docelowego genu lub przeciwko dwóm genom mo liwa jest z wykorzystaniem wektorów typu SiDEx (ang. sirna double expression vector). Dwa sirna skierowane przeciwko ró nym fragmentom genu koduj¹cego RDR coxackiewirusa B3 doprowadzi³y do efektywnego zahamowania namna ania wirusa w komórkach HeLa i zredukowania miana wirusa o 90 procent (33). W doœwiadczeniach wykorzystano sirna ulegaj¹ce ekspresji z dwóch plazmidów oraz z jednego wektora SiDEx. Skutecznoœæ wyciszania w obu przypadkach by³a porównywalna. Syntetyczne dupleksy sirna mog¹ byæ inkubowane z uk³adami lipidowymi w celu otrzymania liposomów zawieraj¹cych sirna (38). Powstaj¹ one na bazie oddzia- ³ywañ hydrofobowych i jonowych pomiêdzy ujemnie na³adowanymi kwasami nukleinowymi a dodatnio na³adowanymi lipidami. Efektywne dostarczenie sirna do komórek za pomoc¹ lipofekatminy zosta³o potwierdzone doœwiadczalnie, chocia niektóre badania wskazuj¹ na toksycznoœæ tego reagentu. Czynnikiem poprawiaj¹cym efektywnoœæ transfekcji sirna jest równie polietylenimina (PEI), kationowy polimer wykorzystywany do poprawienia skutecznoœci transfekcji DNA (11). Efekty uboczne sirna mo e wykazywaæ wieloraki wp³yw na ekspresjê genów. Okaza³o siê, e u ycie ró nych sirna przeciwko jednemu docelowemu genowi powoduje wiele wzorców ekspresji dla ka dej z u ytych cz¹steczek. sir- NA mog¹ prowadziæ do wyciszenia niespecyficznych transkryptów, uzyskania efektów ubocznych (ang. off-target effects). Doœwiadczenia in vitro, w których u yto kilku sirna skierowanych przeciwko jednemu mrna wykaza³y, e liczba dodatkowych genów bêd¹cych celem tych sirna nie by³a skorelowana z w³aœciwym wyciszaniem docelowego genu i efektów ubocznych nie mo na by³o wyeliminowaæ poprzez zmniejszenie stê enia sirna (18). Znalezienie odpowiedniego stê enia sirna, przy którym obserwowanoby jedynie zamierzone rezultaty bez efektów ubocznych okaza³o siê niemo liwe (18). Niespecyficzne transkrypty ulegaj¹ce degradacji wykazywa³y tylko czêœciow¹ komplementarnoœæ z sirna. Poziom wyciszania dodatkowych mrna by³ ni szy od poziomu wyciszania genów docelowych. W innych eksperymentach efekty uboczne uda³o siê usun¹æ poprzez zmniejszenie stê enia podawanego sirna. sirna o pe³nej komplementarnoœci do docelowego genu, mo e powodowaæ oprócz degradacji w³aœciwego mrna, tak e spadek poziomu bia³ek w komórce. W jednym z doœwiadczeñ zaprojektowany sirna, zawieraj¹cy trzy do czterech nukleotydów niesparowanych z nukleotydami transkryptu docelowego inhibitora 1A kinazy zale nej od cyklin (ang. cyclin-dependent kinase inhibitor 1A, CDKN1A), wp³ywa³ g³ównie na poziom bia³ek, w sposób podobny do mirna (18). Wydaje siê, e brak komplementarnoœci pomiêdzy indywidualnym sirna i docelowym RNA jest mo liwy przy koñcu 5', natomiast mniej lub w ogóle na œrodku transkryptu lub przy koñcu Neuroskop 2005, nr 7 35

10 Rycina 4. Schemat odpowiedzi immunologicznej wywo³anej obecnoœci¹ egzogennego dsrna o d³ugoœci powy ej 30 pz (22). I N interferon, PKR kinaza bia³kowa zale na od dsrna, EI 2á czynnik inicjacji translacji. 3' (31). Ró ne sirna skierowane przeciwko genowi MEN1 (ang. multiple endocrine neoplasia, type 1), wp³ywaj¹ dodatkowo na ekspresjê genów TP53 i CDKN1A, które nie s¹ funkcjonalnie powi¹zane z MEN1, a zmiany w poziomie ich bia³kowych produktów nie s¹ zwi¹zane z wyciszaniem docelowego genu (18). Mechanizm tego procesu przypomina dzia³anie mirna. Badania komputerowe nie potwierdzi³y jednak tej hipotezy. Nie znaleziono w regionach 3'UTR miejsc, przypominaj¹cych miejsca wi¹zania mirna. Aby z³agodziæ efekty uboczne procesu interferencji mo na stosowaæ du ¹ iloœæ ró nych sirna o niskim stê- eniu, skierowanych przeciwko jednemu transkryptowi. Takie sirna mia³yby tak¹ sam¹ aktywnoœæ w stosunku do genu docelowego, a jednoczeœnie ró n¹ aktywnoœæ wzbudzania efektów off-target (18). W ten sposób iloœæ danego sirna wywo³uj¹cego okreœlony efekt uboczny by³aby na tyle niska, e nie powodowa³aby szkód w organizmie. Drug¹ grupê efektów ubocznych stanowi aktywacja odpowiedzi interferonowej w komórkach ssaków. Interferony (I N) s¹ bia³kami zwierzêcymi zaliczanymi do cytokin, wykazuj¹cymi dzia³anie przeciwwirusowe nieswoiste antygenowo, natomiast swoiste gatunkowo. D³ugie dsrna efektywnie wyciszaj¹ geny w komórkach owadów i komórkach embrionalnych ssaków, nie uruchamiaj¹c odpowiedzi immunologicznej (39). Odró nicowane komórki ssaków toleruj¹ wy³¹cznie dzia³anie sirna o d³ugoœci poni ej 30 par zasad (31). W przypadku d³u szych cz¹steczek dochodzi do aktywacji odpowiedzi interferonowej, prowadz¹cej do apoptozy (ryc. 4). Kinaza bia³kowa zale na od dsrna (PKR) jest wa - nym przeciwwirusowym wykrywaczem bia³ek. Jej aktywacja zachodzi pod wp³ywem zwi¹zania dsrna, na przyk³ad wirusowego. Po aktywacji kinaza hamuje translacjê poprzez fosforylacjê podjednostki czynnika inicjacji translacji EI 2. Prowadzi to do ca³kowitego zablokowania syntezy bia³ka, kieruj¹c komórkê na drogê apoptozy. PKR aktywuje tak e enzymy 2',5'-OligoA syntazê/rnazê L. Wi¹zanie dsrna przez syntazê 2',5'-OligoA powoduje jej aktywacjê i produkcjê oligonukleotydów adenylowych (pppa(2 p5 A) n ), które aktywuj¹ RNazê L, powoduj¹c¹ degradacjê RNA. dsrna mo e indukowaæ ekspresjê interferonu i, który, w zwi¹zku z innymi sygna³ami, mo e stymulowaæ apoptozê. W pewnych przypadkach sirna mog¹ aktywowaæ elementy systemu interferonowego. Niektóre sirna powodowa³y w doœwiadczeniach komórkowych aktywacjê 36 Neuroskop 2005, nr 7

11 PKR oraz indukcjê wielu genów odpowiedzi interferonowej. Dotyczy to zarówno syntetycznego sirna, wprowadzonego do komórek metod¹ elektroporacji, jak równie sirna produkowanego w komórce poprzez ekspresjê struktury typu spinka do w³osów (27, 35). Obserwowano co najmniej dwukrotn¹ indukcjê 52 z 850 przebadanych domniemanych genów stymuluj¹cych odpowiedÿ interferonow¹ (27, 35), a w przypadku genu syntetazy 2'-5'-oligoadenylanowej OAS1 (ang. 2'-5'-oligoadenylate synthetase 1) nawet 50-krotn¹, przy u yciu jednego wektora sirna i 500-krotn¹ przy u yciu dwóch wektorów (27). enomen ten mo e byæ spowodowany przez generowanie populacji d³u szych dsrna na bazie wprowadzonych sirna. Badania przeprowadzono na dwóch liniach komórkowych z u yciem piêciu ró nych sirna, syntetyzowanych chemicznie lub enzymatycznie (35). Poniewa efekt nie dotyczy³ wszystkich wprowadzonych wektorów, mo na przyj¹æ, e zale y on od samego wektora jak i metody jego dostarczenia. Rozwi¹zaniem powy szego problemu mo e byæ wykorzystywanie linii komórkowych z nieaktywn¹ drog¹ interferonow¹. Takie dzia³anie nie mo e byæ przeprowadzone w organizmach ssaków, u których ma ona ogromne znaczenie immunologiczne. Niezbêdne jest okreœlenie mo liwego dopuszczalnego poziomu aktywacji tej drogi w praktyce. Obni enie tego progu mo na osi¹gn¹æ poprzez minimalizacjê stê enia sirna. Mo liwoœæ wprowadzenia nagiego, syntetycznego sirna oraz regulacji ekspresji genu za jego pomoc¹ zosta³a udowodniona w badaniach na myszach. Rozwi¹zania oczekuj¹ nastêpuj¹ce cztery problemy i) przygotowanie sirna oraz jego sekwencja, ii) efekty zwi¹zane z typem komórki (przyk³adowo hepatocyty a makrofagi), iii) efekty dotycz¹ce wewn¹trzkomórkowych oddzia³ywañ pomiêdzy lipidowo- (oraz polikationowo-) dostarczonymi sirna i metod¹ wysokociœnieniow¹ HPTV (ang. high pressure tail vein injection) (metody HPTV nie mog¹ wykorzystywaæ tej samej drogi internalizacji jak lipidy i polikationy) oraz iv) efekty stê eniowe dotycz¹ce wszystkich przypadków (15). Iloœæ wewn¹trzkomórkowego RNA wp³ywa na poziom wyciszenia genu. Jednak e zwiêkszanie dawki wirusowej, u ywanej do transdukcji w celu zwiêkszenia poziomu wewn¹trzkomórkowego sirna, zwiêkszy liczbê prowirusowych integracji w genom gospodarza, co mo e siê przyczyniæ do zwiêkszenia ryzyka mutagenezy zarówno w przypadku komórek docelowych jak i s¹siednich (31). W linii hematopoetycznych komórek reporterowych zaobserwowano zale noœæ pomiêdzy liczb¹ zintegrowanych lentiwirusów, poziomem ekspresji sirna oraz stopniem wyciszenia docelowego genu (31). Niezbêdne jest utworzenie efektywniejszych, samoinaktywuj¹cych siê genów wektorów wyciszaj¹cych, w celu uzyskania wysokiej ekspresji selektywnych w³¹czników RNAi (31). Perspektywy wykorzystania interferencji RNA RNAi stanowi stosunkowo m³ody obszar badañ naukowych. Proces ten w ci¹gu ostatnich paru lat zosta³ uznany za obiecuj¹ce narzêdzie biologii molekularnej oraz potencjaln¹ metodê terapeutyczn¹. W laboratorium proces RNAi wykorzystuje siê do redukcji ekspresji specyficznych genów w komórkach, tkankach, a nawet u zwierz¹t (9). Potwierdzona zosta³a mo liwoœæ wykorzystania RNAi w celu identyfikacji funkcji nieznanych genów oraz w leczeniu chorób infekcyjnych, nowotworowych, autoimmunogennych oraz neurologicznych. Stosowanie interferencji RNA napotyka na swojej drodze wiele ograniczeñ natury technicznej. Metody wprowadzenia cz¹steczek RNA inicjuj¹cych proces interferencji s¹ wci¹ badane. Interferencja RNA musi byæ efektywna, wysoce specyficzna, aby znaleÿæ zastosowanie terapeutyczne. Proces ten musi przebiegaæ bez wywo³ywania efektów ubocznych oraz wyciszenia niespecyficznych genów lub genów w nieodpowiedniej tkance. Byæ mo e sirna w komórkach ssaków produkowane przez Drosha i Dicer z prekursorów dsrna bêd¹ ogranicza³y efekty niespecyficzne (9). OdpowiedŸ interferonowa stanowi przeszkodê, ograniczaj¹c¹ mo liwoœæ zastosowania RNAi w komórkach ssaków. Chemiczne w³aœciwoœci dsrna, jak równie poziom ekspresji oraz sposób dostarczenia, mog¹ mieæ wp³yw na wzbudzanie odpowiedzi interferonowej i dlatego powinny zostaæ szczegó³owo zbadane. Nale y rozwijaæ technologie wprowadzenia dsrna do organizmów pacjentów, z wyszczególnieniem okreœlonej tkanki zmienionej chorobowo. Powiod³y siê próby dostarczenia dsrna do okreœlonych komórek mózgu szczurów za pomoc¹ immunoliposomów (ang. pegylated immunoliposome, PIL) z przeciwcia³ami monoklonalnymi (ang. monoclonal antibod, MAb) (42). Nadziejê na stabilniejsze, prostsze i tañsze wyciszanie genów niesie wykorzystanie dsdna. Proces interferencji DNA (ang. DNA interference, DNAi) okaza³ siê wysoce specyficznym i efektywnym sposobem na wyciszanie genów u roœlin (20). Byæ mo e znajdzie on zastosowanie tak e w organizmach zwierzêcych. Uda³y siê próby stworzenia transgenicznych myszy, wykazuj¹cych stabilny efekt RNAi, poprzez transgenezê komórek linii zarodkowej (7). Zastosowanie RNAi we wczesnych stadiach rozwojowych, w leczeniu chorób genetycznych u p³odu mog³oby byæ skuteczne, jednak e nale y wzi¹æ pod uwagê mo liwoœæ zak³ócenia naturalnych procesów rozwojowych, przebiegaj¹cych z udzia- ³em specyficznych mirna i maszynerii RNAi. Interferencja RNA mo e równie umo liwiæ tworzenie modeli chorób ludzkich u zwierz¹t, w których podatnoœæ i odpornoœæ by³yby kodowane przez allele, wykazuj¹ce wzglêdne zró nicowanie poziomu ekspresji (9). Badania na li- Neuroskop 2005, nr 7 37

12 niach komórkowych nie dostarczaj¹ wszystkich informacji o dzia³aniu cz¹steczek dsrna, niezbêdne jest przeprowadzanie badañ przedklinicznych na zwierzêtach oraz klinicznych na ludziach. Piœmiennictwo 1. Ambros V.: The functions of animal micrornas. Nature, 2004, 431, Bartel D.P.: MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell, 2004, 116, Baulcombe D.: RNA silencing in plants. Nature, 2004, 431, B¹k D.: RNAi interferencja RNA skuteczny sposób na ciszê. Postêpy Biochem., 2003, 49, Bitko V., Musiyenko A., Shulyayeva O., Barik S.: Inhibition of respiratory viruses by nasally administered sirna. Nat. Med., 2005, 11, Brisibe E.A., Okada N., Mizukami H., Okuyama H., ujii Y.R.: RNA interference: potentials for the prevention of HIV infections and the challenges ahead. Trends Biotechnol., 2003, 21, Carmell M.A., Zhang L., Conklin D.S., Hannon G.J., Rosenquist T.A.: Germline transmission of RNAi in mice. Nat. Struct. Biol., 2003, 10, Dawe R.K.: RNA interference on chromosomes. Nat. Genet., 2004, 36, Dillon C.P., Sandy P., Nencioni A., Kissler S., Rubinson D.A., Parijs L.V.: RNAi as an experimental and therapeutic tool to study and regulate physiological and disease processes. Annu. Rev. Physiol., 2005, 67, lintoft L.: Biotechnology. Virus alert. Nat. Rev. Drug Disc., 2003, 2, Ge Q., ilip L., Bai A., Nguyen T., Eisen H.N., Chen J.: Inhibition of influenza virus production in virus-infected mice by RNA interference. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101, Haley B., Zamore P.D.: Kinetic analysis of the RNAi enzyme complex. Nat. Struct. Mol. Biol., 2004, 11, Hannon G.J.: RNA interference. Nature, 2002, 418, Hannon G.J., Rossi J.J.: Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature, 2004, 431, Heidel J.D., Hu S., Liu X.., Triche T.J., Davis M.E.: Lack of interferon response in animals to naked sirnas. Nat. Biotechnol., 2004, 22, Heidenreich O.: Oncogene suppression by small interfering RNAs. Curr. Pharm. Biotechnol., 2004, 5, Huang C., Sloan E.A., Boerkoel C..: Chromatin remodeling and human disease. Curr. Opin. Genet. Dev., 2003, 13, Jackson A.L., Linsley P.S.: Noise amidst the silence: off-target effects of sirnas? Trends Genet., 2004, 20, John B., Enright A.J., Aravin A., Tuschl T., Sander C., Marks D.S.: Human microrna targets. PLoS Biol., 2004, 2, e Kawai-Toyooka H., Kuramoto C., Orui K., Motoyama K., Kikuchi K., Kanegae T., Wada M.: DNA interference: a simple and efficient genesilencing system for high-throughput functional analysis in the fern Adiantum. Plant. Cell Physiol., 2004, 45, Król J., Kaczyñska D., Krzy osiak W.J.: Mikro RNA nowi cz³onkowie rodziny niekoduj¹cych RNA. Postêpy Biochem., 2003, 49, McManus M.T., Sharp P.A.: Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat. Rev. Genet., 2002, 3, Meister G., Tushl T.: Mechanisms of gene silencing by double stranded RNA. Nature, 2004, 431, Mello C.C., Conte D.Jr: Revealing the world of RNA interference. Nature, 2004, 431, Milner J.: RNA interference for treating cancers caused by viral infection. Expert Opin. Biol. Ther., 2003, 3, Mittal V.: Improving the efficiency of RNA interference in mammals. Nat. Rev. Genet., 2004, 5, Moss E.G., Taylor J.M.: Small-interfering RNAs in the radar of the interferon system. Nat. Cell Biol., 2003, 5, Noma K., Sugiyama T., Cam H., Verdel A., Zofall M., Jia S., Moazed D., Grewal S.I.S.: RITS acts in cis to promote RNA interference-mediated trancriptional and post-transcriptional silencing. Nat. Genet., 2004, 36, Paroo Z., Corey D.R.: Challanges for RNAi in vivo. Trends Biotechnol., 2004, 22, Saksela K.: Human viruses under attack by small inhibitory RNA. Trends Microbiol., 2003, 11, Scherr M., Eder M.: RNAi in functional genomics. Curr. Opin. Mol. Ther., 2004, 6, Schramke V., Allshire R.: Hairpin RNAs retrotransposon LTRs effect RNAi and chromatin-based gene silencing. Science, 2003, 301, Schubert S., Grunert H., Zeichhardt H., Werk D., Erdmann V.A., Kurreck J.: Maintaining inhibition: sirna double expression vectors against coxsackieviral RNAs. J. Mol. Biol., 2005, 346, Silhavy D., Burgyan J.: Effects and side-effects of viral RNA silencing suppressors on short RNAs. Trends Plant. Sci., 2004, 9, Sledz C.A., Holko M., de Veer M.J., Silverman R.H., Williams B.R.G.: Activation of the interferon system by short-interfering RNAs. Nat. Cell Biol., 2003, 5, Stevenson M.: Therapeutic potential of RNA interference. N. Engl. J. Med., 2004, 351, Szaflarski W., Myga M., Wyszko E., Barciszewski J.: Interferencyjny RNA nadzieja wspó³czesnej genomiki. Na pograniczu chemii i biologii red. H. Koroniak i J. Barciszewski Wydawnictwo Naukowe UAM Poznañ, 2002, Tom V, Takaku H.: Gene silencing of HIV-1 by RNA interference. Antivir. Chem. Chemother., 2004, 15, Tuschl T., Borkhardt A.: Small interfering RNAs: a revolutonary tool for the analysis of gene function and gene therapy. Mol. Interv., 2002, 2, Wyszko E., Szaflarski W., Barciszewski J.: Interferencyjny RNA molekularny regulator ekspresji genu. Postêpy Biochem., 2003, 29, Zentilin L., Giacca M.: In vivo transfer and expression of genes coding for short interfering RNAs. Curr. Pharm. Biotechnol., 2004, 4, Zhang Y., Boado R.J., Pardridge W.M.: In vivo knockdown of gene expression in brain cancer with intravenous RNAi in adult rats. J. Gene. Med., 2003, 5, Adres do korespondencji: Katedra i Klinika Neurochirurgii i Neurotraumatologii A.M. im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu ul. Przybyszewskiego 49, Poznañ 38 Neuroskop 2005, nr 7