Temat II. Morfologia bakterii i promieniowców. Krzywa rzeczywista wzrostu populacji bakterii w hodowli statycznej

Transkrypt

1 ĆWICZENIE V Temat II. Morfologia bakterii i promieniowców. Badania nad fiziologią drobnoustrojów oraz sposobami ich wyzyskania dla potrzeb człowieka wymagają prowadzenia długotrwałej hodowli. Rozróżniamy hodowle statyczne, w których drobnoustroje wsiane do pożywki rozwijają się do czasu wyczerpania składników pokarmowych lub zatrucia się produktami własnej przemiany materii oraz hodowle ciągłe, w których stały, ilościowo regulowany dopływ nowych porcji pożywki i jednoczesny odpływ takiej samej ilości zużytego podłoża, zawierającego produkty metabolizmu, umożliwia ciągły i nieprzerwany rozwój drobnoustrojów. Krzywa rzeczywista wzrostu populacji bakterii w hodowli statycznej 1. Faza zastoju (lag faza) M. Faza młodości fizjologicznej 2. Faza logarytmicznego wzrostu 3. Faza zwolnionego wzrostu 4. Faza równowagi 5. Faza zamierania 6. Faza logarytmicznego zamierania. Faza zastoju (lag faza) - następuje po wsianiu bakterii do podłoża. Ilość bakterii w tej fazie nie wzrasta, a nawet czasami następuje ich spadek liczebności. Jest to okres w którym drobnoustroje przystosowują się do nowego środowiska. Faza zastoju jest tym dłuższa im uboższe jest nowe środowisko w stosunku do starego oraz im starsza jest hodowla z której pochodzą bakterie. Faza młodości fizjologicznej - komórki intensywnie oddychają, szybko powiększają swoje wymiary ale nie dzielą się. Komórki w tej fazie są bardziej wrażliwe na różne niekorzystne czynniki. Faza ta jest bardzo krótka i kończy się w momencie kiedy komórki zaczynają się dzielić. Faza logarytmicznego wzrostu - na początku fazy wielkość komórek ulega zmniejszeniu by następnie utrzymywać się na stałym poziomie. Komórki bardzo intensywnie dzielą się przy zachowaniu stałej częstości podziału. Nie zmienia się wiek osobniczy komórek. Długość tej fazy zależy od czynników środowiskowych jak i od cech danej bakterii. Faza ta może ulec skróceniu na skutek wyczerpania się składników pokarmowych, nadmiernego nagromadzenia toksycznych produktów metabolizmu itp.

2 Faza równowagi - następuje zwolnienie tępa podziałów. Przyrost liczby komórek z podziału i ich ubytek powodowany zamieraniem jest w stanie równowagi w wyniku czego liczba żywych komórek pozostaje na stałym poziomie. Komórki ulegają zmianom stają się nieregularne, powstają formy rozdęte. Faza zamierania - podziały stają się bardzo rzadkie, a przypadki śmierci komórek stają się coraz częstsze a w rezultacie liczba komórek maleje. Faza logarytmicznego zamierania - podziały komórek prawie całkowicie ustają a komórki zamierają. W rezultacie liczba komórek stale maleje. W niekorzystnych warunkach zamieranie może zachodzić bardzo szybko wówczas mówimy o fazie śmierci logarytmicznej. Bakterie należą do Królestwa Procaryota. Różnorodność ich form zewnętrznych jest mała. Najliczniejsze w przyrodzie bakterie mają kształt kulisty lub cylindryczny. Komórka kulista lub zbliżona kształtem do kuli zwana jest z punktu widzenia morfologicznego ziarniakiem - coccus. Wśród prostych form cylindrycznych wyróżnia się nieprzetrwalnikujące pałeczki - bacterium i wytwarzające przetrwalniki 1aseczki - bacillus. Wśród form cylindrycznych skręconych wyróżniamy: przecinkowiec - vibrio, śrubowiec - spirillum, krętek - spirochaeta. Bakterie rozmnażają się przez podział prosty - rozszczepienie na dwie komórki potomne. U niektórych bakterii komórki potomne po podziałach nie oddzielają się od siebie, tworząc charakterystyczne ugrupowania. Wśród form kulistych bakterii, w zależności od płaszczyzn podziału, ilości komórek po podziale, wyróżnia się następujące układy: dwoinka - diplococcus, paciorkowiec - streptococcus, czwórniak - tetracoccus, pakietowiec - sarcina, gronkowiec - staphylococcus. Bakterie cylindryczne proste mogą tworzyć układy: krótki łańcuszek (diplobacterium, diplobacillus) lub łańcuszek (streptobacterium, streptobacillus). Kształty komórek bakteryjnych ziarniak dwoinka czwórniak pakietowiec (coccus) (diplococcus) (tetracoccus) (sarcina)

3 paciorkowiec gronkowiec laseczka pałeczka (streptococcus) (staphylococcus) (bacillus) (bacterium) przecinkowiec (vibrio) śrubowiec (spirillum) krętek (spirochaeta) Zdolność tworzenia mniej lub bardziej termicznie opornych endospor jest, poza nielicznymi wyjątkami, cechą występującą jedynie w grupie gramdodatnich laseczek, poruszających się za pomocą perytrychalnie ułożonych rzęsek. Tlenowe i względnie beztlenowe formy należą do rodzajów Bacillus, Sporolactobacillus, i Sporosarcina, a beztlenowe do rodzajów Clostridium i Desulfotomaculum. Schematyczne przedstawienie typowych kształtów komórek bakterii z wytworzoną endosporą a). endospora położona centralnie nie powodująca rozdęcia komórki (B. megaterium)

4 b). endospora położona centralnie, komórka rozdęta wrzecionowato - postać clostridium (B. polymyxa) c). spora w położeniu bocznym, komórka jednostronnie wrzecionowato rozdęta (B. laterosporus) d). endospora terminalna powodująca buławkowate rozdęcie komórki (B. macerans) e). spora terminalna, kulista komórka macierzysta silnie rozdęta buławkowato - postać plectridium (B. sphaericus) f). endospora terminalna nie powodująca rozdęcia komórki z białkową substancją wtrętową (B. thuringiensis) Obraz ze skaningowego mikroskopu elektronowego komórek i przetrwalników Bacillus circulans Bakterie mogą się poruszać różnymi sposobami. U większości aktywnie pływających bakterii ruch wywoływany jest rotacją rzęsek. Ruch bez udziału rzęsek występuje u bakterii przemieszczających się ruchem ślizgowym (np. bakterie śluzowe) a także u krętków u których ruch wywoływany jest działaniem fibryli. Typy urzęsienia bakterii a) jednobiegunowe monotrychalne, b),c),d) jednobiegunowe politrychalne, e) dwubiegunowe politrychalne, f) perytrychalne W bakteriologii często zachodzi konieczność stosowania dużych powiększeń (np. 1250x), więc mikroskop musi być wyposażony w obiektyw immersyjny. W obiektywie immersyjnym przestrzeń między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym lub rozmazem bakteryjnym wypełniamy olejkiem immersyjnym. Olejek immersyjny stosujemy dlatego ponieważ silna soczewka obiektywu ma bardzo krótką ogniskową i światło przechodzące przez obiekt musi wnikać do soczewki pod bardzo dużym kątem. Jest to możliwe tylko wtedy, gdy przestrzeń pomiędzy obiektywem a obiektem wypełnia płyn o odpowiednim współczynniku załamania światła podobnym do szkła (mniej więcej 1,5). Promienie świetlne w tym wypadku po przejściu ze szkła do olejku immersyjnego nie załamują się i biegną jak gdyby biegły wciąż w

5 szkle (prawa strona poniższego rysunku). W przypadku nie zastosowania olejku immersyjnego promienie świetlne ulegają załamaniu lub odbiciu zatem do obiektywu trafia mniej światła przez co uzyskujemy obraz gorszej jakości (lewa strona poniższego rysunku). Rysunek przedstawiający przebiegi promieni świetlnych przechodzących przez preparat z użyciem i bez użycia olejku immersyjnego Część praktyczna 1. Obserwacja mikroskopowa różnych form bakterii w gotowych preparatach barwionych przy powiększeniu 1250x. a. formy cylindryczne - obserwacja i pomiar komórek metodą pośrednią wg. Matuszewskiego Wykonujemy rysunki bakterii spod mikroskopu wiernie odzwierciedlając kształt i wielkość komórek. Określamy wymiary wykorzystując wykonane rysunki a następnie podstawiamy je do poniższego wzoru. Przykład Długość pozorna komórki = 4mm Szerokośćpozorna komórki = 1 mm Powiększenie mikroskopu=1500x b. formy kuliste - obserwacja mikroskopowa i rysunki form kulistych bakterii coccus

6 diplococcus tetracoccus streptococcus staphylococcus c. formy skręcone - śrubowiec (spirillum) - obserwacja mikroskopowa i rysunki form skręconych bakterii Promieniowce (Actinomycetales), zaliczane wraz z bakteriami do Królestwa Procaryota stanowią dużą grupę organizmów dość zróżnicowanych morfologicznie. Promieniowce są organizmami powszechnie występującymi w różnych naturalnych środowiskach. Można je znaleźć w kompostach, oborniku, mułach rzek i jezior, wodach i ściekach itp. Drobnoustroje zaliczane do rzędu Actinomycetales są na ogół organizmami tlenowymi, chociaż spotyka się wśród nich także i beztlenowce. Szerokość komórki promieniowca wynosi przeciętnie 0,5-1µm. Kształt komórek jest dość różnorodny, jednak najbardziej charakterystyczne są komórki nitkowate, rozgałęzione, podobne do strzępek grzybów i tworzące również grzybnię (mycelium). Typowy promienisty wygląd tych organizmów można zauważyć przy mikroskopowej obserwacji ich wzrostu na podłożach płynnych lub stałych. Strzępki grzybni układają się promieniście od miejsca stanowiącego początek wzrostu (fragment grzybni lub konidium). Wewnątrz strzępek grzybni nie ma błon poprzecznych są to więc organizmy jednokomórkowe. Część grzybni zwykła wrasta w podłoże. Jest to tzw. grzybnia podłożowa lub wegetatywna, stanowiąca zbitą, twardą masę, której nie można naruszyć ezą. Przy nakłuwaniu igły kolonia promieniowca stawia opór w odróżnieniu od kolonii bakteryjnych. Część grzybni, rosnąca ponad podłożem, nosi nazwę grzybni powietrznej. Na daje ona kolonii charakterystyczny pilśniowaty wygląd, ale tworzą ją nie wszystkie promieniowce i nie na wszystkich podłożach. Opisany typ kolonii występuje najczęściej u przedstawicieli rodziny Streptomycetaceae, bardzo rozpowszechnionej w przyrodzie. Przedstawiciele innych rodzin promieniowców (np. rodziny Actinomycetaceae) mogą tworzyć grzybnię, rozpadającą się łatwo na wydłużone, często nabrzmiałe lub kuliste komórki. powstające w ten sposób pojedyncze komórki niczym nie różnią się w wyglądzie zewnętrznym od komórek bakterii właściwych - pałeczek lub ziarniaków. Zdjęcie kolonii promieniowców wyhodowanych na agarze wodnym wysyconym solami mineralnymi i z bibułą filtracyjną jako źródłem węgla

7 Strzępki "grzybni" promieniowca na substracie celulozowym. Preparat ze skaningowego mikroskopu elektronowego. Promieniowce rozmnażają się wegetatywnie przez fragmentację całej grzybni lub przez tworzenie tzw. konidiów. U przedstawicieli rodzaju Streptomyces (rodzina Streptomycetaceae) konidia powstają tylko w grzybni powietrznej wskutek segmentacji strzępek. Strzępki tworzące konidia - konidiofory różnią się na ogół od innych strzępek grubością i wyglądem (np. zgięte, skręcone spiralnie). Wiele szczepów promieniowców produkuje charakterystyczne barwniki, antybiotyki i substancje aromatyczne. Konidiofor Streptomyces. Preparat ze skaningowego mikroskopu elektronowego. Kształty strzępek grzybni promieniowców Streptomyces Micromonospora Srteptosporangium

8 Część praktyczna 2. Obserwacja mikroskopowa mikrohodowli promieniowców z rodzaju Streptomyces - powiększenie 125 i 500x. Obserwacja mikroskopowa hodowli Streptomyces sp. na bloczku z podłoża skrobiowego. Rysunek strzępek płonnych i konidialnych.