PODSTAWY BIOINFORMATYKI 2 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW

Transkrypt

1 PODSTAWY BIOINFORMATYKI 2 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW

2 PROJEKTY POZNANIA INNYCH GENOMÓW Seria ukończone w trakcie scalania w trakcie realizacji

3 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW 1. Sekwencjonowanie 2. Automatyzacja sekwencjonowania 3. Sekwencjonowanie całych genomów Metoda tradycyjna BAC-to-BAC Metoda "shotgun" Metoda "high throughoutput" 4. Zsekwencjonowane genomy - przykłady Człowiek Mysz Bydło 5. Zagadnienia bioinformatyczne

4 SEKWENCJONOWANIE Fred Sanger 2 nagrody Nobla Laboratory of Molecular Biology, Cambridge UK 1970-te metoda sekwencjonowania metoda zakończenia łańcucha DNA

5 SEKWENCJONOWANIE 1. W sekwencjonowaniu prowadzi się 4 osobne reakcje, kaŝda wykorzystuje: Wzorcową nić DNA Primer Polimerazę DNA Deoksyrybonukleotydy 4 Dideoksyrybonukleotydy (kaŝdy w innej reakcji) 2. Denaturacja DNA na pojedyncze nici w temp. 94 C 3. Przyłączenie primera w temp. 55 C 4. Przyłączenie polimerazy w temp. 37 C 5. Replikacja DNA

6 SEKWENCJONOWANIE 6. W przypadku przyłączenia dideoksynukleotydu następuje zakończenie replikacji - zakończenie łańcucha DNA 7. Przyłączenie dideoksynukleotydu jest losowe - otrzymujemy zbiór łańcuchów DNA o róŝnej długości zakończonych np. adeniną 8. Lub innym nukleotydem (w pozostałych reakcjach) 9. Produkty reakcji są poddane elektroforezie - 4 osobne linie dla A, C, T i G 10.Droga wędrówki łańcuchów DNA przez Ŝel zaleŝy od ich długości

7 SEKWENCJONOWANIE 11. Wizualizacja pozycji poszczególnych fragmentów 12. Odczytywanie DNA - rozpoczynając od najkrótszych fragmentów = od dołu 13. Identyfikacja sekwencji nukleotydów 14. Typowa długość łańcucha bp

8 SEKWENCJONOWANIE AUTOMATYCZNE Analiza całych genomów automatyzacja procesu sekwencjonowania Sekwenatory DNA 384 próbki DNA, 24 analizy / doba

9 SEKWENCJONOWANIE AUTOMATYCZNE 1. Substraty do sekwencjonowania? 2. Denaturacja DNA 3. Przyłączenie primera 4. Przyłączenie polimerazy 5. Replikacja 6. Zakończenie 7. Łańcuchy DNA o róŝnych długościach 8. Sekwenator elektroforeza 9. Sekwenator odczytanie fluorescencji A, C, T lub G 10. Program plik wynikowy

10 SEKWENCJONOWANIE CAŁYCH GENOMÓW 1. Metoda tradycyjna BAC-to-BAC 1980 Map based sequencing 2. Metoda shotgun 1997 Whole genome shotgun sequencing 3. Metoda nowej generacji ~2007 Next generation sequencing

11 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW - SHOTGUN DEFRAGMENTACJA DNA fragmenty oczyszczonego DNA kb losowo pocięte fragmenty DNA 2-4 kb

12 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW - SHOTGUN WPROWADZANIE DNA DO PLAZMIDU

13 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW - SHOTGUN WPROWADZANIE DNA DO GENOMU BAKTERII REPLIKACJA MILIARDY KOPII

14 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW - SHOTGUN SEKWENCJONOWANIE FRAGMENTÓW bp

15 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW - SHOTGUN OSTATECZNY WYNIK - SEKWENCJA KONSENSUSOWA

16 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW - SHOTGUN PROGRAMY KOMPUTEROWE: Phrap składanie zsekwencjonowanych fragmentów assembling Consed przygotowywanie ostatecznej sekwencji consensus sequence

17 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW SHOTGUN:BAC-to-BAC BAC-to-BAC SHOTGUN Fragmentacja DNA: 150 kbp Fragmentacja DNA: 2 kbp Konstrukcja bibliotek BAC Konstrukcja bibliotek plazmidowych Konstrukcja ramowej mapy kolejność fragmentów BAC

18 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW SHOTGUN:BAC-to-BAC BAC-to-BAC SHOTGUN Fragmentacja BAC DNA konstrukcja bibliotek M13 Sekwencjonowanie bibliotek M13 Sekwencjonowanie bibliotek plazmidowych Łączenie sekwencji Łączenie sekwencji

19 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW NEXT GENERATION METODA NOWEJ GENERACJI Sekwencjonowanie bardzo krótkich fragmentów bp DNA unieruchomione na płytce Szybkie Tanie Platformy: 454 technology, Solexa, SOLiD

20 ZSEKWENCJONOWANE GENOMY CZŁOWIEK

21 ZSEKWENCJONOWANE GENOMY - CZŁOWIEK ŹRÓDŁO DNA mieszanka DNA róŝnych dawców / Europa / Afryka / Ameryki (pn, centralna, pd) / Azja Craig Venter plemniki krew

22 ZSEKWENCJONOWANE GENOMY - CZŁOWIEK ROZMIARY GENOMU Mbp X Y chromosom

23 ZSEKWENCJONOWANE GENOMY - CZŁOWIEK ROZMIESZCZENIE GENÓW gęstość ge enów X Y chromosom

24 ZSEKWENCJONOWANE GENOMY - CZŁOWIEK CHARAKTERYSTYKA Wielkość: Gbp % par nukleotydów: A T 54 % (ubogie w geny) G C 38 % (bogate w geny) nieznane 9 % Elementy powtarzalne: % genomu Liczba genów: Chromosom najbogatszy w geny: 19 (23 geny/1mbp) Chromosom najuboŝszy w geny: 13 (5 genów/1mbp) Średnia długość genu: bp NajdłuŜszy gen: bp Gen o największej liczbie egzonów: titina (234) 1 gen koduje średnio 3 białka

25 ZSEKWENCJONOWANE GENOMY - CZŁOWIEK DALSZE BADANIA GENOMU 59 % genów ma nieznaną funkcję wpływ genów na zdrowie wpływ na inne cechy człowieka współdziałanie pomiędzy genami imprinting 2 % genomu koduje białka poznanie funkcji pozostałej części genomu Analiza mapy sprzęŝeniowej częstość crossing over u róŝnych płci rekombinacyjne hot- i coldspots

26 ZSEKWENCJONOWANE GENOMY - CZŁOWIEK WYKORZYSTANIE ZDOBYTEJ WIEDZY medycyna rozwój metod diagnostycznych produkcja nowych (specyficznych) leków antropologia badania ewolucji człowieka identyfikacja osobników: kontrola spokrewnienia, kryminalistyka

27 ZSEKWENCJONOWANE GENOMY MYSZ

28 ZSEKWENCJONOWANE GENOMY - MYSZ ZAWARTOŚĆ G+C człowiek mysz

29 ZSEKWENCJONOWANE GENOMY - MYSZ FUNKCJE BIAŁEK człowiek mysz

30 ZSEKWENCJONOWANE GENOMY - MYSZ CHARAKTERYSTYKA Wielkość: 2.5 Gbp Elementy powtarzalne: 38% genomu Liczba genów: % genów myszy ma homologi u człowieka

31 ZSEKWENCJONOWANE GENOMY BYDŁO

32 ZSEKWENCJONOWANE GENOMY - BYDŁO Dominette, Hereford Norwegian red

33 ZSEKWENCJONOWANE GENOMY - BYDŁO QTL: QTL, 91 cech Lic czba QTL cecha

34 ZAGADNIENIA BIOINFORMATYCZNE 1. Łączenie fragmentów DNA Błędy odczytu sekwencji Niekompletne pokrycie genomu Sekwencje powtarzalne Polimorfizm rozmiary danych Programy: Celera Assembler, Jazz, Arachne, Phrap 2. Anotacja genomu identyfikacja strukturalnych i funkcjonalnych elementów genomu Programy: Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)

35 1. Sekwencjonowanie 2. Automatyzacja sekwencjonowania 3. Sekwencjonowanie całych genomów Metoda tradycyjna BAC-to-BAC Metoda "shotgun" Metoda "high throughoutput" 4. Zsekwencjonowane genomy - przykłady Człowiek Mysz Bydło 5. Zagadnienia bioinformatyczne

36