(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/BE00/00021 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/BE00/00021 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO00/51596 PCT Gazette nr 36/00 (51) Int.Cl. A61K 31/205 ( ) A61P 7/02 ( ) (54) Zastosowanie glicynobetainy do wytwarzania leku do zastosowania przeciwzakrzepowego oraz jako antykoagulanta do przechowywania krwi (30) Pierwszeństwo: ,BE, (76) Uprawniony i twórca wynalazku: Messadek Jallal,Liege,BE (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 25/02 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 01/10 (74) Pełnomocnik: Gromek Ewa, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest nowe zastosowanie glicynobetainy do wytwarzania leku do usuwania fizjopatologicznych zmian naczyniowych. Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie glicynobetainy jako antykoagulanta do przechowywania krwi. Glicynobetaina ma leczniczą i zapobiegawczą aktywność w patogenezie skrzepowo-zatorowych i hemostatycznych chorób pochodzenia tętniczego lub żylnego. Glicynobetaina wykazuje aktywność zapobiegawczą wobec powstawania skrzepów i wykazuje aktywność leczniczą, która zapobiega proliferacji skrzepów poprzez ich niszczenie. Znamienność niniejszego wynalazku opiera się na fakcie, że zastosowanie glicynobetainy nie prowadzi do jakiegokolwiek ryzyka krwotoku lub alergii spowodowanych oportunistyczną reakcją na obecnie stosowane cząsteczki i sposoby leczenia. Stan techniki Zakrzepice naczyniowe są odpowiedzią organizmu, w którym zaatakowana została ściana naczynia oraz zawartość jej komórek i plazma. Zakrzepica jest miejscową aktywacją koagulacji z powstawaniem skrzepu. Zainteresowanie tą patologią w ostatnich latach pozwoliło na identyfikację kilku czynników będących jej przyczyną: - naczynie, ściana naczyniowa i komórki śródbłonka, - rola składników występujących we krwi - układy koagulacji i fibrynolizy, i ich inhibitory. Istnieje kilka typów zakrzepic, które mogą wystąpić w tętnicach, żyłach, układach mikrokrążenia narządów, jamach serca i sztucznych powierzchniach w kontakcie z krwią. Naczyniowe zakrzepice są odpowiedzią na zaatakowanie ściany naczynia i zawartości jej komórek i plazmy. Zakrzepica jest zmasowanym tworem zawierającym składniki krwi (płytki krwi, czerwonych krwinek i białych krwinek), fibrynę i inne białka osocza, które osadzają się na powierzchni lub które zatykają wolny kanał układu naczyniowego. Mechanizmy zakrzepicy są podobne do mechanizmów zastoju krwi, ale mają charakter patologiczny z uwagi na ich nieprawidłowe umiejscowienie wewnątrz naczynia. Zakrzepice i zatory są głównymi przyczynami klinicznych powikłań związanych z chorobami sercowo-naczyniowymi i miażdżycą naczyń. Według Virchowa, co najmniej trzy typy czynników generujących skrzep determinują umiejscowienie, rozmiar i ustępowanie zakrzepicy: - czynniki hemodynamiczne i reologiczne - uszkodzenie śródbłonka; - aktywacja składników krwi, szczególnie płytek krwi, i koagulacja w wyniku której powstaje trombina. Skrzepowo-zatorowa choroba pochodzenia tętniczego lub żylnego pozostaje jedną spośród głównych przyczyn śmierci w krajach rozwiniętych. Zakrzepica tętnicza powstaje często z uwagi na pęknięcie płytki miażdżycowej, podczas gdy zakrzepica żylna wynika z niedoboru inhibitora koagulacji (AT III) lub z niedoboru aktywatora fibrynolizy (białko S i/lub białko C) lub częściej z zastoju żyły. Właściwie, obie z nich wynikają z oddziaływania pomiędzy krwią i ścianą naczyniową, z powstawania zakrzepicy żylnej i/lub hemostatycznej anomalii. Zakrzepica tętnicza jest częściej wtórna wobec anomalii ściany i głównie angażuje płytki krwi. Przyczynia się to do wielu rozmaitych obrazów klinicznych zależnie od warstw tętniczych zaangażowanych w przerwanie unaczynienia. Zakrzepica oddziałuje głównie na tętnice sercowe (wieńcowe) i tętnice niższych, mózgowych lub trawiennych narządów. Zatem choroba tętnicza faworyzuje powstawanie samego skrzepu, który odpowiada za większość ostatecznych okluzji naczyniowych. Ponadto oczywisty jest udział hemostatycznych zaburzeń i utworzonego skrzepu w innych uszkodzeniach naczyniowych: postępie uszkodzenia ściany naczyniowej, niedokrwieniu i problemach z mikrokrążeniem. Trzy terapeutyczne strategie można wyróżnić do zapobiegania ciężkim zaburzeniom związanym z zakrzepicami: Antykoagulanty. Stanowią one główny element leczenia pacjenta wykazującego zaburzenie skrzepowo-zatorowe. Obecnie stosuje się heparynę i jej pochodne. Jednakże, zastosowanie heparyn może prowadzić do dwóch głównych powikłań, mianowicie krwotoku lub małopłytkowości.

3 PL B1 3 Antywitaminy K (KAV). Zalecane do leczenia przewlekłego, nie można ich stosować w nagłym przypadku i nie można ich zalecać jednocześnie z innymi środkami przeciw agregacji, ponieważ wzmagają one ich działanie krwotoczne. Środki przeciw agregacji płytek krwi. Zalecane do zapobiegania zakrzepicy tętniczej związanej z miażdżycą naczyń. Główne inhibitory czynności płytek krwi, które są obecnie zalecane obejmują: aspirynę, tyklopidynę, dipirydamol i niektóre niesterydowe środki przeciwzapalne, jak flurbiprofen i prostacyklina. Te sposoby leczenia są bardzo skuteczne, ale wykazują niepożądane efekty uboczne u pacjentów podatnych na alergie lub krwotok. Pomimo ich efektywności, wszystkie te sposoby leczenia wymagają specjalnych środków ostrożności przy ich stosowaniu, takich jak podawanie antidotum, problemy z przedawkowaniem i niepożądane efekty uboczne. Te sposoby leczenia wymagają ciągłej obserwacji pacjentów, w szczególności z powodu problemów związanych z krwotokiem, które mogą pojawić się podczas lub po leczeniu, jak również możliwej niezgodności z innymi lekami. Zatem korzystne byłoby zidentyfikowanie cząsteczki o silnym działaniu przeciwzakrzepowym bez niepożądanych działań ubocznych. Nieoczekiwanie zidentyfikowano glicynobetainę, jako posiadającą silne działanie terapeutyczne w leczeniu zakrzepic. Glicynobetaina, lub betaina, o wzorze (CH 3 ) 3 N-CH 2 -COOR, jest cząsteczką znaną ze swoich właściwości osmo-ochronnych i z zastosowań kosmetycznych i farmaceutycznych. Różne farmaceutyczne zastosowania betainy są znane, szczególnie zastosowanie betainy do leczenia homocystynurii, która powoduje problemy sercowo-naczyniowe (L. & B. Wilken, J. Inher. Metab. Dis. 1997). Zatem pacjenci cierpiący na homocystynurię, która jest anomalią genetyczną, wykazują przedwczesne zaburzenia miażdżycowe i skrzepowo-zatorowe (S.H. Mudd i in., The metabolism and molecular bases of inherited disease, 1995) i zapadają na choroby sercowo-naczyniowe (McCully, Artherosclerosis Rev. 11, 1983). Homocystynuria jest dziedzicznym defektem, którego forma homozygotyczna jest rzadka. Szacuje się, że liczba przypadków występowania tej formy homozygotycznej odpowiada 1 na 200 w populacji ogólnej. Homocystynuria występuje z powodu podwyższonych poziomów homocysteiny w osoczu chorego pacjenta. Podawanie betainy umożliwia zmniejszenie stężenia homocysteiny we krwi. Opis patentowy nr WO 95/15750 ujawnia zastosowanie składników zawierających betainę do zapobiegania zaburzeniom naczyniowym u pacjentów homocystynurycznych. Opis patentowy nr WO 98/19690 także dotyczy pacjentów cierpiących z powodu podwyższonego poziomu homocysteiny we krwi. Zastosowanie betainy pośród innych składników ma na celu zmniejszenie poziomu homocysteiny we krwi, jako, że ustalono, iż homocysteina jest dodatnim czynnikiem ryzyka występowania chorób sercowo-naczyniowych, jak również choroby Alzheimera. Europejski opis patentowy nr ujawnia zastosowanie betainy razem z innymi składnikami do hamowania zwiększania się ilości grup sulfhydrylowych, obecnych z powodu cysteiny i homocysteiny, w osoczu ludzkim, a zatem do hamowania powstawania płytek miażdżycowych. To działanie przeciwmiażdżycowe jest znane i obszernie udokumentowane. Publikacje dotyczą wpływu betainy na metabolizm lipidów (Zapadnyuk i in. Biol, Mod. 1987) i cholesterolu (Panteleimonova i in., Fannakol. Toksikol, Moscow 1983). Opis patentowy nr WO 97/38685 ujawnia zastosowanie betainy i tauryny do leczenia powikłań wynikających z niedokrwienia pewnych narządów. Niedokrwienie jest miejscowym zatrzymaniem krwiobiegu i stanowi tylko jedną spośród patologii zakrzepicy. Europejski opis patentowy EP zawiera przykłady do świadczeń na wyłuszczonych sercach, tj. sercach, które oddzielono i usunięto z układu naczyniowego. Zastosowanie betainy z uwagi na jej znane właściwości osmo-ochronne i przeciwrodnikowe umożliwiło ujawnienie jej ochronnego działania na mięsień sercowy. Ujawniono inne formy betainy (opis patentowy nr WO 97/06795), ale jak dotąd nie o sile i działaniu równym glicynobetainie. Żadna spośród tych publikacji nie ujawnia ani aktywności glicynobetainy wobec zakrzepicy żylnej i/lub tętniczej, ani jej aktywności przeciw agregacji i przeciwzakrzepowej. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie glicynobetainy do otrzymywania leku przeznaczonego do leczenia zakrzepic, które nie są wywołane przez homocystynurię.

4 4 PL B1 Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie glicyno betainy do otrzymywania leku przeznaczonego do leczenia chorób skrzepowo-zatorowych, które nie są wywołane przez homocystynurię. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie glicynobetainy do otrzymywania leku przeznaczonego do leczenia pacjenta z zaburzeniami związanymi z koagulacją krwi. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie glicynobetainy do otrzymywania leku przeznaczonego do leczenia pacjenta z zaburzeniami związanymi z agregacją płytek krwi. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie glicynobetainy do otrzymywania leku przeznaczonego do lizy skrzepu. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie glicynobetainy do otrzymywania leku przeznaczonego do leczenia zakrzepic u pacjentów z ryzykiem krwotoku. Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie glicynobetainy jako antykoagulanta do przechowywania krwi ex-vivo. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie glicynobetainy do otrzymywania leku przeznaczonego do przeciwdziałania skutkom skrzepowo-zatorowym wywołanym przez produkty kontrastowe. Korzystnie, zastosowanie to może obejmować podawanie glicynobetainy pacjentowi jednocześnie z produktami kontrastowymi. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie glicynobetainy do wytwarzania leku, w którym glicynobetaina jest połączona z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, rozczynnikiem lub rozcieńczalnikiem. Glicynobetaina ujawniona w niniejszym wynalazku jest przydatna do różnych zastosowań klinicznych, takich jak: - zakrzepice wieńcowe i zakrzepice żylne - zawał, dusznica bolesna, tętniak, zator płucny, zapalenie żyły - zator mózgowy - wstrząs pourazowy, pochodzenia chirurgicznego lub nie - zapobieganie ciężkim zaburzeniom mikrokrążenia w następujących przypadkach: hemofilia, chemioterapia, starzenie, antykoncepcja doustna z zastosowaniem estrogenów, otyłość, uzależnienie od tytoniu, proteza. - zapobieganie ryzykom związanym z podawaniem jonowych i niejonowych produktów kontrastowych. Urządzenie i metoda A/ Laserowe wywoływanie zakrzepicy (Seiffge D. etal, 1989; Weichter W. i in., 1983) W tym modelu, uszkodzenie ściany naczyniowej wywołuje się wiązką laserową. Ta wiązka powoduje ograniczone uszkodzenie śródbłonka naczyniowego (tylko 1 do 2 komórek ulega zniszczeniu). To odsłonięcie tkanki podśródbłonkowej, która jest powierzchnią generującą skrzep, powoduje adhezję płytek krwi poprzez glikoproteinę II. Po tej adhezji płytek krwi następuje ich aktywacja. Tworzą one nibynóżki i wydzielają zawartość ich ziarnistości. Ta aktywacja powoduje pojawienie się glikoprotein Ilb-IIIa, które są niezbędne do agregacji płytek krwi między sobą. To uszkodzenie wywołuje się w mikrokrążeniu krezkowym szczura. Bezpośrednio po nim powstaje skrzep (w czasie kilku sekund). Ten skrzep, który szybko powiększa się wraz z przepływem krwi, tworzy zator przed ponownym utworzeniem. W ten sposób przeprowadza się farmakologiczną ocenę działania glicynobetainy w połączeniu z badaniem dwóch aktywnych cząsteczek użytych jako wzorzec; mianowicie kwasu acetylosalicylowego i heparyny (o małej masie cząsteczkowej). Ocena ta obejmuje także aktywność glicynobetainy w odniesieniu do efektów sprzyjających tworzeniu się skrzepu wywołanych przez produkty kontrastowe. B/ Wywoływanie zakrzepicy zastojem żyły Przeprowadzono laparotomie w celu odsłonięcia niższej vena cava, na której umieszczono podwiązkę naczyniową w czasie T 0, a następnie wykonano podskórną iniekcję glicynobetainy w czasie T 0 +2 godziny, a następnie usunięto skrzep w czasie T 0 +6 godzin. C/ Procedura doświadczalna Do tych testów użyto szczury Wistar płci męskiej. Ważyły one pomiędzy 200 i 250 g. Po 8-dniowym okresie stabilizowania, szczury poddano głodzeniu przez 12 godzin. Następnie znieczulono je, podano podskórnie glicynobetainę i pod koniec doświadczenia otwarto krezkę (laser) lub vena cava (zastój żyły).

5 PL B1 5 P r z y k ł a d y P r z y k ł a d 1 Ocena liczby czopów zatorowych i czasu trwania embolizacji po zmianie naczyniowej z powodu naświetlania laserem Liczba czopów zatorowych Czas trwania embolizacji (minuty) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 5,33±0,58 2±0 Glicynobetaina 5 mg/kg 2±0 1±0 Kwas acetylosalicylowy 100 mg/kg 1±1 0,33±0,58 Heparyna 2 mg/kg 2,67±0,52 1±0 Glicynobetaina znacznie zmniejszała liczbę czopów zatorowych i czas trwania embolizacji po zmianie naczyniowej z powodu naświetlania laserem. Wyniki dowodzą jej silnej aktywności zakrzepowej. P r z y k ł a d 2 Ocena czasu trwania krwawienia wywołanego (E. Dejana, Bleeding time in rats, Thrombosis. Rech. 1982) Czas krwawienia (sekundy) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 101,52±5,7 Glicynobetaina 5 mg/kg 95±5 Kwas acetylosalicylowy 100 mg/kg 276,67±20,82 Heparyna 2 mg/kg 313,33±20 Te wyniki demonstrują, że glicynobetaina utrzymuje czas trwania krwawienia wywołanego w zakresie wartości kontroli ujemnej. Oprócz jej aktywności przeciwzakrzepowej, glicynobetaina nie wywołuje żadnego ryzyka krwotoku w porównaniu z kontrolami dodatnimi. P r z y k ł a d 3 Ocena agregacji płytek krwi po zmianie naczyniowej z powodu naświetlania laserem (Cardinal & Flower, Pharmacol. Method. 1980) Amplituda (omy) Prędkość (omy/minutę) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 13±1 9±1 Glicynobetaina 5 mg/kg 0,66±1,15 1,66±1,15 Kwas acetylosalicylowy 100 mg/kg 2,33±2,08 2±1 Heparyna 2 mg/kg 4,33±0,57 2,66±0,50 Te wyniki demonstrują działanie przeciw agregacji glicynobetainy. P r z y k ł a d 4 Ocena działania na komórki krwi a/ Liczba płytek krwi w mm 3 Liczba płytek krwi (10 9 ) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 788±30,14 Glicynobetaina 5 mg/kg 804,67±20,03 Kwas acetylosalicylowy 100 mg/kg 855,33±63,17 Heparyna 2 mg/kg 777,33±6,43

6 6 PL B1 b/ Liczba białych krwinek w mm 3 Liczba białych krwinek (10 9 ) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 5,03±1 Glicynobetaina 5 mg/kg 4,43±0,32 Kwas acetylosalicylowy 100 mg/kg 4,33±1,00 Heparyna 2 mg/kg 5,80±0,10 c/ Liczba czerwonych krwinek w mm 3 Liczba czerwonych krwinek (10 12 ) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 6,56±0,15 Glicynobetaina 5 mg/kg 6, 19±0,25 Kwas acetylosalicylowy 100 mg/kg 6,15±0,31 Heparyna 2 mg/kg 6, 20±0,20 Ilości mm 3 składników występujących we krwi pozostawała w zakresie wartości kontroli ujemnej, co demonstruje nieszkodliwość glicynobetainy. a/ Czas krótki (Quick Time - QT) P r z y k ł a d 5 Równowaga biologiczna QT (sekundy) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 17±1 Glicynobetaina 5 mg/kg 16,9±1,05 Kwas acetylosalicylowy 100 mg/kg 18,33±2,08 Heparyna 2 mg/kg 29,50±0,52 b/ Czas aktywacji kefaliny (ACT) ACT (sekundy) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 20,5±0,5 Glicynobetaina 5 mg/kg 39,9±1,05 Kwas acetylosalicylowy 100 mg/kg 27,26±1,1 Heparyna 2 mg/kg 39,46±1,36 c/ Analiza fibrynogenu Fibrynogen (g/l) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 2,45±0,19 Glicynobetaina 5 mg/kg 1,7±0,1 Kwas acetylosalicylowy 100 mg/kg 2,19±0,33 Heparyna 2 mg/kg 2,13±0,25 d/ Analiza 2-antyfibrynolizyny alfa (α2ap) α2ap(%) Kontrola ujemna Nad 0,9% 30,16±0,85 Glicynobetaina 5 mg/kg 29,7±0,68 Kwas acetylosalicylowy 100 mg/kg 29,36±0,92 Heparyna 2 mg/kg 29,4±1,01

7 PL B1 7 e/ Analiza antytrombiny III (AT III) AT III (%) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 86±3 Glicynobetaina 5 mg/kg 89,5±1,37 Kwas acetylosalicylowy 100 mg/kg 85,33±3,51 Heparyna 2 mg/kg 77,66±1,52 P r z y k ł a d 6 Ocena aktywności glicynobetainy w funkcji czasu Grupy doświadczalne: Produkt badano podając w ilości 5 mg/kg, zakrzepicę wywołano laserem. Kontrola NaCl 0,9% Grupa I Produkt wstrzykiwano 1 godzinę przed doświadczeniem Grupa II Produkt wstrzykiwano 2 godziny przed doświadczeniem Grupa III Produkt wstrzykiwano 3 godziny przed doświadczeniem Grupa IV Produkt wstrzykiwano 4 godziny przed doświadczeniem a) Wpływ testowanego produktu (5 mg/ml/kg) na czas trwania krwawienia wywołanego (B.T.C.) Grupa B.T.C. (sekundy) NaCl 0,9% 110±21,2 I 105±26,2 II 145±15,52 III 115,5±14,2 IV 120±10,13 b) Wpływ testowanego produktu (5 mg/ml/kg) na zakrzepicę tętniczą wywołaną przez wiązkę laserową Grupa Liczba naświetlań Liczba czopów zatorowych Czas trwania embolizacji (minuty) NaCl 0,9% 2,5±0,84 5,7±1,5 2,1±0,69 I 3,49±1,07 1,8±1,44 0,51±0,5 II 3,0±1,5 1,4±1,18 0,3±0,23 III 2,50±1,25 1,99±0,4 1,00±0,5 IV 2,7±1,0 2,2±0,69 1,5±0,6 c) Wpływ testowanego produktu (5 mg/kg) na agregację płytek krwi wywołaną ex vivo. Grupa Amplituda (omy) Prędkość (omy/minutę) NaCl 0,9% 24,23±0,5 14,4±2,3 I 11,33±3,08 8,2±0,2 II 13,2±3,5 9,3±1,8 III 12,7±4,1 8,7±1,3 IV 13±2,8 8,7±1,15 d) Ocena wpływu glicynobetainy na czynniki koagulacji po podawaniu powtarzanym przez 5 dni leczenia ACT (sekundy) Czas krótki (sekundy) Fibrynogen g/l Kontrola nieleczona 21,25±2,3 16, 1±1,0 3,03±0,45 Glicynobetaina (5 mg/kg/dzień) 39,3±2,3 19, 8±1,2 2,2±0,1

8 8 PL B1 P r z y k ł a d 7 Ocena wpływu glicynobetainy na zakrzepicę żylną wywołaną przez zastój żyły a) Wpływ glicynobetainy na ciężar skrzepu Ciężar skrzepu (mg) Kontrola nieleczona 4,033±2 Glicynobetaina (1 mg/kg) 3,1±0,4 Glicynobetaina (2,5 mg/kg) 1,63±0,76 Glicynobetaina (5 mg/kg) 0,76±0,4 b) Ocena wpływu glicynobetainy na plazminogenezę Plazminogeneza (%) NaCl 0,9% 2,7±0,33 Glicynobetaina (5 mg/kg) 1,66±0,58 Glicynobetaina (2,5 mg/kg) 2±0.15 Glicynobetaina (1 mg/kg) 2,44±0,58 c) Ocena wpływu glicynobetainy na koagulację ACT (sekundy) Czas krótki (sekundy) Fibrynogen g/l Kontrola nieleczona 30,2±2,7 16,1±1, 0 3,03±0,45 Glicynobetaina (1 mg/kg) 29,1±2,3 16,2±1,2 2,63±0,3 Glicynobetaina (2,5 mg/kg) 31,2±2,6 16,6±0,7 2,2±0,17 Glicynobetaina (5 mg/kg) 33,5±1,9 15,6±0,4 2,32±0,33 d) Ocena wpływu glicynobetainy na czynniki koagulacji Anty-Xa jednostki/ml Anty-IIa jednostki/ml Glicynobetaina (5 mg/kg) 0,35±0,15 - Glicynobetaina (2,5 mg/kg) 0,14±0,10 - Glicynobetaina (1 mg/kg) 0,08±0,1 - Leczenie glicynobetainą hamuje powikłania skrzepowo-zatorowe, które zapoczątkowywane są naświetlaniem laserem. Właściwie, leczenie glicynobetainą przed naświetlaniem laserem zmniejsza naczyniową adhezję płytek krwi i ich agregację. Leczenie glicynobetainą hamuje powikłania skrzepowo-zatorowe. Właściwie, leczenie glicynobetainą przed indukcją zakrzepicy zapewnia silne działanie przeciwzakrzepowe w odniesieniu do wszystkich parametrów, które mają znaczenie w procesie powstawania skrzepu. Ponadto, wyniki dla parametrów biologicznych demonstrują całkowitą nieszkodliwość glicynobetainy, która, w przeciwieństwie do zastosowanych produktów wzorcowych (aspiryna i heparyna), nie indukuje żadnego krwawienia lub niepożądanego efektu ubocznego. Te cechy oznaczają, że glicynobetainę, oprócz jej udowodnionej efektywności, można podawać ludziom z ryzykiem krwotoku, jak również ludziom z ryzykiem wystąpienia nadwrażliwości lub alergii przy zastosowaniu typowych sposobów leczenia przeciwzakrzepowego (hemofilitycy, alergicy). Glicynobetaina nie wywołuje małopłytkowości lub zaburzeń krwotocznych (Przykłady 2 i 4). Doświadczalne wyniki z Przykładu 5c wskazują, że następuje zużycie fibrynogenu. Należy zwrócić uwagę, że w takich samych warunkach doświadczalnych przechowywania krwi, glicynobetaina posiada silną aktywność przeciwzakrzepową przy porównaniu z fiolkami zawierającymi heparynę lub EDTA. Skuteczna dawka glicynobetainy mieści się pomiędzy 3 i 5 mg na fiolkę. Ten wynik doświadczalny demonstruje silne działanie przeciwzakrzepowe glicynobetainy. Zatem można

9 PL B1 9 przyjąć, że glicynobetainę można stosować jako antykoagulant zarówno do leczenia ludzi in vivo, jak i do przechowywania krwi ex vivo. Ocena aktywności glicynobetainy w porównaniu z produktami kontrastowymi W kontekście tego badania wpływów przeciwzakrzepowych i w celu uzupełnienia prac wstępnych nad efektywnością glicynobetainy, oszacowano wpływ glicynobetainy na zwiększanie ryzyka skrzepowo-zatorowego związanego z zastosowaniem produktów kontrastowych znanych z ich działań sprzyjających tworzeniu się skrzepów. Badania to, co nadaje mu sens, umożliwia bezpośrednią obserwację powstawania skrzepu w miejscu uszkodzenia naczyniowego. Te wyniki wyjaśniają występowanie zakrzepowych okluzji podczas plastyki naczynia, szczególnie wśród pacjentów, których śródbłonek jest już uszkodzony lub naruszony. Wieńcowa plastyka naczynia powoduje usuwanie śródbłonka, odsłonięcie kolagenu, elastyny i komórek mięśni gładkich na krążącą krew, analogicznie do stosowanego doświadczalnego modelu zakrzepicy. Zatem, większa zachorowalność z powodu nowych skrzepów występuje wśród pacjentów, którzy już wcześniej cierpieli z powodu wieńcowej zakrzepicy lub u których pojawiła się niecentralna płytka wieńcowa. Podawanie produktów kontrastowych zmniejsza liczbę białych krwinek, liczbę czerwonych krwinek i liczbę płytek krwi. Kontrastowe produkty oddziaływują z leukocytami, indukują uwalnianie leukotrienów, zwiększają przepuszczalność naczyniową i wywierają działanie chemotaktyczne. Ponadto, produkty kontrastowe wpływają na kontrolę ekspresji selektyny P i powodują adhezję białych krwinek do śródbłonka naczyniowego. Wykazano, że zastosowanie produktów kontrastowych jest związane z występowaniem skrzepów w zmiennych ilościach zależnie od stosowanego produktu. Badano dwa produkty kontrastowe Heksabrix (jonowy) i Iopamidol (niejonowy). P r z y k ł a d 8 Ocena liczby czopów zatorowych i czasu trwania embolizacji po zmianie naczyniowej spowodowanej naświetlaniem laserem i podawaniem produktów kontrastowych Liczba czopów zatorowych Czas trwania embolizacji (minuty) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 5,33±0,58 2±0 Heksabrix 8±1 3,67±0,58 Iopamidol 11,67±0,50 6,33+0,52 Glicynobetaina 5 mg/kg + Heksabrix 4±1 2±0 Glicynobetaina 5 mg/kg + Iopamidol 5,33±0,58 2,33±0,48 P r z y k ł a d 9 Ocena czasu trwania krwawienia wywołanego (IBD) IBD (sekundy) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 101,52±5,7 Heksabrix 195±13,23 Iopamidol 128±7,64 Glicynobetaina 5 mg/kg + Heksabrix 150±5 Glicynobetaina 5 mg/kg + Iopamidol 111±6,60 P r z y k ł a d 10 Ocena agregacji płytek krwi po zmianie naczyniowej spowodowanej naświetlaniem laserem Amplituda (omy) Prędkość (omy/minutę) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 13±1 9±1 Heksabrix 6±1 5,66±0,57 Iopamidol 15±2,64 12,33±0,50 Glicynobetaina 5 mg/kg + Heksabrix 2±1 5±0 Glicynobetaina 5 mg/kg + Iopamidol 4,66±0,52 9,33±0,8

10 10 PL B1 P r z y k ł a d 11 Ocena wpływu glicynobetainy na komórki krwi a/ Liczba płytek krwi w mm 3 Liczba płytek krwi (10 9 ) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 788,33±30,14 Heksabrix 620±10 Iopamidol 585,67±23,54 Glicynobetaina 5 mg/kg + Heksabrix 669,67±7,37 Glicynobetaina 5mg/kg + Iopamidol 704,33±92,33 b/ Liczba białych krwinek w mm 3 Liczba białych krwinek (10 12 ) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 5, 03±0,20 Heksabrix 2,96±0,21 Iopamidol 3,06±0,35 Glicynobetaina 5 mg/kg + Heksabrix 4,20±0,1 Glicynobetaina 5 mg/kg + Iopamidol 3,9±0,3 c/ Liczba czerwonych krwinek w mm 3 Liczba czerwonych krwinek (10 9 ) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 6,56±0,15 Heksabrix 5,43±0,47 Iopamidol 5,5±0,36 Glicynobetaina 5 mg/kg + Heksabrix 6, 5±0,15 Glicynobetaina 5 mg/kg + Iopamidol 6, 6±0,19 a/ Czas krótki P r z y k ł a d 12 Równowaga biologiczna QT (sekundy) Kontrola ujemna Nad 0,9% 17±1 Heksabrix 24,13±1 Iopamidol 28,1+0,75 Glicynobetaina 5 mg/kg + Heksabrix 16,36±0,56 Glicynobetaina 5 mg/kg Iopamidol 17,83±1,2 b/ Czas aktywacji kefaliny (ACT) ACT (sekundy) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 20,5±0,5 Heksabrix 49,3±1,85 Iopamidol 41,33±0,8 Glicynobetaina 5 mg/kg + Heksabrix 25,4±0,61 Glicynobetaina 5 mg/kg Iopamidol 22,4±0,7

11 PL B1 11 c/ Analiza fibrynogenu Fibrynogen (g/l) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 2,45±0,19 Heksabrix 1,49±0,18 Iopamidol 1,5±0,8 Glicynobetaina 5 mg/kg + Heksabrix 1,7±0,09 Glicynobetaina 5 mg/kg Iopamidol 1,9±0,1 d/ Analiza 2-antyfibrynolizyny alfa (α2ap) α2ap(%) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 30,16±0,85 Heksabrix 23,26±1,06 Iopamidol 25,23±0,95 Glicynobetaina 5 mg/kg + Heksabrix 25,66±0,09 Glicynobetaina 5 mg/kg Iopamidol 28,13±0,8 e/ Analiza antytrombiny III (AT III) AT III (%) Kontrola ujemna NaCl 0,9% 86,3±3 Heksabrix 81,63±0,66 Iopamidol 70,6±1,51 Glicynobetaina 5 mg/kg + Heksabrix 79,1±1,05 Glicynobetaina 5 mg/kg Iopamidol 87,26±0,98 Leczenie glicynobetainą hamuje powikłania skrzepowo-zatorowe związane z zastosowaniem produktów kontrastowych. Właściwie, leczenie glicynobetainą, przed lub podczas iniekcji produktów kontrastowych, zmniejsza adhezję płytek krwi i ich agregację na poziomie naczyniowym. Te wyniki demonstrują działania przeciwzakrzepowe i rozpuszczające skrzeplinę glicynobetainy. Należy zwrócić uwagę, że produkty kontrastowe mogą wykazywać inne efekty uboczne, jak zastój krwi w cewnikach i uszkadzanie śródbłonka z uwagi na same metody podawania. Glicynobetaina zapobiega tym niepożądanym efektom. Podsumowanie Glicynobetaina ma takie same, lub nawet lepsze, cechy terapeutyczne jak zbadane antykoagulanty i środki przeciw agregacji (kwas acetylosalicylowy i heparyna), ale niewykazujące żadnych efektów niepożądanych. Lepsze działanie pod względem efektywności terapeutycznej glicynobetainy w porównaniu tych dwóch cząsteczek (kwas acetylosalicylowy i heparyna) jest korzystne w przypadku preparatu leku zawierającego glicynobetainę jako terapeutycznie aktywny składnik, wymieniony lek jest przeznaczony do leczenia zakrzepic i chorób skrzepowo-zatorowych. Zgodnie z wynikami przedstawionymi powyżej, ten lek wykazuje także działania przeciwzakrzepowe, przeciw agregacji i fibrynolityczne. Wykazana nieszkodliwość tej cząsteczki umożliwia rozważenie zastosowania trybów leczenia przewlekłego niewymagających ciągłej obserwacji biologicznej. Zainteresowanie zastosowaniem glicynobetainy opiera się na fakcie, że działa ona na kilku etapach powstawania zastoju krwi, tj. na etapach agregacji płytek krwi, koagulacji i fibrynolizy. Ta aktywność jest trwała i znosi konieczność powtarzającego się podawania, co stanowi poważną korzyść w porównaniu do istniejących sposobów leczenia. Podawanie betainy nie indukuje żadnego ryzyka krwotoku lub innych efektów ubocznych (np. małopłytkowości wywołanej przez heparynę), co stanowi główny postęp w leczeniu przeciwzakrzepowym.

12 12 PL B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie glicynobetainy do otrzymywania leku przeznaczonego do leczenia zakrzepic, które nie są wywołane przez homocystynurię. 2. Zastosowanie glicynobetainy do otrzymywania leku przeznaczonego do leczenia chorób skrzepowo-zatorowych, które nie są wywołane przez homocystynurię. 3. Zastosowanie glicynobetainy do otrzymywania leku przeznaczonego do leczenia pacjenta z zaburzeniami związanymi z koagulacją krwi. 4. Zastosowanie glicynobetainy do otrzymywania leku przeznaczonego do leczenia pacjenta z zaburzeniami związanymi z agregacją płytek krwi. 5. Zastosowanie glicynobetainy do otrzymywania leku przeznaczonego do lizy skrzepu. 6. Zastosowanie glicynobetainy do otrzymywania leku przeznaczonego do leczenia zakrzepic u pacjentów z ryzykiem krwotoku. 7. Zastosowanie glicynobetainy jako antykoagulanta do przechowywania krwi ex-vivo. 8. Zastosowanie glicynobetainy do otrzymywania leku przeznaczonego do przeciwdziałania skutkom skrzepowo-zatorowym wywołanym przez produkty kontrastowe. 9. Zastosowanie glicynobetainy według zastrz. 8, znamienne tym, że można podawać ją pacjentowi jednocześnie z produktami kontrastowymi. 10. Zastosowanie glicynobetainy do wytwarzania leku, w którym glicynobetaina jest połączona z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, rozczynnikiem lub rozcieńczalnikiem. Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,00 zł.