Podstawowe metody i podejścia badawcze genetyki. Genomika funkcjonalna, biologia systemów, biologia syntetyczna

Transkrypt

1 Podstawowe metody i podejścia badawcze genetyki Genomika funkcjonalna, biologia systemów, biologia syntetyczna

2 Co to znaczy? TCACAATTTAGACATCTAGTCTTCCACTTAAGCATATTTAGATTGTTTCCAGTTTTCAGCTTTTATGACTAAATCTTCTAAAATTGTTTTTCCCTAAATGTATATTTTAATTTG TCTCAGGAGTAGAATTTCTGAGTCATAAAGCGGTCATATGTATAAATTTTAGGTGCCTCATAGCTCTTCAAATAGTCATCCCATTTTATACATCCAGGCAATATATGAGAG TTCTTGGTGCTCCACATCTTAGCTAGGATTTGATGTCAACCAGTCTCTTTAATTTAGATATTCTAGTACATACAAAATAATACCTCAGTGTAACCTCTGTTTGTATTTCCCT TGATTAACTGATGCTGAGCACATCTTCATGTGCTTATTGACCATTAATTAGTCTTATTTGTTAAATGTCTCAAATATTTTATACAGTTTTACATTGTGTTATTCATTTTTTAAA AAATTCATTTTAGGTTATATGTATGTGTGTGTCAAAGTGTGTGTACATCTATTTGATATATGTATGTCTATATATTCTGGATACCATCTCTGTTTCATGCATTGCATATATATTT GCCTATTTAGTGGTTTATCTTTTCATTTTCTTTTGGTATCTTTTCATTAGAAATGTTATTTATTTTGAGTAAGTAACATTTAATATATTCTGTAACATTTAATGAATCATTTTATG TTATGTTTAGTATTAAATTTCTGAAAACATTCTATGTATTCTACTAGAATTGTCATAATTTTATCTTTTATATACATTGATATTTTTATGTCAAATATGTAGGTATGTGATATTATG CACATGGTTTTAATTCAGTTAATTGTTCTTCCAGATGTTTGTACCATTCCAACATCATTTAAATCATTAAATGAAAAGCCTTTCCTTACTAGCTAGCCAGCTTTGAAAATC CATTCATAGGGTTTGTGTTAATATATTTTTGTTCTTTTTTTTCCTTTCTACTGATCTCTTTATATTAATACCTACTGTGGCTTTATATGAAGTCATGGAATAATACGTAGTAAG CCCTCTAACACTGTTCTGTTACTGTTGTTATTGTTTTCTCAGGGTACTTTGAAATATTCGAGATTTTATTATTTTTTAGTAGCCTAGATTTCAAGATTGTTTTGACGATCAAT TTTTGAATCAATTGTCAATATTTTTAGTAATAAAATGATGATTTTTGATTGGAAATACATTAAATCTATAAGCCAAATTGGAGATTATTGATATATTAACAAAAATGAGTTTTCC AGTCCATGAATGTATGCACATTATAAAATTCATTCTTAAGTATGTCATTTTTTAAGTTTTAGTTTCAGCAGTATATGTTTGTTACATAGGTAAACTCCTGTCATGGGGGTTA GTTGTACAGGTTATTTTATCATCCAGGCATAAAGCCCAGTACCCAGTAGTTATCTTTTCTGCTCCTCTCCCTCCTGTCACCCTCCACTCTCAAGTAGACCCCAGTTTC TGTTGTTCTCTTCTTTGCATTAATGACTTCTCATCATTTAGATTGCACTTGTAAGTGAGAACAGGACGTATGTGGTTTTCTACTCCTGTGTTAGTTTGCTAAGGATAACC ACCTCCATCTCCATCCATGTTCCCACAAAAGACATGATCTCCTTTTTTATGGCTGCATATTATTCCATGGTATATATGTACCACATTTTCTTTATCCAATCTGTCATTGATG GACATTTAGGTTGTTTCCACATCATTGCCGTTGTAAATACTGCTGCAGTGAATATTCGTGTGTATGTCTTTATGGTAGAATGATTTATATTCCTCTGGGTATATTTCCAAGT AATGGGATGGTTGGGTCAAATGGTAATTCTGCTTTTAGCTTTTTGAGGAATTGCCATATTGCCTTTCACAACGGTTGAACTAATTTATACTCCCAAGAGTGTATAAGTTG TTCCTTTTTCTCTGCAACCTCGACATCACCTGTTATTTATGACTTTTATATAATAGCCATTCTGCTGGTCTGAGATGGTATCTCATTATGATTTTGATTTGCATTTCTCTAAT GCTCAGTGATATTGAGCTTGGCTGCATATATGTCTTCTTTTAAAAATATCTGTTCATGTCCTTTGCCTAATTTATAACGGGGTTGTTTGTTTTTCTCTTGTAAATTTGTTTAA GTTCCTTATAGATTCTAGGTATTAAACCTTTTTTCAGAGGCGTGGCTTGCAAATATTTTCTCCCATTCTATAGGTTGTCTGTTTATTCTGTTGATAGTTTCCCTTGCTGTG CAGAAGCTCTTAACTTTAATTAGATCCGACTTGTCAATTTTTGCTTTGGTCGCAATTGCTTTTGATGTTATTGTCGTGAAATCTTTGCTAGTTCTTAGGTCCAGGATGATA TTGCCCAAGTTGTCTTCCAGGGCTTTTATAATTTTGGATTTTACATTTAAGTCTTAATATATTTATTAAATTTGTTAGGGTTTCAGGATACAAGGACAATATAGCAGCAAAC AATGTAAAAGTAAAATCTGAAAAATAATAGAAAACAGTTTAATTGAACACTTTACCATTATGTAATGCCCTTCTTTGTCTTTCCTGATCTTTGTTGGTTTGAAGTTCAAAAA AGACAAACTTAATGGTACAATAGGTATTGTAGATTTCAGGACTTTCTGTATAAAATATTTTGTATATATGAATAGATCATTTTTTATTTCCAGTCTTTAAACATTTTCTTAACAT TTTCTTCTATTGCTTCACTTCACTCGCTAGGACCATCAGGACAGTGTTGAACAGAAATTGTCAGACTGATCATCACAACTTTTTCTAGATTTTAGAAGGAAATTTTTCTT TATTTCAACATAAAGCAGCATGTTAATGCCAAGTTTTAATATGTGTTATCAGATTGAAATTTTTTTGTATATTTCTACATTACCAAGAATTTTTAGCAAGAGTTTTTGTTGAG TTTTAATTTAAAAATCATTTGTTAATTTCATCTGATTTTTTTATTTCTCTTTTTACCTTAAGAGATTAAACTGACTACAGATTGAATATAAACAAACAAACAAACAAACAAAAA CTCTAAAATGCTGTGGATCAACACCACTTAGTAATTTGTATACTTGGATTCAATTTGCTGAAATTTTGTTAGACATTTTTGCGTCGATATTTATGAGGGATGTTGATCTGT AAAAGTATTAAAATGCCTTTGACAGATAGTGTCACCATATAAAAAACTTTGAACAAAATCAGATTATATCACTGTGGATATTTCTATTTTGAACTAACTTAGATGATAATTTT AATCTATATCCTAGATGAACT Mały fragment chromosomu 21

3 Odwrotna genetyka od genu do funkcji Genetyka tradycyjna Genetyka odwrotna Funkcja (mutacja, fenotyp) Gen (z sekwencji całego genomu) Identyfikacja i klonowanie Inaktywacja genu genu Analiza uzyskanego fenotypu Analiza genu

4 Odwrotna genetyka inaktywacja przez rekombinację

5 Odwrotna genetyka interferencja RNA Odkrycie roku 2002 regulacyjna rola małych RNA Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny 2006, za odkrycie mechanizmu interferencji RNA A. Fire i C. Mello

6 sirna - jak to działa? Efekt degradacja mrna Hannon G.J.: RNA interference, Nature 418, July 11, 2002

7 Zastosowania sirna Badanie funkcji genów ( odwrotna genetyka ) - szczególnie skuteczne u nicienia Caenorhabditis, ale działa też w komórkach owadów, ssaków i roślin Hamowanie wybranych genów jako metoda leczenia (np. zwalczania wirusów czy nowotworów) przykład: obniżenie poziomu receptora LDL ( zły cholesterol ) u myszy

8 Redagowanie genomu - system CRISPR/Cas9 System obronny bakterii przed fagami, zaadaptowany do edycji dowolnej sekwencji w genomie. Działa także u organizmów, dla których nie istnieją stabilne wektory. Nature 495, (07 March 2013) doi: /495050a

9 Genomika funkcjonalna Wysokoprzepustowe analizy: ekspresji genów (mikromacierze, RNAseq) proteomu interakcji genetycznych i fizycznych fenotypów

10 Biologia systemów - wyzwanie Przejście od opisu genów (i ich produktów) do opisu działania całych systemów - genomów i komórek Zrozumienie dziedziczenia wieloczynnikowego wymaga stworzenia systemowego modelu współdziałania genów Przejście od opisu części do opisu całości Właściwości emergentne cechy całego systemu nie będące prostą ekstrapolacją cech jego elementów

11 A w biotechnologii? Współczesna biotechnologia molekularna bardzo sprawnie manipuluje pojedynczymi genami ekspresja heterologiczna transgeneza roślin A co z bardziej złożonymi, wieloczynnikowymi cechami?

12 Inżynieria ewolucyjna Brassica oleracea var. silvestris (brzoskiew) Brassica oleracea odmiany uprawne

13 Biologia syntetyczna Współczesna inżynieria genetyczna ograniczona jest do prostych systemów, gdzie za pożądaną funkcję odpowiada jeden lub kilka genów Biologia syntetyczna - projektowanie nowych systemowych właściwości organizmów żywych

14 Podejścia biologii syntetycznej od góry (top-down) - głęboka modyfikacja istniejących systemów minimalne genomy syntetyczne genomy przeprojektowane genomy Przykład - ortogonalny kod genetyczny

15 Pierwszy syntetyczny funkcjonujący genom 2010 Syntetyczny genom M. mycoides JCVIsyn1.0 (~1 mln par zasad) Złożony z 1000 kaset po 1080 pz Składanie z pomocą drożdży znaki wodne

16 Kolejny krok - syntetyczny genom minimalny Na podstawie JCVI-syn1.0 Usunięte geny, które nie są niezbędne do życia (w warunkach laboratorium) 531 kb, 473 geny

17 Inżynieria kodu genetycznego Zmiana kodonu stop na sensowny (może kodować niestandardowy aminokwas) Wprowadzenie równoległego kodu, np. czwórkowego, kodującego niestandradowe aminokwasy Lajoie et al., 2013, Science 342: Davis, L., and Chin, J.W. (2012). Nat Rev Mol Cell Biol 13,

18 Podejście od dołu (bottomup) Repertuar elementów i podstawowych obwodów Matematyczny model elementów Projektowanie i składanie systemów z elementów (cegiełek)

19 Metafora obwodu

20 What I cannot build I cannot understand Richard Feynman

21 Biologia molekularna genu Replikacja i stabilność genomu

22 Lektura Allison, rozdziały 2 i 6 Brown, rozdział 15

23 Funkcje informacji genetycznej Replikacja powielanie genomu, utrzymywanie stabilności genomu Ekspresja Odczytywanie informacji, niezbędne do funkcjonowania komórki Regulowana

24 Materiał genetyczny Bakterie zawierają czynnik transformujący, zdolny do przekazania informacji z martwych bakterii do żywych Frederick Griffiths, 1928

25 Natura materiału genetycznego Czynnikiem transformującym jest DNA Oswald Avery, Colin MacLeod, Maclyn McCarty, 1943

26 Materiał genetyczny Materiałem genetycznym są kwasy nukleinowe Materiałem genetycznym organizmów komórkowych jest kwas deoksyrybonukleinowy (DNA)

27 Budowa DNA DNA zbudowany jest z nukleotydów Łańcuchy mają kierunek 5-3 W cząsteczkach dwuniciowych łańcuchy są przeciwbieżne

28 Zasada komplementarności Na podstawie sekwencji jednej nici można jednoznacznie odtworzyć sekwencję nici komplementarnej 5 GATGTACTGATGACATA3 3 CTACATGACTACTGTAT5 5 GATGTACTGATGACATA3 3 CTACATGACTACTGTAT5

29 Istota replikacji Potomna kopia jest pełnoprawną matrycą umożliwiającą odtworzenie całości informacji

30 Replikacja Model semikonserwatywny: w każdej cząsteczce potomnej jedna nić rodzicielska i jedna nowa doświadczenie Meselsona i Stahla (Brown, r. 15)

31 Synteza DNA - polimeraza Synteza DNA (i RNA też) zawsze zachodzi przez dołączanie nowych nukleotydów do grupy OH na końcu 3 syntetyzowanej cząsteczki zawsze w jednym kierunku! Substratem są trójfosforany nukleotydów, enzymem polimeraza (zależna od DNA polimeraza DNA) Polimeraza DNA potrafi dobudowywać nukleotydy do istniejącego łańcucha, nie potrafi rozpocząć syntezy

32 Etapy replikacji Inicjacja Elongacja Terminacja

33 Inicjacja u bakterii Replikacja rozpoczyna się w miejscu ori Rozplecenie (topnienie) podwójnej helisy DNA

34 Inicjacja u Eukaryota

35 Elongacja

36 Replikacja małego genomu kolistego pętla D

37 Replikacja małego genomu kolistego rolling circle

38 Problem topologiczny Replikacja DNA postępując będzie generować naprężenia (superskręty) W DNA liniowym praktycznie nierozwiązywalne ze względu na upakowanie w komórce W DNA kolistym absolutnie nierozwiązywalne ze względu na brak wolnych końców

39 Problem topologiczny - topoizomerazy Topoizomeraza typu I wprowadza nacięcie w jednej z nici, przesuwa drugą nić przez przerwę i łączy końce Topoizomerazy typu II nacinają obie nici

40 Startery Startery do replikacji zbudowane są z RNA Za ich syntezę odpowiada aktywność prymazy Prymaza (polimeraza RNA zależna od DNA) syntetyzuje starter (RNA) dla polimerazy DNA, która go wydłuża

41 Prymaza U bakterii prymaza to odrębny enzym, syntezę DNA po niej przejmuje polimeraza DNA III U Eukaryota kompleks polimerazy α ma aktywność prymazy i polimerazy DNA - tworzy starter RNA i zapoczątkowuje syntezę DNA, po nim syntezę przejmują inne polimerazy (np. pol δ)

42 Aktywności polimeraz DNA Synteza DNA wszystkie polimerazy (z definicji). Egzonukleaza 3-5 korekcja błędów (większość polimeraz replikacyjnych, ale nie wszystkie). Egzonukleaza 5-3 naprawa uszkodzeń, usuwanie starterów. Niektóre polimerazy bakteryjne, u Eukaryota jest to osobny enzym.

43 Problem nici nieciągłej Na nici nieciągłej trzeba co pewien odcinek ponawiać syntezę startera fragmenty Okazaki

44 Maszyneria replikacyjna

45 Maszyneria replikacyjna Topoizomeraza - usuwa naprężenia Helikaza (DnaB) - rozdziela nici SSB stabilizuje jednoniciowy DNA Prymaza syntetyzuje startery Polimeraza (-y) Ligaza skleja fragmenty

46 Widełki replikacyjne - topologia

47

48 Dodatkowe czynniki Kompleksy białkowe o strukturze przesuwającego się pierścienia (sliding clamp) Zapewniają procesywność Regulacja i koordynacja replikacji Bakterie podjednostka β poliii Archaea PCNA typu arcahea Eukarionty PCNA

49 PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen Kompleks białkowy w formie pierścienia przesuwającego się po nici DNA w czasie replikacji Koordynuje różne etapy replikacji i syntezy DNA

50 Polimerazy bakteryjne PolIII (PolC) główny enzym replikacyjny, ma aktywność Exo 3-5 (korekta błędów), synteza do 1000 nt/s PolIII nie ma aktywności Exo 5-3 PolI (PolA) ma dodatkowo aktywność Exo 5-3, usuwa startery i dokańcza syntezę, do 20 nt/s Ligaza łączy zsyntetyzowane fragmenty (nie jest polimerazą)

51 Polimerazy bakteryjne c.d. PolII (PolB) naprawa uszkodzonego DNA w fazie stacjonarnej PolIV i polv synteza DNA w fazie stacjonarnej (poliv) i przy znacznych uszkodzeniach genomu (polv)

52 Polimerazy Eukaryota Pol α prymaza, wydłuża startery Pol β naprawa DNA Pol δ główny enzym replikacyjny Pol ε replikacja, kontrola cyklu kom., naprawa DNA Pol γ replikacja DNA w mitochondriach Polimerazy eukariotyczne nie mają aktywności Exo 5-3, startery RNA usuwają nukleazy FEN1, RnazaH i inne białka

53 Dwie klasy polimeraz O dużej wierności mało błędów, ale wrażliwe na uszkodzenia w matrycy zatrzymują się w miejscu uszkodzenia standardowe enzymy replikacyjne O niskiej wierności więcej błędów, ale mniej wrażliwe na uszkodzenia matrycy są w stanie kontynuować syntezę mimo uszkodzeń matrycy TLS (translesion synthesis) mechanizm umożliwiający dokończenie replikacji uszkodzonego DNA (zapobiega rearanżacjom genomu)

54 Uszkodzenia DNA i replikacja Obecność uszkodzeń w DNA hamuje inicjację replikacji Jeżeli w trakcie replikacji napotykane są uszkodzenia w DNA to uruchamiane są polimerazy TLS replikacja z błędami jest mniej ryzykowna, niż replikacja niedokończona Przy dużych uszkodzeniach DNA, przekraczających możliwości naprawy u bakterii - uruchomienie systemu SOS (replikacja za wszelką cenę) u wielokomórkowych Eukaryota - zatrzymanie cyklu (G0), apoptoza

55 System SOS u bakterii Przy rozegłych uszkodzeniach matrycy (miejsca AP, fotoprodukty, uszkodzone zasady) Białko RecA pokrywa matrycę Polimeraza V z RecA tworzy mutasom Replikacja zachodzi, ale generuje wiele błędów

56 Rola PCNA Ubikwitynacja i deubikwitynacja PCNA przełącza między replikacją TLS i wierną

57 Trochę zamieszania Synteza DNA rozpoczyna się zawsze od startera RNA? Replikacja DNA rozpoczyna się od miejsca ori?

58 Synteza DNA rozpoczyna się zawsze od startera RNA? Odkryty w 2013 enzym PrimPol, aktywny w mitochondriach ssaków Jest polimerazą DNA typu TLS Jest w stanie zainicjować syntezę DNA od startera z DNA!!

59 Replikacja DNA rozpoczyna się od miejsca ori? Szczep Haloferax volcanii (Archaea) pozbawiony wszystkich miejsc ori Rośnie nawet szybciej od dzikiego Inicjacja replikacji przez rekombinację

60 Problem nici nieciągłej Na nici nieciągłej trzeba co pewien odcinek ponawiać syntezę startera fragmenty Okazaki