metody chromatograficzne

Transkrypt

1 opracował Tomasz Łojewski

2 metody chromatograficzne metody chromatograficzne: gazowa (GC) ciekła (LC) nadkrytyczna (SFC) cieńkowarstwowa (TLC) Ŝelowa (GPC/SEC) bibułowa jonowymienna (IC) analiza instrumentalna techniki separacyjne spektroskopowe elektrochemiczne inne metody elektroforetyczne: elektroforeza kapilarna (CZE) micelarna elektrokinetochromatografia (MEKC) elektroforeza w Ŝelu poliakrylamidowym (PAGE) inne: destylacja ekstrakcja dializa i wymiana jonowa rozdzielanie w polu sił wirowanie i ultraw.

3 metody chromatograficzne wprowadzenie do technik chromatograficznych chromatografia gazowa sposoby przygotowania i dozowania próbek rodzaje stosowanych kolumn detektory spektrometr masowy inne przykłady zastosowań chromatografii gazowej

4 metody chromatograficzne Michaił Siemionowicz Cwiet ( ) , Wydział Biologii UW On a New Category of Adsorption Phenomena and Their Application in Biochemical Analysis r. - termin chromatografia rozdział barwników roślinnych na kolumnie wypełnionej węglanem wapnia, eter naftowy jako rozpuszczalnik Like light rays in the spectrum, the different components of a pigment mixture, obeying a law, are resolved on the calcium carbonate column and then can be qualitatively and quantitatively determined. I call such a preparation a chromatogram and the corresponding method the chromatographic method. M.S. Tswett, Khromofilly v Rastitel nom i Zhivotnom Mire (Chromophylls in the Plant and Animal Kingdom) (Karbasnikov Publishers, Warsaw, 1910).

5 metody chromatograficzne chromatografia technika rozdzielania składników mieszaniny, wykorzystująca ich róŝny podział pomiędzy poruszającym się strumieniem płynu, zwanym fazą ruchomą i sąsiadującą fazą stacjonarną układ ciało stałe (faza stacjonarna) ciecz (faza ruchoma)

6 metody chromatograficzne chromatografia technika rozdzielania składników mieszaniny, wykorzystująca ich róŝny podział pomiędzy poruszającym się strumieniem płynu, zwanym fazą ruchomą i sąsiadującą fazą stacjonarną stan skupienia fazy ruchomej: chromatografia gazowa, cieczowa, fluidalna stan skupienia fazy stacjonarnej: ciecz lub ciało stałe ch. kolumnowa ch. planarna

7 metody chromatograficzne podział ze względu na typ oddziaływań pomiędzy cząsteczkami rozdzielanych substancji - fazą stacjonarną fazą ruchomą: róŝne zdolności adsorpcyjne (ch. bibułowa, TLC) róŝnych właściwości kwasowo-zasadowych (ch. jonowymienna) róŝna rozpuszczalności składników w obu fazach (ch. podziałowa) róŝnych wymiarów cząsteczek (sączenie molekularne - SEC) róŝnic lotności (ch. gazowa)

8 chromatografia gazowa metoda rozdziału i analizy mieszanin związków lotnych metodą GC moŝna rozdzielać substancje, które w zastosowanych warunkach chromatografowania mają postać gazów lub par, tj. substancje gazowe, ciekłe lub stałe, których temperatura wrzenia nie przekracza 400 o C

9 chromatografia gazowa podstawowe pojęcia charakteryzujące rozdział chromatograficzny czas retencji t R całkowity czas jaki dana substancja spędza w kolumnie parametr charakterystyczny dla układu: substancja faza ruchoma - faza nieruchoma temperatura -prędkość przepływu fazy ruchomej dla danej kolumny i ustalonych warunków analizy czas retencji jest charakterystyczny dla analizowanej substancji czas retencji całkowity (niepoprawiony) substancji chemicznej - czas od wprowadzenia mieszaniny do rozdziału, do pojawienia się na chromatogramie maksimum piku, odpowiadającego tej substancji czas retencji martwy V R -(zerowy) całkowita - objętość czas retencji zredukowany jest to czas retencji substancji substancji chemicznej - obojętnej względem pomiędzy fazy t a V R R istnieje róŝnica między zaleŝność: całkowitym rozdzielczej, czyli takiej, V która = F nie czasem retencji substancji a R 0 t R oddziałuje chemicznie z tą fazą i martwym czasem retencji dyfunduje przez nią gdzie bez FŜadnych 0 to szybkość objętościowa przeszkód; w konsekwencji wypływu fazy ruchomej substancja ta pojawia się w eluacie jako pierwsza

10 chromatografia gazowa podstawowe pojęcia charakteryzujące rozdział chromatograficzny liczba półek teoretycznych (N) - miara sprawności kolumny w rozdziale mieszaniny wyznacza się ją z kształtu piku na chromatogramie N tr = σ 2 N t = 5,54 w R N t 16 R = wb 2 gdzie s to szerokość piku na wysokości 0,882h, w 1/2 w połowie piku, w u podstawy B 1/2

11 chromatografia gazowa schemat układu stosowanego w chromatografii gazowej iniektor (inŝektor) dozownik próbki rejestrator, kontroler detektor regulator przepływu gaz nośny kolumna piec kolumny źódło rys.: Linde

12 chromatografia gazowa schemat układu stosowanego w chromatografii gazowej gazy nośne w GC: hel wodór azot argon gaz nośny powinien: być obojętny chemicznie w stosunku do rozdzielanych składników i fazy stacjonarnej uwzględniać wymagania stosowanego detektora(ów) być ultra czysty (suszki, filtry O 2, oleju) w przypadku H 2 generator wodoru

13 chromatografia gazowa tryby pracy kolumny (pieca) izotermicznie w programie temperaturowym rampa temp. np. 10 /min czas analizy źródło rys.:

14 GC pobór próbki 1. próbki gazowe pobór bez zatęŝ ęŝania próbek stosuje się w przypadku gdy stęŝenie analizowanych substancji w gazie jest wystarczająco wysokie. Próbki gazu pobiera się do worków gazoszczelnych, pipet gazowych, kanistrów. absorpcja analitów w cieczy wykorzystywana w przypadku gdy analit obecny w gazie wymaga zatęŝenia. Gaz z badanymi związkami przepuszcza się przez płuczkę wypełnioną odpowiednio dobranym rozpuszczalnikiem lub roztworem, który dobrze pochłania badane substancje lub reaguje z nimi. adsorpcja analitów pozwala na zatęŝenie analizowanych związków. Adsorpcja badanych substancji następuje na sorbencie umieszczonym wewnątrz stalowej lub szklanej rurki. Sorbent znajdujący się w rurce powinien być hydrofobowy, jego powierzchnia właściwa oraz zdolność sorpcji powinny być dostosowane do charakteru badanych substancji.

15 GC pobór próbki 2. próbki ciekłe mogą występować w roztworze wodnym lub w rozpuszczalniku organicznym ekstrakcja w układzie ciecz ciecz wykorzystuje się w tym przypadku podział analitu między wodę i nie mieszający się z nią rozpuszczalnik organiczny. Po zakończeniu ekstrakcji nadmiar rozpuszczalnika naleŝy odparować. ekstrakcja w układzie ciecz gaz w metodzie tej wykorzystuje się fakt, Ŝe substancje lotne obecne w fazie ciekłej obecne są równieŝ w znajdującej się nad nią fazie gazowej (tzw. fazie nadpowierzchniowej). Bezpośrednia analiza tej fazy moŝliwa jest tylko w przypadku odpowiednio wysokich stęŝeń występujących w niej analitów. Analiza fazy nadpowierzchniowej Head Space - HS statyczna z gazową fazą ruchomą dynamiczna z ciekłą fazą ruchomą z gazową i ciekłą fazą ruchomą z gazową i ciekła fazą ruchomą odpędzanie Purge HS odpędzanie i wyłapywanie Purge and Trap HS przeciwprądowa Thin Layer HS współprądowa

16 GC pobór próbki 2. próbki ciekłe mogą występować w roztworze wodnym lub w rozpuszczalniku organicznym ekstrakcja w układzie ciecz ciecz gaz przemywający wykorzystuje się w tym przypadku podział analitu między wodę i nie mieszający się z nią rozpuszczalnik organiczny. Po zakończeniu ekstrakcji nadmiar rozpuszczalnika naleŝy odparować. ekstrakcja w układzie ciecz gaz w metodzie tej gaz nośny ny wykorzystuje się fakt, Ŝe substancje lotne obecne w fazie ciekłej obecne są równieŝ w znajdującej się nad nią fazie gazowej (tzw. fazie nadpowierzchniowej). Bezpośrednia analiza tej fazy moŝliwa jest rurka tylko sorpcyjna w przypadku odpowiednio wysokich stęŝeń występujących w niej analitów. gaz nośny ny + analit suchy gaz nośny ny igła z gazem przemyw. Analiza fazy nadpowierzchniowej Head Space - HS septa statyczna dynamiczna próbka odpędzanie Purge HS z gazową fazą ruchomą próbka odpędzanie i wyłapywanie Purge and Trap HS z ciekłą fazą ruchomą z gazową i ciekłą fazą ruchomą z gazową i ciekła fazą ruchomą przeciwprądowa Thin Layer HS blok grzewczy współprądowa Purge and Trap Head Space Purge Head Space

17 GC pobór próbki 2. próbki ciekłe, cd. mogą występować w roztworze wodnym lub w rozpuszczalniku organicznym ekstrakcja w układzie ciecz ciało stałe stosowana do ekstrakcji substancji mało lotnych z cieczy. Substancje te są w pierwszej kolejności adsorbowane i zatęŝane na złoŝu adsorbentu, a następnie są z niego desorbowane niewielką ilością rozpuszczalnika organicznego. Typ stosowanego sorbentu naleŝy dobrać do rodzaj badanych analitów. mikroekstrakcja do fazy stałej (Solid Phase Microextraction, SPME) metoda szybka, bezpuszczalnikowa, prosta i moŝliwa do automatyzacji. W tym przypadku ekstrakcję analitów moŝna prowadzić bezpośrednio zarówno z cieczy jak i z gazów. Badane związki są adsorbowane i/lub absorbowane na/w sorbencie umieszczonym na końcu cienkiej igły. W tym przypadku typ sorbentu równieŝ dobiera się do rodzaju analizowanych substancji. Metody do próbek ciekłych i gazowych.

18 GC pobór próbki 3. próbki stałe anality z ciał stałych moŝna wyodrębnić gazem (przepuszczanie gazu nad ciałem stałym umieszczonym w zamkniętym podgrzewanym naczyniu) lub rozpuszczalnikiem. Najczęściej stosuje się ekstrakcję rozpuszczalnikiem: zanurzenie ciała a stałego w rozpuszczalniku i przeprowadzenie ekstrakcji (proces ekstrakcji moŝna przyspieszyć poprzez podgrzanie lub działanie ultradźwiękami) w aparacie Soxhleta (wielokrotna ekstrakcja cykliczna) piroliza

19 GC nastrzyk próbki 1. próbki gazowe mikrostrzykawki gazowe o objętości µlitrów metody pośrednie (SPME, rurki sorpcyjne, inne) zawór dozujący - 6 lub więcej portowy, wyposaŝony w pętlę dozującą źódło rys.: Linde

20 GC nastrzyk próbki 2. próbki ciekłe Dozownik z dzieleniem strumienia (spli split injector) wyposaŝony jest on w zawór, który pozwala na podział próbki wstrzykniętej do komory dozownika. Strumień gazu nośnego, który porywa próbkę odparowaną w komorze ulega przed kolumną podziałowi, tak iŝ jego główna cześć usuwana jest na zewnątrz aparatu, natomiast tylko niewielka ilość próbki trafia do kolumny. Ten sposób dozowania posiada kilka wad: tzw. efekt gorącej igły, efekt szoku termicznego, czy obniŝanie czułości analizy Dozownik bez dzielenia strumienia ( (splitless injection) - moŝna go stosować do próbek ciekłych tylko w przypadku gdy: próbka jest silnie rozcieńczona rozpuszczalnikiem o temp. wrzenia niŝszej o co najmniej 100 o C od tem. wrzenia najmniej lotnego analitu temperatura kolumny w czasie dozowania próbki jest niska Dozowanie do zimnej kolumny polega na nastrzyknięciu próbki bezpośrednio do kolumny Dozownik z częś ęściow ciową eliminacją rozpuszczalnika dozownik ten pozwala na odprowadzenie nadmiaru rozpuszczalnika, poniewaŝ w pewnej odległości od czoła kolumny zamontowany jest zawór, który umoŝliwia przeprowadzenie tego zabiegu Dozownik z programowalną temperaturą odparowania

21 kolumny w GC podział kolumn stosowanych w chromatografii gazowej pakowane (F= 2 6mm; L =1-3m) mikropakowane (F= 0,8 1,2mm; L =kilkanaście m) kapilarne (F= 0,2 0,6mm; L =kilkadziesiąt m) preparatywne (F > 6mm; L = kilka m) mikrokapilarne (F < 0,1 mm; L = kilkadziesiąt m) faza stacjonarna szkło kwarcowe warstwa poliimidu kolumna pakowana kolumna pakowana kolumna kapilarna stal nierdzewna szkło krzemowa kolumna pakowana stal nierdzewna

22 kolumny w GC wypełnienia kolumn chromatograficznych (wg. składu chemicznego): nieorganiczne (głównie sita molekularne glinokrzemiany, głównie wapnia) polimerowe organiczne (polimery porowate - Porapak, HayeSep, Chromosorb, Tenax GC węglowe (sadze grafityzowane, głównie Carbopak) ciekłe e fazy stacjonarne osadzone na stałych nośnikach (typ Chromosorb): węglowodory (alkany Skwalan, i węglowodory aromatyczne) silikony (głównie metylosilikony i metylofenylosiloksany PDMS, nitrylosilikony OV 225) poliglikole (glikole polietylenowe -Carbowax, polialkilenoglikole Ucon) estry (tetrachloroftalany, bursztynian glikolu dietylowego, LAC) cyklodekstryny (6,7 lub 8 jednostek D-glukozy, Dextropac) W kolumnie chromatograficznej do rozdzielania substancji niepolarnych naleŝy stosować fazy niepolarne, przebiega właściwy a do rozdzielania substancji polarnych fazę polarną proces rozdziału i dlatego wybór rodzaju kolumny, a zwłaszcza jej wypełnienia, ma decydujący wpływ na jakość rozdzielania składników mieszaniny, czyli na wynik analizy chromatograficznej.

23 kolumny w GC układ z 2 kolumnami

24 detektory w GC pomiar ilości analitu i identyfikacja kategorie: detektory uniwersalne i specyficzne detektory nieniszczące i niszczące waŝne pojęcia: czułość (LLOD) selektywność zakres dynamiczny liniowość

25 detektory w GC pomiar ilości analitu i identyfikacja dete etektor tor wymagany gaz selektywność poziom detekcji zakres płomieniowojonizac. (FID FID) H2 + air węglowodory 100 pg 10 7 przew. ciepl. (TCD TCD) referencyjny uniwersalny 1 ng 10 7 wychwytu elektronów (ECD ECD) + N2 lub 95%Ar+5%CH4 chlorowcopochodne 50 fg 10 5 termojonowy (NPD NPD) H2 + air zw. azotowe i fosforowe 10 pg 10 6 płomieniowofotometr. (FPD FPD) H2 + air (+ O2) zw. zaw. S, P, Sn, B, As, Cr, Se, Ge 100 pg 10 3 nazwa femtogram pikogram nanogram mikrogram miligram centygram decygram gram oznaczenie fg pg ng µg mg cg dg g g g g 10 9 g 10 6 g 10 3 g 10 2 g 10 1 g 1 g

26 detektor TCD

27 detektor FID

28 spektrometr masowy jako detektor w GC Spektometria masowa jest odrębną metodą analityczną, w której analizowane są zjonizowane cząsteczki (jony molekularne) lub ich fragmenty (jony fragmentaryczne). Spektrometr masowy składa się z następujących części: układ dozowania próbki układ utrzymywania wysokiej próŝni komora jonizacji cząstek układ przyspieszania zjonizowanych cząstek układ rozdziału jonów róŝniących się stos. masy do ładunku (m/z) detektor pentan Związki wykryte przy uŝyciu spektrometru masowego mogą być szybko zidentyfikowane na podstawie widm m/z otrzymanych dla kilkunastu tysięcy związków, które są zapisane w bibliotece widm programu obsługującego urządzenie

29 spektrometr masowy jako detektor w GC jonizacja próbki rozdział jonów wg.. m/z detekcja wiązka elektronów katoda (-) ( pręty kwadrupola GC jony nie w rezonansie jony w rezonansie do detektora anoda (+) do pompy próŝniowej (rot.+turbo=uhv rot.+turbo=uhv)

30 interpretacja chromatogramów Chromatografia gazowa moŝe być wykorzystana zarówno do analizy jakościowej jak i ilościowej. analiza jakościowa moŝe być wykonana: w oparciu o parametry retencji w oparciu o fizykochemiczną identyfikację z zastosowaniem zaawansowanych detektorów Podstawą identyfikacji substancji rozdzielanych jest porównanie ich parametrów retencji z parametrami retencji wzorców (otrzymanymi na tej samej kolumnie, w tej samej temperaturze i przy takiej samej szybkości przepływu gazu).

31 interpretacja chromatogramów analiza ilościowa Przy oznaczeniu ilościowym danego składnika wykorzystuje się prostoliniową zaleŝność pomiędzy powierzchnią lub wysokością piku dla danej substancji a jej stęŝeniem w nastrzykniętej próbce. Analiza ilościowa wymaga przeprowadzenia kalibracji jedną z trzech najczęściej stosowanych metod: metoda kalibracji zewnętrznej metoda wzorca wewnętrznego metoda normalizacji wewnętrznej

32 interpretacja chromatogramów analiza ilościowa Przy oznaczeniu ilościowym danego składnika wykorzystuje się prostoliniową zaleŝność pomiędzy powierzchnią lub wysokością piku dla danej substancji a jej stęŝeniem w nastrzykniętej próbce. Analiza ilościowa wymaga przeprowadzenia kalibracji jedną z trzech najczęściej stosowanych metod: metoda kalibracji zewnętrznej metoda wzorca wewnętrznego metoda normalizacji wewnętrznej kalibracja przez ekstrapolację dopasowania do punktów uzyskanych dla wzorców wyniki wątpliwe! w?

33 GC w CH badanie składu atmosfery (pomieszczenia muzealne, magazyny, gabloty wystawowe) identyfikacja substancji lotnych emitowanych z róŝnych r obiektów identyfikacja substancji zastosowanych w danym obiekcie np. pobór r spoiwa z obrazu i jego analiza rurka sorpcyjna z pompką pobór po z równoczesnym r zatęŝ ęŝenie lotnych związk zków organ do późniejszej p analizy tech