Korelacja ekspresji mrna czynnika transkrypcyjnego FOXP3 i białka FOXP3 w limfocytach regulatorowych T u chorych na astmę oskrzelową

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2014; 50(3): Praca oryginalna Original Article Korelacja ekspresji mrna czynnika transkrypcyjnego FOXP3 i białka FOXP3 w limfocytach regulatorowych T u chorych na astmę oskrzelową Correlation between expression of FOXP3 transcriptional factor mrna and FOXP3 in regulatory T lymphocytes in patients with bronchial asthma Katarzyna Boryczka 1, Łukasz Kraszula 1, Makandjou-Ola Eusebio 1, Maciej Kupczyk 2, Piotr Kuna 2, Mirosława Pietruczuk 1 1 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, II Katedra Chorób Wewnętrznych, UM w Łodzi 2 Klinika Chorób Wewnętrznych, Astmy i Alergii, II Katedra Chorób Wewnętrznych, UM w Łodzi Streszczenie Czynnik transkrypcyjny FOXP3 jest niezbędny w procesie aktywacji oraz prawidłowego rozwoju i funkcjonowania limfocytów T. Celem prezentowanej pracy była ocena ekspresji czynnika transkrypcyjnego FOXP3 w regulatorowych limfocytach T i sprawdzenie czy istnieje korelacja pomiędzy ekspresją czynnika transkrypcyjnego FOXP3 na poziomie białka i mrna. Do badania zakwalifikowano 52 pacjentów z rozpoznaną astmą oskrzelową (27 z astmą ciężką i 25 z astmą umiarkowaną-łagodną). Grupa kontrolna liczyła 25 zdrowych osób. Oceniano ekspresję czynnika FOXP3 w regulatorowych limfocytach T na poziomie molekularnym wykorzystując metodę NASBA oraz sond TaqMan, a także na poziomie białka wykorzystując cytometrię przepływową. Wykazano istotne statystycznie różnice w stężeniu białka FOXP3 we wszystkich grupach. Stwierdzono brak korelacji pomiędzy stężeniem białka FOXP3 a ilością mrna. Summary FOXP3 transcriptional factor is essential for the activation, development and function of T lymphocytes. We examined the expression of the transcriptional factor FOXP3 in regulatory T lymphocytes and searched for the correlation between the expression of FOXP3 protein and mrna FOXP3. The study included 52 patients diagnosed with asthma (27 with severe asthma and 25 with moderate-mild asthma). The control group consisted of 25 healthy people. The expression of FOXP3 in regulatory T cells was assayed on molecular level using NASBA method and TaqMan probes, and on protein level using multi-color flow cytometry. There was statistically significant increase of the concentration of transcriptional factor FOXP3 in all groups. We did not notice any correlation between the expression of the transcription factor FOXP3 and mrna FOXP3. Słowa kluczowe: astma, limfocyty Treg, FOXP3 Key words: asthma, Treg cells, FOXP3 Wstęp Badania nad limfocytami regulatorowymi (Treg) trwają od wielu lat. Komórki te odgrywają podstawową rolę w regulowaniu odpowiedzi immunologicznej. Subpopulacja limfocytów regulatorowych T jest heterogenną fenotypowo grupą komórek, odpowiedzialnych za kontrolę funkcjonowania układu immunologicznego na drodze aktywnej supresji. Wyróżnia się w niej: grasicze limfocyty regulatorowe (ntreg) o immunofenotypie CD4 + CD25highCD127lowFoxp3 + oraz indukowane limfocyty regulatorowe (itreg) [1]. Wiadomo, że limfocyty regulatorowe funkcję supresorową pełnią poprzez bezpośrednie lub pośrednie oddziaływanie na komórki efektorowe, które uczestniczą w reakcji zapalnej [2]. Grasicze limfocyty Treg stanowią 5% do 10% populacji obwodowych limfocytów T CD4 +, i około 3% wszystkich limfocytów. Powstają one głównie w grasicy, a niewielka ilość również na obwodzie [3, 4]. Limfocyty regulatorowe T CD4 + ze względu na pełnioną funkcję mają zdolność do hamowania odpowiedzi immunologicznej w stosunku do antygenów własnych oraz zapobiegania nadmiernej odpo- 201

2 wiedzi na czynniki zewnętrzne [5]. Z uwagi na niedostateczne hamowanie odpowiedzi efektorowych limfocytów T, komórkom Treg przypisuje się istotną rolę w patogenezie astmy. Do prawidłowego rozwoju i pełnienia funkcji przez limfocyty Treg niezbędna jest ekspresja cząstki FOXP3 białka kluczowego w procesie powstawania i nabywania funkcji supresorowych przez limfocyty Treg [6]. Białko FOXP3 zbudowane z 431 aminokwasów, należące do rodziny Forkhead/winged helix czynników transkrypcyjnych, zawiera cztery potencjalnie funkcjonalne domeny: represorową, domenę palca cynkowego, domenę zamka leucynowego oraz domenę FKH, które determinują jego działanie [7]. Czynnik FOXP3 reguluje transkrypcję poprzez łączenie się z odpowiednimi promotorami, poprzez interakcje ze specyficznymi dla danego locus czynnikami transkrypcyjnymi oraz poprzez rekrutację deacetylaz i acetylotransferaz histonów, co skutkuje reorganizacją chromatyny i hamuje lub inicjuje transkrypcję [8, 9, 10]. U myszy wykrywa się jedynie jedną postać białka Foxp3, natomiast u ludzi, poza białkiem podstawowym (FOXP3), obecne są co najmniej dwie izoformy tego czynnika transkrypcyjnego FOXP3Δ2 i FOXP3Δ7. Izoforma FOXP3Δ7 nie zawiera eksonu siódmego, natomiast izoforma FOXP3Δ2 pozbawiona jest eksonu drugiego, który koduje region niezbędny do interakcji z jądrowymi receptorami sierocymi (retinoid-related orphan receptor) RORα i RORγ [11]. Czynnik transkrypcyjny FOXP3 jest białkiem wewnątrzkomórkowym, więc ocena jego ekspresji nie należy do najprostszych. Nie istnieją wystandaryzowane metody oceny ekspresji tego czynnika, jednak ze względu na małą liczbę limfocytów Treg istotna jest technika badawcza stosowana do identyfikacji czynnika FOXP3. W związku z tym do oceny ekspresji czynnika transkrypcyjnego FOXP3 na poziomie białka w komórkach Treg wykorzystano technikę wielokolorowej cytometrii przepływowej. Celem niniejszej pracy była ocena ekspresji na poziomie molekularnym (badając ekspresję mrna) oraz na poziomie białka (badając gotowy produkt translacji). Pomiar ekspresji na poziomie białka, pozwolił na określenie faktycznej ilości czynnika FOXP3 zdolnego do prawidłowego funkcjonowania i pełnienia swojej funkcji. Natomiast pomiar ekspresji mrna dał wgląd w poprawność samego procesu transkrypcji i powstawania matryc do syntezy białka. Porównanie tych dwóch zmiennych pozwoliło na wskazanie poprawności procesu translacji, a także wiążących się z nim dalszych konsekwencji, jak na przykład powstawania wystarczającej ilości funkcjonalnego białka. Materiał i metody Do badania zakwalifikowano 52 pacjentów z rozpoznaną astmą oskrzelową (27 chorych z ciężką i 25 z umiarkowaną-łagodną astmą oskrzelową) leczonych w Poradni Przyklinicznej Kliniki Chorób Wewnętrznych, Astmy i Alergii, Uniwersyteckiego Szpitala Klinicznego Nr 1 w Łodzi. Grupę kontrolną stanowiło 25 zdrowych ochotników, w tym samym przedziale wiekowym i zbliżonym rozkładzie płci, jak w grupie badanej. W badaniu wzięły udział wyłącznie osoby niepalące tytoniu. Rozpoznanie astmy oskrzelowej potwierdzono na podstawie wywiadu i zmienności obturacji dróg oddechowych, zgodnie z powszechnie akceptowanymi zaleceniami GINA Stopień ciężkości choroby oceniono zgodnie z definicją użytą w badaniach grupy ENFUMOSA. Pacjenci chorzy na astmę ciężką, w ramach stałego leczenia przyjmowali wysokie dawki glikokortykosteroidów wziewnych (co najmniej 1600 μg/dobę budesonidu lub beklometazonu, 800 μg/ dobę flutikazonu lub równoważnika). W przypadku przewlekłej doustnej sterydoterapii, wymagane dawki leków wynosiły 800 μg/ dobę budesonidu lub beklometazonu, 400 μg/dobę flutikazonu lub równoważnika. Pacjenci z astmą ciężką wymagali przewlekłej terapii długo działającym agonistą lub doustną teofiliną, a w roku poprzedzającym włączenie do badania wystąpiło u nich co najmniej jedno zaostrzenie choroby podstawowej. Pacjenci z astmą łagodną otrzymywali wyłącznie glikokortykosteroidy wziewne (maksymalnie 800 μg budesonidu lub równoważnika na dobę) oraz leczenie objawowe. Projekt badawczy uzyskał zgodę nr RNN/50/13/KE Komisji Bioetycznej przy Uniwersytecie Medycznym w Łodzi. Materiałem badanym była krew żylna pobrana na wersenian dwupotasowy. Z pobranej krwi (8 ml od każdego uczestnika) izolowano komórki jednojądrzaste wykorzystując podłoże Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich) (wirowanie 2500 obrotów na minutę przez 30 minut). Po izolacji oznaczano bezwzględną liczbę i odsetek komórek jednojądrzastych przy wykorzystaniu analizatora Pentra DX 120. Limfocyty CD4 + CD25 + wysortowano w procesie separacji dwustopniowej (Miltenyi Biotec, Stany Zjednoczone). W pierwszym etapie wysortowano limfocyty CD4 +, natomiast w etapie drugim z subpopulacji limfocytów CD4 + wysortowano limfocyty CD4 + CD25 +. Do wyznakowania limfocytów użyto przeciwciał monoklonalnych zgodnie z instrukcją firmową (BD Bioscience), a pomiaru dokonywano przy użyciu cytometru przepływowego BD FACS CANTO II. Do oceny ekspresji czynnika transkrypcyjnego FOXP3 zastosowano klon przeciwciała Anti Human FoxP3 (klon 259D/C7) (BD Pharmingen). Barwienie wewnątrzkomórkowego czynnika transkrypcyjnego FOXP3 przeprowadzano po utrwaleniu, permabilizacji i 30-minutowej inkubacji limfocytów, zgodnie z instrukcją producenta (BD Bioscience). Ocenę ekspresji mrna dla czynnika transkrypcyjnego FOXP3 wykonano techniką Real-time PCR stosując sondy TaqMan. Zastosowanie tej metody pozwoliło na przedstawienie wyników przeprowadzonych badań w postaci ilości mrna w każdej badanej próbce względem ilości mrna w materiale kontrolnym, wyrażonych jako współczynnik RQ (Relative Quantity). W metodzie wykorzystującej sondy TaqMan całkowity RNA izolowano przy użyciu zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen), zgodnie z dołączoną instrukcją firmową. Czystość całkowitego RNA oznaczano spektrofotometrycznie (PicoDrop) na podstawie stosunku absorbancji 260/280 nm. Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzono również z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego zestawu QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen), zgodnie z instrukcją producenta. Do przeprowadzenia reakcji real-time PCR zastosowano zestawy odczynników TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) dla genu FORKHEAD BOX P3 (FOXP3, Hs _m1) oraz kontrolę endogenną beta-aktynę (ACTB, Hs _m1). Reakcję prowadzono w standardowych warunkach (40 cykli: 202

3 Diagn Lab 2014; 50(3): C, 15 sek. i 60 C, 1 min). Uzyskane wyniki analizowano za pomocą programu Sequence Detection System 2.4 (Applied Biosystems). Względną ilość (RQ) badanego mrna obliczano z równania RQ=2-ΔΔCt (gdzie: ΔCt różnica cyklu progowego (Ct) pomiędzy genem badanym i kontrolą endogenną, ΔΔCt względna zmiana tych różnic w odniesieniu do próby kontrolnej). Stężenie mrna określano stosując procedurę NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification). W metodzie tej ekstrakcję kwasu RNA przeprowadzono z wykorzystaniem systemu do magnetycznej ekstrakcji kwasów nukleinowych NucliSens kowaną-łagodną i w grupie kontrolnej. Rycina 1. Odsetek limfocytów regulatorowych T CD4 + CD25 + FOXP3 + u osób chorych na astmę ciężką, astmę umiar- minimag w oparciu o technologię Boom a. Do amplifikacji i detekcji w czasie rzeczywistym wykorzystano automatyczny system do ekstrakcji kwasów nukleinowych tów Treg CD4 + CD25 + FOXP3 + pomiędzy grupą chorych na astmę zaobserwowano istotnych statystycznie różnic w odsetku limfocy- NucliSens EasyMAG w oparciu o technologię NASBA. Stężenie umiarkowaną-łagodną a grupą kontrolną (ryc. 1). mrna, w materiale badanym, odczytywano z krzywej wzorcowej Najwyższą ekspresję mrna czynnika transkrypcyjnego FOXP3 utworzonej do kalibracji aparatu, zgodnie z instrukcją producenta zaobserwowano w grupie osób chorych na astmę ciężką, a najniższą w grupie kontrolnej. Wykazano statystycznie istotne różnice testu. Otrzymane wyniki opracowano statystycznie z wykorzystaniem w ekspresji mrna pomiędzy badanymi grupami (ryc. 2). programu STATISTICA. Do oceny statystycznej wykorzystano testy nieparametryczne, ponieważ wyniki nie wykazały rozkładu w limfocytach Treg CD4 + CD25 + FOXP3 + zaobserwowano w gru- Najwyższe stężenie mrna czynnika transkrypcyjnego FOXP3 normalnego. W celu porównania grup niezależnych zastosowano pie chorych na astmę ciężką, a najniższe w grupie kontrolnej. We test Kruskala-Wallis a. Do porównania par grup zależnych użyto wszystkich grupach wykazano duży rozrzut otrzymanych wyników. Dlatego też różnice pomiędzy badanymi grupami nie były testu U Mann a-whitney a. Aby określić istotność statystyczną zmian badanych parametrów w danej grupie, zastosowano test istotne statystycznie (ryc. 3). Wilcoxona dla par obserwacji. Analizując korelację obliczano W badanych grupach nie wykazano korelacji pomiędzy odsetkiem współczynnik rang Spearmana. Za poziom istotny statystycznie limfocytów Treg CD4 + CD25 + wykazujących ekspresję FOXP3 a eksprzyjęto wartość p 0,05. Wyniki Wykazano istotne statystycznie różnice w odsetku limfocytów Treg CD4 + CD25 + wykazujących ekspresję czynnika transkrypcyjnego FOXP3. Najwyższy odsetek limfocytów Treg CD4 + CD25 + FOXP3 + zaobserwowano w grupie kontrolnej, natomiast najmniejszym odsetkiem charakteryzowała się grupa osób chorych na astmę ciężką. Istotne statystycznie różnice w odsetku limfocytów Treg CD4 + CD25 + wykazujących ekspresję czynnika transkrypcyjnego FOXP3 stwierdzono pomiędzy grupą osób chorych na astmę ciężką i grupą kontrolną oraz pomiędzy grupą chorych na astmę ciężką a grupą chorych na astmę umiarkowaną-łagodną. Nie Rycina 2. Ekspresja mrna czynnika transkrypcyjnego FOXP3 w limfocytach regulatorowych T CD4 + CD25 + FOXP3 + u osób chorych na astmę ciężką, astmę umiarkowaną-łagodną i w grupie kontrolnej. 203

4 Rycina 3. Stężenie mrna czynnika transkrypcyjnego FOXP3 w limfocytach regulatorowych T CD4 + CD25 + FOXP3 + u osób chorych na astmę ciężką, astmę umiarkowaną-łagodną i w grupie kontrolnej. presją mrna czynnika transkrypcyjnego FOXP3 oraz pomiędzy ekspresją mrna czynnika transkrypcyjnego FOXP3 a jego stężeniem. W przeprowadzonych badaniach wykazano jedynie dodatnią korelację pomiędzy odsetkiem limfocytów regulatorowych T FOXP3 + a przyjmowaną doustną dawką glikokortykosteroidów. Dyskusja Regulatorowe limfocyty T (Treg) kontrolują aktywność autoreaktywnych limfocytów T nie eliminowanych w grasicy i są odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy układu odpornościowego [4]. Wykazano, że najbardziej charakterystycznym markerem limfocytów regulatorowych T CD4 + CD25 + jest czynnik transkrypcyjny FOXP3, który jest represorem transkrypcji genu dla IL-2 [5, 12, 13, 14]. Jest to cytoplazmatyczne białko niezbędne w procesie prawidłowego rozwoju oraz funkcjonowania limfocytów regulatorowych T, zarówno grasiczych (ntreg), jak i indukowanych (itreg) [15, 16, 17]. W ostatnich latach, dysfunkcji grasiczych limfocytów regulatorowych T CD4 + CD25 + FOXP3 + przypisuje się dużą rolę w patogenezie astmy [4, 18]. Dostępne dane literaturowe wskazują na udział grasiczych limfocytów regulatorowych T CD4 + CD25 + w rozwoju astmy [19]. Uważa się, że zmieniona liczebność populacji limfocytów ntreg lub zaburzenia ich rozwoju / funkcji są przyczyną nadmiernej odpowiedzi zapalnej obserwowanej w przebiegu astmy [20]. Dane z piśmiennictwa, dotyczące odsetka regulatorowych limfocytów T wykazujących ekspresję czynnika transkrypcyjnego FOXP3 u osób chorych na astmę są niejednoznaczne. W przeprowadzonych badaniach zaobserwowano znamienne różnice w odsetku limfocytów Treg wykazujących ekspresję czynnika transkrypcyjnego FOXP3 pomiędzy grupą osób chorych na astmę ciężką (najniższy odsetek Treg FOXP3 + ) a grupą osób zdrowych (najwyższy odsetek Treg FOXP3 + ). Podobnie przedstawiają się wyniki uzyskane przez Mamessier i wsp. [21]. W badaniach tych określano ilość limfocytów ntreg w okresie zaostrzenia astmy i wykazano obniżenie odsetka grasiczych limfocytów regulatorowych T. Podobnie przedstawiają się wyniki uzyskane przez Xue i wsp., którzy dodatkowo zaobserwowali obniżenie ekspresji mrna czynnika transkrypcyjnego FOXP3 w limfocytach ntreg u chorych na astmę [22]. Odmienne wyniki przedstawili Shi i wsp., których badania przeprowadzone na wysortowanych limfocytach CD4 + CD25 +, nie wykazały różnic w liczbie limfocytów Treg pomiędzy grupą chorych na astmę a grupą osób zdrowych. Badacze ci zaobserwowali wzrost liczby limfocytów Treg w trakcie zaostrzenia choroby. Stwierdzili jednak, że u chorych ze stabilną astmą liczba limfocytów Treg nie uległa istotnym zmianom. Wykazali, że komórki te hamowały proliferację limfocytów T efektorowych oraz produkcję cytokin. W tych badaniach nie oznaczano jednak ekspresji czynnika transkrypcyjnego FOXP3 w Treg [23]. Wydaje się, że rozbieżności w wynikach badań mogą być efektem dużej zmienności osobniczej subpopulacji limfocytów regulatorowych [20, 24] oraz stosowania różnych technik oznaczania i markerów specyficznych dla limfocytów ntreg. W terapii astmy powszechnie stosowanymi lekami są glikokortykosteroidy, które działają na różnych etapach procesu zapalnego. Zmniejszają one ekspresję cząsteczek powierzchniowych biorących udział w reakcjach zapalnych, hamują migrację leukocytów do miejsc zapalenia, a także redukują uwalnianie prozapalnych mediatorów poprzez wpływ na ekspresję czynników transkrypcyjnych. Przeprowadzone badania wyraźnie pokazały, że ekspresja mrna czynnika transkrypcyjnego FOXP3 jest najwyższa u osób chorych na ciężką postać astmy, a najniższa u osób zdrowych. Obserwacje te są zgodne z wynikami innych autorów. Badania Provoost i wsp. wykazały, że u osób chorych na astmę przyjmujących wziewne glikokortykosteroidy, stężenie mrna czynnika transkrypcyjnego FOXP3 było wyższe niż w grupie osób zdrowych. Równocześnie zaobserwowano obniżoną ekspresję białka FOXP3 u pacjentów ze stabilną astmą oskrzelową w porównaniu do osób zdrowych [25]. Badania zaprezentowane przez Karagianndis i wsp. pokazały wzrost aktywacji limfocytów Treg u osób chorych na astmę leczonych glikortykosteroidami. Badacze stwierdzili również, że ekspresja mrna czynnika transkrypcyjnego FOXP3 jest znacznie podwyższona u pacjentów z astmą otrzymujących leczenie glikokortykosteroidami wziewnymi oraz systemowymi lub obydwoma rodzajami. Wzrost aktywności limfocytów Treg u pacjentów chorych na astmę leczonych glikortykosteroidami demonstrował się zwiększoną ekspresją mrna dla IL-10, co korelowało z ekspresją czynnika transkrypcyjnego FOXP3 [26]. Badania te sugerują, że jednym z mechanizmów działania glikokortykosteroidów może być przesunięcie odpowiedzi immunologicznej w kierunku immunosupresji, co prowadzi do przywrócenia równowagi pomiędzy subpopulacjami limfocytów. W przedstawionych badaniach poszukiwano zlezności pomiędzy zbadaną ekspresją mrna czynnika transkrypcyjnego FOXP3 204

5 Diagn Lab 2014; 50(3): a stężeniem mrna. Zaobserwowana ekspresja mrna FOXP3 nie wykazała jednak korelacji ze stężeniem mrna FOXP3. Prawdopodobnie może to być następstwem zastosowania dwóch nieporównywalnych ze sobą technik lub dużej zmienności osobniczej limfocytów Treg. Analizując proces powstawania białka od momentu transkrypcji do etapu translacji można przypuszczać, że będzie istniała dodatnia korelacja pomiędzy ilością mrna, a stężeniem produktu końcowego białka. W przedstawionych badaniach nie wykazano jednak korelacji pomiędzy ekspresją mrna czynnika transkrypcyjnego FOXP3, a odsetkiem limfocytów CD4 + CD25 + FOXP3 +. Ta różnica może być spowodowana przyjmowaniem wziewnych glikortykosteroidów powodujących wzrost transkrypcji mrna czynnika transkrypcyjnego FOXP3 lub możliwości zachodzenia procesów w limfocytach regulatorowych T mających wpływ na translację białka FOXP3. Obydwa te mechanizmy są prawdopodobne, gdyż wiadomo że glikokortykosteroidy mają hamujący wpływ na metabolizm materiału posttranskrypcyjnego oraz na translację [27]. Wiadomo również, że istnieje kilka mechanizmów, dzięki którym limfocyty regulatorowe T pełnią swoją funkcję supresyjną. Uzasadnione więc wydaje się przypuszczenie, że w limfocytach regulatorowych T zachodzą jeszcze inne procesy zaburzające ich funkcje supresyjne, które wymagają dalszego poznania. Wnioski: Najwyższą ekspresję mrna dla czynnika transkrypcyjnego FOXP3 wykazano w limfocytach regulatorowych T CD4 + CD25 + FOXP3 + osób chorych na astmę ciężką, co może być spowodowane przyjmowaniem wysokich dawek glikokortykosteroidów. Wysoka ekspresja mrna dla czynnika transkrypcyjnego FOXP3 nie ma odzwierciedlenia w ekspresji samego czynnika transkrypcyjnego. Wyniki badań potwierdzają, że osłabienie funkcji supresyjnych limfocytów regulatorowych T w grupie osób chorych na astmę ciężką może wynikać z faktu, że w tej grupie zaobserwowano najniższy odsetek limfocytów regulatorowych T wykazujących ekspresję czynnika transkrypcyjnego FOXP3. Piśmiennictwo 1. Fehervari Z, Sakaguchi S. CD4 + Tregs and immune control. J Clin Invest 2004; 114: Chorąży-Massalska M, Kontny E, Maolinski W. Kontrola odpowiedzi immunologicznej przez naturalne (CD4 + CD25 + ) komórki regulatorowe. Postepy Biologii Komórki 2006; 33: Chorąży-Massalska M, Kontny E, Maolinski W. Naturalne komórki regulatorowe. Postepy Biologii Komórki 2006; 33: Larche M. Regulatory T cells in allergy and asthma. Chest 2007; 132: Hill JA, Benoist C, Mathis D. Treg cells: guardians for life. Nat Immunol 2007; 8: Lal G, Bromberg JS. Epigenetic mechanisms of regulation of Foxp3 expression. Blood 2009; 114: van der Vliet HJJ, Nieuwenhuis EE. IPEX as a Result of Mutations in FOXP3. Clinical and Developmental Immunology 2007; 2007: Buckner JH, Ziegler SF. Functional analysis of FOXP3. Ann N Y Acad Sci 2008; 1143: Li B, Samanta A, Song X, et al. FOXP3 interactions with histone acetyltransferase and class II histone deacetylases are required for repression. PNAS 2007; 104: Sakaguchi S, Wing K, Onishi Y, et al. Regulatory T cells: how do they suppress immune responses? International Immunology 2009; 21: Zhou Z, Song X, Li B, et al. FOXP3 and its partners: structural and biochemical insights into the regulation of FOXP3 activity. Immunol Res 2008; 42: Baecher-Allan C, Viglietta V, Hafler DA. Human CD4 + CD25 + regulatory T cells. Semin Immunol 2004; 16: Hori S, Nomura T, Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science 2003; 299: Fontenot JD, Gavin MA, Rudensky AY. Foxp3 programs the development and function of CD4 + CD25 + regulatory T cells. Nat Immunol 2003; 4: Bluestone JA, Abbas AK. Natural versus adaptive regulatory T cells. Nat Rev Immunol 2003; 3: Hoffmann P, Eder R, Boeld TJ, et al. Only the CD45RA + subpopulation of CD4 + C- D25high T cells gives rise to homogeneous regulatory T-cell lines upon in vitro expansion. Blood 2006; 108: Shevach EM. From vanilla to 28 flavors: multiple varieties of T regulatory cells. Immunity 2006; 25: Cohn L, Elias JA, Chupp GL. Asthma: mechanisms of disease persistence and progression. Annu Rev Immunol 2004; 22: Lloyd CM, Hawrylowicz CM. Regulatory T cells in asthma. Immunity 2009; 31: Seroogy CM, Gern JE. The role of T regulatory cells in asthma. J Allergy Clin Immunol 2005; 116: Mamessier E, Milhe F, Guillot C, et al. T-cell activation in occupational asthma and rhinitis. Allergy 2007; 62: Xue K, Zhou Y, Xiong S, et al. Analysis of CD4 + CD25 + regulatory T cells and Foxp3 mrna in the peripheral blood of patients with asthma. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci 2007; 27: Shi HZ, Qin XJ. CD4CD25 regulatory T lymphocytes in allergy and asthma. Allergy 2005; 60: Reichert T, DeBruyere M, Deneys V, et al. Lymphocyte subset reference ranges in adult Caucasians. Clin Immunol Immunopathol 1991; 60: Provoost S, Maes T, van Durme YM, et al. Decreased FOXP3 protein expression in patients with asthma. Allergy 2009; 64: Karagiannidis C, Akdis M, Holopainen P, et al. Glucocorticoids upregulate FOXP3 expression and regulatory T cells in asthma. J Allergy Clin Immunol 2004; 114: Stellato C. Post-transcriptional and nongenomic effects of glucocorticoids. Proc Am Thorac Soc 2004; 1: Adres do korespondencji: mgr Katarzyna Boryczka Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej II Katedra Chorób Wewnętrznych Uniwersytet Medyczny w Łodzi Łódź, ul. Kopcińskiego 22 Tel kta.boryczka@gmail.com Zaakceptowano do publikacji:

6 206