Metody badawcze genetyki i genomiki. Od inżynierii genetycznej do biologii syntetycznej

Transkrypt

1 Metody badawcze genetyki i genomiki Od inżynierii genetycznej do biologii syntetycznej

2 Czym jest inżynieria genetyczna? Ang. recombinant DNA manipulacje DNA in vitro izolacja i amplifikacja DNA i cdna mapowanie i sekwencjonowanie DNA tworzenie nowych cząsteczek DNA przez rekombinację cząsteczek naturalnych przez syntezę de novo wprowadzanie konstruktów DNA do komórek i organizmów modyfikacje syntezy białek ekspresja heterologiczna bioinformatyka

3 A co nie jest inżynierią genetyczną? Inżynieria embrionalna (np. klonowanie) Tworzenie nowych form organizmów przez selekcję

4 Zastosowania Badania podstawowe Biotechnologia Granica między badaniami podstawowymi a stosowanymi jest płynna, stosowane techniki są podobne, różnice dotyczą głównie skali.

5 Podstawowe techniki Izolacja DNA cdna izolacja RNA i przepisanie na DNA Chemiczna synteza DNA de novo PCR Klonowanie DNA Mutageneza losowa i ukierunkowana w tym wprowadzanie modyfikacji do genomu Wykrywanie DNA, RNA i białek Sekwencjonowanie

6 PCR Łańcuchowa reakcja polimerazy Umożliwia namnożenie dowolnego fragmentu DNA, o ile znane są sekwencje otaczające Wykorzystuje właściwość polimerazy DNA - jest w stanie kontynuować syntezę, ale nie rozpoczynać 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458

7 Elektroforeza DNA i RNA 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458

8 Hybrydyzacja Wykorzystanie komplementarności kwasów nukleinowych do wykrywania określonej sekwencji DNA (Southern) lub RNA (Northern) 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458

9 Hybrydyzacja Northern Podstawowa metoda badania poziomu ekspresji genu

10 Podstawowe techniki Enzymy restrykcyjne analiza fragmentów DNA (mapowanie) klonowanie

11 Wektory Umożliwiają utrzymanie DNA wprowadzonego do komórek (transformacja, transfekcja) wektory autonomiczne zdolne do replikacji (np.. plazmidy, wirusy) wektory integracyjne wektory ekspresyjne umożliwiają ekspresję wprowadzonego genu (autonomiczne lub integracyjne) wektory kierujące rekombinacją (ang. targeting) integracyjne wektory bifunkcjonalne

12 Typowy wektor Sekwencje zapewniające replikację (w. autonomiczne) Sekwencje umożliwiające odróżnienie komórek z wprowadzonym wektorem markery selekcyjne Miejsce do wstawienia klonowanego DNA linker Opcjonalnie sekwencje umożliwiające odróżnienie wektora ze wstawką od wektora pustego marker rekombinacji

13 Klonowanie molekularne Włączenie danego fragmentu DNA (wstawki) do wektora autonomicznego

14 Przykłady zastosowań Poznawanie sekwencji DNA (genów, genomów, mutantów) Diagnostyka molekularna Ekologia i filogenetyka molekularna Heterologiczna ekspresja białek (dla celów poznawczych i biotechnologicznych) Odwrotna genetyka inaktywacja wybranych genów u organizmów modelowych Terapia genowa

15 Sekwencjonowanie metody klasyczne 3 ATCGGTGCATAGCTTGT 5 Matryca 5 TAGCCACGTATCGAACA* 3 Produkty reakcji A 5 TAGCCACGTATCGAA* 3 5 TAGCCACGTATCGA* 3 5 TAGCCACGTA* 3 5 TAGCCA* 3 5 TA* 3 Dideoksynukleotydy zatrzymują syntezę na określonych nukleotydach

16 Tradycyjny odczyt sekwencji A T C G Znakowanie radioaktywne, osobne reakcje

17 Sekwencjonowanie automatyczne Dideoksynukleotydy znakowane fluorescencyjnie (4 kolory) Elektroforeza kapilarna

18 Sekwencjonowanie - postęp techniczny Koszt sekwencjonowania między 1999 a 2009 obniżył sie razy Prędkość odczytu sekwencji między 2000 a 2010 r. wzrosła razy Cel: sekwencja genomu jednej osoby za 1000$ osiągalny w ciągu kilku lat Im więcej znamy sekwencji, tym łatwiej poznajemy kolejne

19 Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe Tzw. deep sequencing, sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) Generowanie w jednym przebiegu milionów niezależnych odczytów Pojedyncze odczyty krótkie ( bp) Zastosowania sekwencjonowanie nowych genomów resekwencjonowanie np. analiza zmienności badanie ekspresji przez sekwencjonowanie cdna

20 Sekwencjonowanie Głównym wyzwaniem w sekwencjonowaniu nie jest sam odczyt sekwencji Odczytywane fragmenty są krótkie do ~ nt (sekw. tradycyjne Sangera) nt (454) nt (Solexa) Wyzwaniem jest złożenie długiej sekwencji z tych krótkich fragmentów

21 Genomika Genomika jest dziedziną zajmującą się badaniem całych genomów (kompletu informacji genetycznej) różnych organizmów Techniki biologii molekularnej + robotyka + informatyka Sekwencjonowanie i charakteryzowanie genomów Badanie funkcji zawartych w nich genów

22 Metagenomika Izolacja DNA ze środowiska i sekwencjonowanie Jedyny sposób badania mikroorganizmów, które nie dają się hodować

23 Metagenomika Analiza sekwencji całości DNA wyizolowanego ze zbiorowiska organizmów

24 Odkrycia dzięki sekwencjonowaniu Tajemnicza UCYN-A Sinica (cyjanobakteria) Niewielki genom (1,4mln par zasad, 1200 genów) Brak zdolności fotosyntezy, cyklu Krebsa, syntezy niektórych aminokwasów Zdolność asymilacji azotu Symbioza (gospodarz - haptofit) Candidatus Atelocyanobacterium thalassa

25 Wielkie projekty Projekt 1000 genomów - różnorodność genetyczna człowieka Metagenomika mikrobiomu przewodu pokarmowego człowieka Genomy wymarłych gatunków (np. Neandertalczyk)

26 RNA-seq

27 Sekwencjonowanie nowej generacji wyzwanie dla bioinformatyki Krótkie odczyty ( nt) pojedyncze paired-end Problem identyfikacji i składania sekwencji Indeksowanie i multipleks

28 Genom człowieka

29 Craig Venter Francis Collins (NIH)

30

31 Czym jest znajomość genomu Nie jest odczytaniem księgi życia Sama sekwencja nie daje jeszcze zrozumienia, jak funkcjonują komórki Ale jest niezwykle cennym narzędziem w badaniach Sekwencja nie jest lekarstwem Ale bardzo pomaga w zrozumieniu mechanizmów chorób i wynajdywaniu nowych terapii

32 Co genom już dał nauce Dużo ciekawych i zaskakujących odkryć Dlaczego mamy tak mało genów Jak ewoluował człowiek Narzędzie do badania funkcji genów

33 Czy warto badać genomy Nowoczesne techniki generują bardzo dużo danych Dwa podejścia hypothesis driven dane zbierane dla zweryfikowania jakiejś hipotezy data driven dane zbierane bez wstępnych założeń, potem wyszukiwane w nich prawidłowości

34 Zbieranie danych Podejście zakładające poszukiwanie prawidłowości w dużych zbiorach danych, zbieranych bez wstępnych założeń, może być produktywne Ale niesie też (dobrze znane w literaturze) ryzyko Lem, S. Cyberiada, Wyprawa szósta: czyli jak Trurl i Klapaucjusz demona drugiego rodzaju stworzyli, aby zbójcę Gębona pokonać., academia_2013/022013/ _golik.pdf

35 Co to znaczy? TCACAATTTAGACATCTAGTCTTCCACTTAAGCATATTTAGATTGTTTCCAGTTTTCAGCTTTTATGACTAAATCTTCTAAAATTGTTTTTCCCTAAATGT ATATTTTAATTTGTCTCAGGAGTAGAATTTCTGAGTCATAAAGCGGTCATATGTATAAATTTTAGGTGCCTCATAGCTCTTCAAATAGTCATCCCATTTT ATACATCCAGGCAATATATGAGAGTTCTTGGTGCTCCACATCTTAGCTAGGATTTGATGTCAACCAGTCTCTTTAATTTAGATATTCTAGTACATACAA AATAATACCTCAGTGTAACCTCTGTTTGTATTTCCCTTGATTAACTGATGCTGAGCACATCTTCATGTGCTTATTGACCATTAATTAGTCTTATTTGTTA AATGTCTCAAATATTTTATACAGTTTTACATTGTGTTATTCATTTTTTAAAAAATTCATTTTAGGTTATATGTATGTGTGTGTCAAAGTGTGTGTACATCTAT TTGATATATGTATGTCTATATATTCTGGATACCATCTCTGTTTCATGCATTGCATATATATTTGCCTATTTAGTGGTTTATCTTTTCATTTTCTTTTGGTATCT TTTCATTAGAAATGTTATTTATTTTGAGTAAGTAACATTTAATATATTCTGTAACATTTAATGAATCATTTTATGTTATGTTTAGTATTAAATTTCTGAAAACAT TCTATGTATTCTACTAGAATTGTCATAATTTTATCTTTTATATACATTGATATTTTTATGTCAAATATGTAGGTATGTGATATTATGCACATGGTTTTAATTCAG TTAATTGTTCTTCCAGATGTTTGTACCATTCCAACATCATTTAAATCATTAAATGAAAAGCCTTTCCTTACTAGCTAGCCAGCTTTGAAAATCCATTCAT AGGGTTTGTGTTAATATATTTTTGTTCTTTTTTTTCCTTTCTACTGATCTCTTTATATTAATACCTACTGTGGCTTTATATGAAGTCATGGAATAATACGTA GTAAGCCCTCTAACACTGTTCTGTTACTGTTGTTATTGTTTTCTCAGGGTACTTTGAAATATTCGAGATTTTATTATTTTTTAGTAGCCTAGATTTCAAG ATTGTTTTGACGATCAATTTTTGAATCAATTGTCAATATTTTTAGTAATAAAATGATGATTTTTGATTGGAAATACATTAAATCTATAAGCCAAATTGGAGA TTATTGATATATTAACAAAAATGAGTTTTCCAGTCCATGAATGTATGCACATTATAAAATTCATTCTTAAGTATGTCATTTTTTAAGTTTTAGTTTCAGCAG TATATGTTTGTTACATAGGTAAACTCCTGTCATGGGGGTTAGTTGTACAGGTTATTTTATCATCCAGGCATAAAGCCCAGTACCCAGTAGTTATCTTTT CTGCTCCTCTCCCTCCTGTCACCCTCCACTCTCAAGTAGACCCCAGTTTCTGTTGTTCTCTTCTTTGCATTAATGACTTCTCATCATTTAGATTGCA CTTGTAAGTGAGAACAGGACGTATGTGGTTTTCTACTCCTGTGTTAGTTTGCTAAGGATAACCACCTCCATCTCCATCCATGTTCCCACAAAAGAC ATGATCTCCTTTTTTATGGCTGCATATTATTCCATGGTATATATGTACCACATTTTCTTTATCCAATCTGTCATTGATGGACATTTAGGTTGTTTCCACAT CATTGCCGTTGTAAATACTGCTGCAGTGAATATTCGTGTGTATGTCTTTATGGTAGAATGATTTATATTCCTCTGGGTATATTTCCAAGTAATGGGATG GTTGGGTCAAATGGTAATTCTGCTTTTAGCTTTTTGAGGAATTGCCATATTGCCTTTCACAACGGTTGAACTAATTTATACTCCCAAGAGTGTATAAG TTGTTCCTTTTTCTCTGCAACCTCGACATCACCTGTTATTTATGACTTTTATATAATAGCCATTCTGCTGGTCTGAGATGGTATCTCATTATGATTTTGA TTTGCATTTCTCTAATGCTCAGTGATATTGAGCTTGGCTGCATATATGTCTTCTTTTAAAAATATCTGTTCATGTCCTTTGCCTAATTTATAACGGGGTT GTTTGTTTTTCTCTTGTAAATTTGTTTAAGTTCCTTATAGATTCTAGGTATTAAACCTTTTTTCAGAGGCGTGGCTTGCAAATATTTTCTCCCATTCTATA GGTTGTCTGTTTATTCTGTTGATAGTTTCCCTTGCTGTGCAGAAGCTCTTAACTTTAATTAGATCCGACTTGTCAATTTTTGCTTTGGTCGCAATTGC TTTTGATGTTATTGTCGTGAAATCTTTGCTAGTTCTTAGGTCCAGGATGATATTGCCCAAGTTGTCTTCCAGGGCTTTTATAATTTTGGATTTTACATTT AAGTCTTAATATATTTATTAAATTTGTTAGGGTTTCAGGATACAAGGACAATATAGCAGCAAACAATGTAAAAGTAAAATCTGAAAAATAATAGAAAAC AGTTTAATTGAACACTTTACCATTATGTAATGCCCTTCTTTGTCTTTCCTGATCTTTGTTGGTTTGAAGTTCAAAAAAGACAAACTTAATGGTACAATA GGTATTGTAGATTTCAGGACTTTCTGTATAAAATATTTTGTATATATGAATAGATCATTTTTTATTTCCAGTCTTTAAACATTTTCTTAACATTTTCTTCTATT GCTTCACTTCACTCGCTAGGACCATCAGGACAGTGTTGAACAGAAATTGTCAGACTGATCATCACAACTTTTTCTAGATTTTAGAAGGAAATTTTT CTTTATTTCAACATAAAGCAGCATGTTAATGCCAAGTTTTAATATGTGTTATCAGATTGAAATTTTTTTGTATATTTCTACATTACCAAGAATTTTTAGCAA GAGTTTTTGTTGAGTTTTAATTTAAAAATCATTTGTTAATTTCATCTGATTTTTTTATTTCTCTTTTTACCTTAAGAGATTAAACTGACTACAGATTGAATAT AAACAAACAAACAAACAAACAAAAACTCTAAAATGCTGTGGATCAACACCACTTAGTAATTTGTATACTTGGATTCAATTTGCTGAAATTTTGTTAG ACATTTTTGCGTCGATATTTATGAGGGATGTTGATCTGTAAAAGTATTAAAATGCCTTTGACAGATAGTGTCACCATATAAAAAACTTTGAACAAAATC AGATTATATCACTGTGGATATTTCTATTTTGAACTAACTTAGATGATAATTTTAATCTATATCCTAGATGAACT Mały fragment chromosomu 21

36 Odwrotna genetyka od genu do funkcji Genetyka tradycyjna Genetyka odwrotna Funkcja (mutacja, fenotyp) Gen (z sekwencji całego genomu) Klonowanie genu Inaktywacja genu Analiza sklonowanego genu Analiza uzyskanego fenotypu

37 Odwrotna genetyka inaktywacja przez rekombinację

38 Inaktywacja warunkowa System Cre-Lox Wprowadzenie do genomu miejsc Lox Ekspresja rekombinazy Cre powoduje wycięcie fragmentu pomiędzy miejscami Lox

39 Odwrotna genetyka interferencja RNA Odkrycie roku 2002 regulacyjna rola małych RNA Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny 2006, za odkrycie mechanizmu interferencji RNA A. Fire i C. Mello

40 sirna - jak to działa? Efekt degradacja mrna Hannon G.J.: RNA interference, Nature 418, July 11, 2002

41 Zastosowania sirna Badanie funkcji genów ( odwrotna genetyka ) - szczególnie skuteczne u nicienia Caenorhabditis, ale działa też w komórkach owadów, ssaków i roślin Hamowanie wybranych genów jako metoda leczenia (np. zwalczania wirusów czy nowotworów) przykład: obniżenie poziomu receptora LDL ( zły cholesterol ) u myszy

42 Myszy knock-out Izolacja komórek ES (zarodkowe macierzyste) z blastocysty Dawcą jest mysz szczepu białego Modyfikacja i selekcja komórek ES z knock-out

43 Myszy knock-out Wprowadzenie zmodyfikowanych komórek do blastocysty myszy szczepu szarego

44 Myszy knock-out Blastocysty zawierające zmodyfikowane komórki ES wszczepia się myszy matce zastępczej

45 Myszy knock-out Selekcja chimer z transgenem w linii płciowej

46 Redagowanie genomu - system CRISPR/Cas9 System obronny bakterii przed fagami, zaadaptowany do edycji dowolnej sekwencji w genomie. Działa także u organizmów, dla których nie istnieją stabilne wektory. Nature 495, (07 March 2013) doi: /495050a

47 Biologia systemów Postęp biologii molekularnej - genomika Ogromne zbiory danych Ujawnienie złożoności interakcji genetycznych leżących u podstaw fenotypu Narzędzia teoretyczne do systemowego opisu życia

48 Biologia systemów - wyzwanie

49 A w biotechnologii? Współczesna biotechnologia molekularna bardzo sprawnie manipuluje pojedynczymi genami ekspresja heterologiczna transgeneza roślin A co z bardziej złożonymi, wieloczynnikowymi cechami?

50 Inżynieria ewolucyjna

51 Inżynieria ewolucyjna Brassica oleracea var. silvestris (brzoskiew) Brassica oleracea odmiany uprawne

52

53 Biologia syntetyczna Współczesna inżynieria genetyczna ograniczona jest do prostych systemów, gdzie za pożądaną funkcję odpowiada jeden lub kilka genów Biologia syntetyczna - projektowanie nowych systemowych właściwości ogranizmów żywych

54 Podejścia biologii syntetycznej od góry (top-down) - głęboka modyfikacja istniejących systemów minimalne genomy syntetyczne genomy przeprojektowane genomy Przykład - ortogonalny kod genetyczny

55 Inżynieria kodu genetycznego Zmiana kodonu stop na sensowny (może kodować niestandardowy aminokwas) Wprowadzenie równoległego kodu, np. czwórkowego, Lajoie et al., 2013, Science 342: kodującego niestandradowe aminokwasy Davis, L., and Chin, J.W. (2012). Nat Rev Mol Cell Biol 13,

56 Podejście od dołu (bottom-up) Repertuar elementów i podstawowych obwodów Matematyczny model elementów Projektowanie i składanie systemów z elementów (cegiełek)

57 Metafora obwodu

58 Metafora obwodu

59 What I cannot build I cannot understand Richard Feynman