(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP00/02468 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP00/02468 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO00/56360 PCT Gazette nr 39/00 (51) Int.Cl. A61K 39/385 ( ) A61K 39/39 ( ) A61K 39/02 ( ) A61K 39/005 ( ) A61P 31/04 ( ) (54) Kompozycja immunogenna, szczepionka, sposób wytwarzania kompozycji immunogennej i zastosowanie kompozycji immunogennej (30) Pierwszeństwo: ,GB, ,GB, ,GB, ,GB, (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 07/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 02/10 (73) Uprawniony z patentu: GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS S.A., Rixensart,BE (72) Twórca(y) wynalazku: Carine Capiau,Rixensart,BE Marguerite Deschamps,Rixensart,BE Pierre Michel Desmons,Rixensart,BE Craig Antony Joseph Laferriere,Rixensart,CA Jan Poolman,Rixensart,NL Jean-Paul Prieels,Rixensart,BE (74) Pełnomocnik: Janina Kossowska PATPOL Sp. z o.o. PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest kompozycja immunogenna, szczepionka, sposób wytwarzania kompozycji immunogennej i zastosowanie kompozycji immunogennej. Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji i szczepionek z bakteryjnym antygenem polisacharydowym, ich produkcji i zastosowania takich kompozycji polisacharydów do wytwarzania leków. Konkretnie wynalazek dotyczy kompozycji zawierających koniugaty bakteryjnych polisacharydów z białkiem D z H. influenzae. Streptococcus pneumoniae jest Gram-dodatnią bakterią odpowiedzialną za znaczną chorobowość i śmiertelność (w szczególności u osób bardzo młodych i u starych) powodującą inwazyjne choroby takie jak zapalenie płuc, bakteriemia i zapalenie opon mózgowych i choroby związane z kolonizacją takie jak ostre zapalenie ucha środkowego. Częstość zapalenia płuc powodowanego przez pneumokoki w USA dla osób w wieku ponad 60 lat ocenia się na 3 do 8 na W 20% przypadków prowadzi to do bakteriemii i innych objawów, takich jak zapalenie opon mózgowych, ze śmiertelnością bliską 30% nawet przy leczeniu antybiotykami. Pneumokok jest otoczony związanym chemicznie polisacharydem, który nadaje specyficzność serotypu. Znanych jest 90 serotypów pneumokoków i otoczka jest główną determinantą wirulencji pneumokoków, ponieważ otoczka nie tylko chroni wewnętrzną powierzchnię bakterii przed dopełniaczem, ale sama jest słabo immunogenna. Polisacharydy są antygenami T-niezależnymi i nie mogą być obrabiane lub prezentowane na cząsteczkach MHC, aby reagowały z komórkami T. Mogą one jednak stymulować układ odpornościowy przez alternatywny mechanizm, który obejmuje krzyżowe połączenie receptorów powierzchniowych na komórkach B. Wykazano w kilku doświadczeniach, że ochrona przed inwazyjną chorobą pneumokokową jest najsilniej skorelowana z przeciwciałem specyficznym dla otoczki i ochrona jest specyficzna w stosunku do serotypu. Szczepionki oparte na antygenach polisacharydowych są dobrze znane w dziedzinie. Cztery, które uzyskały licencje do stosowania u ludzi, obejmują polisacharyd Vi z Salmonella typhi, polisacharyd PRP z Haemophilus influenzae, tetrawalentną szczepionkę przeciw meningokokom złożoną z serotypów A, C, W135 i Y oraz 23-walentną szczepionkę pneumokokową złożoną z polisacharydów odpowiadających serotypom 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33 (co obejmuje przynajmniej 90% izolatów pneumokoków z krwi). Trzy ostatnie szczepionki dają ochronę przed bakteriami wywołującymi zakażenia dróg oddechowych powodujące poważną chorobowość i śmiertelność u niemowląt, jednak te szczepionki nie uzyskały licencji na stosowanie u dzieci poniżej dwóch lat, ponieważ nie są dostatecznie immunogenne w tej grupie wiekowej (Peltola i wsp. (1984) N. Engl. J. Med. 310: ). Streptococcus pneumoniae jest najczęstszą przyczyną inwazyjnej choroby bakteryjnej i zapalenia ucha środkowego w niemowląt i małych dzieci. Podobnie, osoby starsze słabo reagują immunologicznie na szczepionki pneumokokowe (Roghmann i wsp., (1987), J. Gerontol. 42: ), stąd też zwiększone występowanie bakteryjnego zapalenia płuc w tej populacji (Verghese i Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62: ). Strategie, które zaprojektowano aby pokonać ten brak immunogenności u niemowląt, obejmują łączenie polisacharydu z dużymi immunogennymi białkami, które dostarczają pomocy obecnych obok komórek T i które wpływają na pamięć immunologiczną w stosunku do polisacharydowego antygenu, z którym są koniugowane. Szczepionki koniugatów glikoprotein pneumokoków są obecnie oceniane pod kątem bezpieczeństwa, immunogenności i skuteczności w różnych grupach wiekowych. A) Pneumokokowe szczepionki polisacharydowe 23-walentna niekoniugowana szczepionka pneumokokowa wykazała znaczną zmienność skuteczności klinicznej, od 0% do 81% (Fedson i wsp. (1994) Arch. Intern. Med. 154: ). Skuteczność wydaje się być związana z immunizowaną grupą ryzyka, taką jak osoby starsze, choroba Hodgkina, usunięcie śledziony, anemia sierpowata i agammaglobulinemie (Fine i wsp. (1984) Arch Intern Med 154: ) i także z przejawami choroby. 23-walentna szczepionka nie wykazuje ochrony przed powodowanym przez pneumokoki zapaleniem płuc (w niektórych grupach wysokiego ryzyka, takich jak osoby starsze) i chorobami ucha środkowego. Istnieje więc potrzeba ulepszonych kompozycji szczepionek przeciwko pneumokokom, szczególnie takich, które będą bardziej skuteczne w zapobieganiu lub łagodzeniu choroby pneumokokowej (w szczególności zapalenia płuc) u osób starszych i małych dzieci. Niniejszy wynalazek dostarcza taką kompozycję immunogenną i zawierającą ją szczepionkę.

3 PL B1 3 B) Wybrane kompozycje pneumokokowy koniugat polisacharydów + 3D-MPL Ogólnie przyjmuje się, że efekt ochronny handlowo dostępnej szczepionki przeciwko pneumokokom jest mniej lub bardziej związany ze stężeniem przeciwciała indukowanym po szczepieniu; faktycznie 23 polisacharydy były zaakceptowane do licencji wyłącznie na podstawie immunogenności każdego składowego polisacharydu (wyd. Williams i wsp. New York Academy of Sciences 1995 str ). Tak więc dalsze zwiększenie odpowiedzi przeciwciał na polisacharydy pneumokoków mogłoby zwiększyć procent niemowląt i osób starszych odpowiadających ochronnymi poziomami przeciwciała na pierwszą iniekcję polisacharydu lub koniugatu polisacharydu i mogłoby zmniejszyć dawkę i ilość iniekcji wymaganych do indukcji ochronnej odporności na choroby powodowane przez Streptococcus pneumoniae. Od wczesnych lat 20-go wieku naukowcy eksperymentowali z dużą liczbą związków, które mogą być dodawane do antygenów, aby poprawić ich immunogenność w kompozycjach szczepionek (przegląd w M.F. Powell i M. J. Newman. Plenum Press, NY, Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approach (1995). Rozdział 7: A compendium of vaccine adjuvants and excipients ). Wiele jest bardzo skutecznych, ale powoduje znaczące lokalne i ogólnoustrojowe niekorzystne reakcje, które wykluczają ich stosowanie w kompozycjach ludzkich szczepionek. Adiuwanty na bazie glinu (takie jak alum, wodorotlenek glinu lub fosforan glinu) opisane po raz pierwszy w 1926 r. pozostają jedynymi adiuwantami licencjonowanymi w Stanach Zjednoczonych do szczepionek ludzkich. Adiuwanty na bazie glinu są przykładem nośnikowej klasy adiuwantów, która działa przez efekt depot który indukują. Antygen jest adsorbowany na powierzchni adiuwanta i gdy kompozycja jest wstrzyknięta, adiuwant i antygen nie są natychmiast rozproszone w krwiobiegu - zamiast tego kompozycja pozostaje w lokalnym otoczeniu wstrzyknięcia i powstaje bardziej wyraźna odpowiedź immunologiczna. Takie nośnikowe adiuwanty mają dodatkową znaną zaletę, polegającą na tym, że są odpowiednie do stabilizacji antygenów, które są podatne na rozkład, na przykład, niektórych antygenów polisacharydowych. 3D-MPL jest przykładem adiuwantu nienośnikowego. Jego pełna nazwa to 3-O-deacylowany monofosforylolipid A (lub 3-De-O-deacylowany monofosforylolipid A lub 3-O-dezacylo-monofosforylolipid A) i jest określany jako 3D-MPL, aby wskazać, że pozycja 3 glukozoaminy na redukującym końcu jest de-o-acylowana. Jego preparatyka opisana jest w GB Chemicznie jest to mieszanina 3- -deacylowanego monofosforylolipidu A z 4, 5 lub 6 acylowanymi łańcuchami. Został on oryginalnie wytworzony we wczesnych latach 1990-tych, gdy metoda 3-O-deacylacji 4'-monofosforylowej pochodnej lipidu A (MPL) doprowadziła do cząsteczki z dalej zmniejszoną toksycznością i bez zmian aktywności immunostymulującej. 3D-MPL jest stosowany jako adiuwant albo sam albo korzystnie w kombinacji z adiuwantem nośnikowym typu depot, takim jak wodorotlenek glinu, fosforan glinu lub w emulsjach olej-w-wodzie. W takich kompozycjach antygen i 3D-MPL są zawarte w tych samych strukturach cząsteczkowych, co pozwala na bardziej skuteczne dostarczenie antygenowych i immunostymulujących sygnałów. Badania wykazały, że 3D-MPL jest zdolny do dalszego zwiększenia immunogenności antygenu zaadsorbowanego na adiuwancie glinowym (Thoelen i wsp. Vaccine (1998) 16:708-14; EP B1). Takie kombinacje są także korzystne w dziedzinie dla antygenów podatnych na adsorpcję (na przykład, koniugaty polisacharydów bakteryjnych), gdzie adsorpcja na adiuwancie glinowym (alum) stabilizuje zazwyczaj antygen. Zazwyczaj stosowane są strącone adiuwanty na bazie glinu, ponieważ są jedynymi adiuwantami, które są obecnie stosowane w licencjonowanych ludzkich szczepionkach. Tak więc szczepionki zawierające 3D-MPL w kombinacji z adiuwantami glinowymi są preferowane w dziedzinie ze względu na łatwość ich opracowania i tempo wprowadzania na rynek. MPL (nie 3-deacylowany) był oceniany jako adiuwant z kilkoma monowalentnymi antygenami koniugatów polisacharydowych. Wspólne wstrzyknięcie MPL w roztworze soli zwiększało odpowiedź przeciwciał w surowicy dla czterech monowalentnych koniugatów polisacharydów: pneumokokowy PS 6B- -toksoid tężca, pneumokokowy PS 12-toksoid dyfterytu i S. aureus typ 5 i S. aureus typ 8S koniugowane z egzotoksyną A. Pseudomonas aeruginosa (Schneerson i wsp. J. Immunology (1991) 147: ). Zwiększone odpowiedzi podano jako specyficzne w stosunku do antygenu. MPL w emulsji olej-w-wodzie (adiuwant typu nośnika) powtarzalnie zwiększał efekt MPL w soli fizjologicznej ze względu na obecność MPL i antygenu w tej samej strukturze cząsteczkowej, i uważano, że jest to system adiuwantu z wyboru dla optymalnego dostarczania innych szczepionek koniugatów polisacharydów. Devi i wsp. (Infect. Immun. (1991) 59:3700-7) oceniali wpływ adiuwantu MPL (nie 3-deacylowany) w soli fizjologicznej na odpowiedź przeciwciał myszy na koniugat TT polisacharydu otoczki Cryptococcus neoformans. Gdy stosowano MPL równocześnie z koniugatem, istniał tylko marginalny wzrost specyficznej odpowiedzi zarówno IgM i IgG specyficznej na PS, jednak MPL miał znacznie większy wpływ gdy

4 4 PL B1 był podany 2 dni po koniugacie. Praktyczność stosowania schematu immunizacji, który wymaga opóźnienia w podawaniu MPL w stosunku do antygenu, szczególnie u niemowląt, jest problematyczna. Efekt adiuwantu MPL z polisacharydami i koniugatami polisacharyd-białko wydaje się być zależny od składu. Ponownie, włączenie MPL do odpowiednich systemów powolnego uwalniania (na przykład stosując adiuwant nośnikowy) daje bardziej trwały efekt adiuwantu i obchodzi problem czasu i opóźnionego podawania. Pokrótce, według obecnego stanu wiedzy dla danego polisacharydu lub antygenu koniugatu polisacharydu, gdy MPL lub 3D-MPL jest stosowany jako adiuwant, jest on korzystnie stosowany razem z adiuwantem nośnikowym (na przykład adiuwantami na bazie glinu), aby zmaksymalizować efekty immunostymulujące. Nieoczekiwanie, obecni wynalazcy stwierdzili, że dla pewnych koniugatów pneumokokowych polisacharydów immunogenność kompozycji szczepionki jest znacząco większa, gdy antygen jest formułowany z samym 3D-MPL a nie z 3D-MPL i z adiuwantem nośnikowym (takim jak adiuwant na bazie glinu). Co więcej, zaobserwowana poprawa jest niezależna od stosowanego stężenia 3D-MPL i od tego czy dane koniugaty są w kompozycji monowalentnej, czy są w kombinacji tworzącej antygen poliwalentny. C) Koniugaty polisacharyd bakteryjny - białko D Jak wymieniono powyżej szczepionki oparte na antygenie polisacharydowym są dobrze znane w dziedzinie. Licencjonowane szczepionki polisacharydowe wymienione powyżej mają różne wykazane skuteczności kliniczne. Szacowano, że szczepionka oparta na polisacharydzie Vi ma skuteczność między 55% i 77% w zapobieganiu tyfusowi potwierdzonemu przez hodowlę (Plotkin i Cam (1995) Arch Intern Med 155: ). Wykazano, że szczepionka oparta na polisacharydzie C meningokoków ma skuteczność 79% w warunkach epidemii (De Wals P. i wsp. (1996) Bull World Health Organ. 74: ). 23-walentna szczepionka pneumokokowa wykazała szeroki zakres skuteczności klinicznej od 0% do 81% (Fedson i wsp. (1994) Arch Intern Med. 154: ). Jak wspomniano powyżej, przyjmuje się, że ochronna skuteczność szczepionki pneumokokowej jest mniej lub bardziej zależna od stężenia przeciwciała indukowanego po szczepieniu. Wśród problemów związanych z podejściem polisacharydowym do szczepień, jest fakt, że polisacharydy jako takie są słabymi immunogenami. Strategie zaprojektowane, by przezwyciężyć ten brak immunogenności, obejmują podłączenie polisacharydu do dużych wysoce immunogennych nośników białkowych, które zapewniają pomoc obecnych komórek T. Przykłady tych wysoce immunogennych nośników, które są obecnie często stosowane dla produkcji immunogenów polisacharydowych, obejmują anatoksynę dyfterytu (DT lub mutant CRM197), anatoksynę tężca (TT), hemocyjaninę skałoczepu (KLH) i oczyszczoną białkową pochodną tuberkuliny (PPD). Snapper i wsp. (WO 96/32963) omawiają równoczesne podawanie antygenu z lipoproteiną D. Akkoynlu i wsp. (1997) omawiają koniugaty D-HiB. Lee i wsp. (1997) omawiają stosowanie koniugatów polisacharyd pneumokokowy-białko, jako szczepionek multiwalentnych. Eskola i wsp. (1990) badali podawanie szczepionki zawierającej koniugat polisacharydu typu B z Haemophilus influenzae - białko zmieszanej ze szczepionkami zawierającymi nieskoniugowany otoczkowy polisacharyd meningokokowy i/lub pneumokokowy. W WO 99/33488 ujawniono szczepionkę obejmującą koniugat polisacharydowy z immunostymulującym oligonukleotydem CpG. Problemy związane z często stosowanymi nośnikami Z każdym z tych powszechnie stosowanych nośników związane są problemy, w tym przy produkcji koniugatów GMP i także w immunologicznych cechach koniugatów. Mimo powszechnego stosowania tych nośników i ich sukcesu w indukcji odpowiedzi przeciwciał przeciwko polisacharydom są one związane z kilkoma wadami. Na przykład, wiadomo, że specyficzne w stosunku do antygenu odpowiedzi odpornościowe mogą ulec supresji (supresja epitopu) przez obecność już istniejących przeciwciał skierowanych przeciwko nośnikowi, w tym przypadku toksynie tyfusu (Di John i wsp. (1989) Lancet 2:1415-8). W ogólnej populacji bardzo wysoki procent ludzi będzie mieć uprzednio istniejącą odporność zarówno na DT jak i TT, ponieważ ludzie są rutynowo szczepieni tymi antygenami. W Wielkiej Brytanii, na przykład, 95% dzieci otrzymuje szczepionkę DTP zawierającą zarówno DT i TT. Inni autorzy opisali problem supresji epitopu na szczepionki peptydowe w modelach zwierzęcych (Sad i wsp., Immunology, 1991; 74: ; Schutze i wsp., J. Immunol. 133: 4, 1985; Dodatkowo, dla szczepionek, które wymagają regularnych dawek przypominających, stosowanie wysoko immunogennych nośników, takich jak TT i DT, prawdopodobnie zniesie odpowiedź przeciwciał na polisacharydy po kilku iniekcjach. Tym wielokrotnym szczepieniom mogą także towarzyszyć niepożądane odpowiedzi, takie jak nadwrażliwość typu opóźnionego (DTH).

5 PL B1 5 Wiadomo, że KLH jest silnym immunogenem i był już stosowany jako nośnik dla peptydów IgE w ludzkich próbach klinicznych. Jednak były obserwowane pewne niekorzystne reakcje (reakcje DTH- -podobne lub sensytyzacja IgE), jak i odpowiedzi przeciwciał na przeciwciała. Tak więc wybór białka nośnikowego dla szczepionki opartej na polisacharydzie będzie wymagał wyważenia pomiędzy koniecznością stosowania nośnika działającego u wszystkich pacjentów (szerokie rozpoznawanie MHC), indukcją wysokich poziomów odpowiedzi przeciwciał przeciw polisacharydom i niskiej odpowiedzi przeciwciał przeciw nośnikowi. Uprzednio stosowane nośniki dla szczepionek polisacharydowych mają więc wiele wad, szczególnie dla szczepionek skojarzonych, gdzie supresja epitopu jest szczególnym problemem, jeśli ten sam nośnik jest stosowany do różnych antygenów polisacharydowych. Według WO 98/51339 stosowano wiele nośników w szczepionkach skojarzonych, aby starać się obejść ten efekt. Niniejszy wynalazek dostarcza nowego nośnika do stosowania w przygotowaniu immunogennych koniugatów opartych na polisacharydzie który nie wykazuje wymienionych powyżej wad. Według niniejszego wynalazku białko D (EP B1) z Haemophilus influenzae lub jego fragmenty są nośnikiem dla opartych na polisacharydzie kompozycji immunogennych, w tym szczepionek. Stosowanie tego nośnika jest szczególnie korzystne w szczepionkach skojarzonych. Kompozycja immunogenna według wynalazku obejmuje wiele koniugowanych antygenów polisacharydowych składających się z antygenu polisacharydowego pochodzącego z patogennej bakterii skoniugowanego z białkiem D z Haemophilus influenzae lub fragmentem białka D zawierającym epitopy komórek T pomocniczych. Korzystnie antygen polisacharydowy jest wybrany z grupy składającej się z: polisacharydów Vi z Salmonella typhi, polisacharydów meningokokowych, polisacharydów i zmodyfikowanych polisacharydów z meningokoków grupy B, polisacharydów ze Staphylococcus aureus, polisacharydów ze Streptococcus agalactiae, polisacharydów ze Streptococcus pneumoniae, polisacharydów z mykobakterii, polisacharydów z Cryptococcus neoformans, lipopolisacharydów z nietypowalnego Haemophilus influenzae, polisacharydu otoczki z Haemophilus influenzae b, lipopolisacharydów z Moraxella catharralis, lipopolisacharydów z Shigella sonnei oraz lipopeptydofosfoglikanu (LPPG) z Trypanosoma cruzi. Korzystna kompozycja immunogenna według wynalazku obejmuje antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae pochodzące z co najmniej czterech serotypów Streptococcus pneumoniae. Korzystnie antygeny polisacharydowe skoniugowane z białkiem D pochodzą z kombinacji serotypów A, C lub Y T N. meningitidis. Korzystna kompozycja obejmuje skoniugowane polisacharydy otoczki z Haemophilus influenzae b, meningokoka C i meningokoka Y, przy czym antygeny polisacharydowe otoczki są skoniugowane z białkiem D z H. influenzae, pod warunkiem, że polisacharyd z Haemophilus influenzae b jest skoniugowany z anatoksyną tężca. Korzystna jest też kompozycja, która obejmuje skoniugowane polisacharydy otoczki ze Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae b, meningokoka C oraz meningokoka Y, przy czym antygeny polisacharydowe otoczki są skoniugowane z białkiem D z H. influenzae, pod warunkiem, że polisacharyd z Haemophilus influenzae b jest skoniugowany z anatoksyną tężca. Kompozycja immunogenna według wynalazku, korzystnie dodatkowo zawiera adiuwant. Korzystnie skoniugowany antygen polisacharydowy-białko D jest zaadsorbowany na fosforanie glinu. Korzystnie adiuwant jest preferencyjnym induktorem odpowiedzi Th1, który obejmuje przynajmniej jeden spośród: 3D-MPL, saponinowego czynnika immunostymulującego i immunostymulującego oligonukleotydu CpG. Wynalazek obejmuje określoną powyżej kompozycję do stosowania jako lek. W zakres wynalazku wchodzi też szczepionka, która zawiera kompozycję immunogenną według wynalazku. Wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania kompozycji immunogennej wobec wielu patogennych bakterii, który obejmuje etapy: izolowania wielu antygenów polisacharydowych z patogennych bakterii; aktywacji polisacharydów; koniugowania polisacharydów z białkiem D z H. influenzae; oraz mieszania skoniugowanych polisacharydów. Wynalazek obejmuje też zastosowanie skutecznej ilości kompozycji immunogennej według wynalazku do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia zakażenia patogenną bakterią.

6 6 PL B1 A) Szczepionki z polisacharydów pneumokoków Niniejszy wynalazek dostarcza ulepszoną szczepionkę szczególnie dla zapobiegania lub łagodzenia zakażeń pneumokokowych u osób starszych (i/lub niemowląt i małych dzieci). W kontekście wynalazku pacjent jest uważany za osobę starszą, jeśli ma ponad 55 lat, typowo ponad 60 lat i bardziej ogólnie ponad 65 lat. Typowo szczepionka Streptococcus pneumoniae według niniejszego wynalazku zawiera kompozycję immunogenną, która zawiera antygeny polisacharydowe pochodzące z przynajmniej czterech serotypów pneumokoków. Korzystnie cztery serotypy obejmują 6B, 14, 19F i 23F. Bardziej korzystnie w kompozycji włączonych jest przynajmniej 7 serotypów, na przykład pochodzące z serotypów 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F i 23F. Jeszcze bardziej korzystnie w kompozycji włączonych jest przynajmniej 11 serotypów, na przykład pochodzące z serotypów 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F (korzystnie koniugowanych).w korzystnym wykonaniu wynalazku włączonych jest przynajmniej 13 skoniugowanych antygenów polisacharydowych, choć dalsze polisacharydowe antygeny, na przykład 23-walentne (takie jak serotypy 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33F) są też objęte wynalazkiem. Dla szczepienia osób starszych (na przykład dla zapobiegania zapaleniu płuc) jest korzystne włączenie serotypów 8 i 12F (i najbardziej korzystnie także 15 i 22) do opisanej 11-walentnej kompozycji immunogennej, podczas gdy dla niemowląt i małych dzieci (gdzie chodzi o zapalenie ucha środkowego) korzystnie włącza się serotypy 6A i 19A, aby wytworzyć szczepionkę 13-walentną. W kompozycji immunogennej według wynalazku stosuje się nowy nośnik dla polisacharydów, którym jest białko D z Haemophilus influenzae (EP B) lub jego fragmenty. Fragmenty odpowiednie do stosowania obejmują fragmenty zawierające epitopy pomocniczych komórek T. W szczególności fragment białka D będzie korzystnie zawierał N-końcową 1/3 białka. Szczepionki według niniejszego wynalazku korzystnie zawierają adiuwant. Odpowiednie adiuwanty obejmują sól glinową taką jak żel wodorotlenku glinu (alum) lub fosforan glinu, ale mogą też być to sole wapnia, żelaza lub cynku, lub może to być nierozpuszczalna zawiesina acylowanej tyrozyny, lub acylowanych cukrów, kationowe lub anionowe pochodne polisacharydów, lub polifosfazeny. Korzystny adiuwant jest preferencyjnym induktorem odpowiedzi typu Th1, który wspomaga ramię komórkowe odpowiedzi odpornościowej. Wysokie poziomy cytokin typu Th1 sprzyjają zazwyczaj indukcji komórkowych odpowiedzi odpornościowych na dany antygen, podczas gdy wysokie poziomy cytokin typu Th2 zazwyczaj sprzyjają indukcji humoralnych odpowiedzi odpornościowych na antygen. Należy pamiętać, że różnica między odpowiedzią odpornościową typu Th1 i Th2 nie jest bezwzględna. W rzeczywistości u danej osoby wystąpi odpowiedź odpornościowa, którą można opisać jako przede wszystkim Th1 lub przede wszystkim Th2. Jednak często dogodnie rozważa się rodziny cytokin w terminach opisanych dla mysich klonów komórek T CD4 +ve przez Mosmanna i Coffmana (Mosmann, T.R. i Coffman, R.L. (1989). TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, str ). Tradycyjnie, odpowiedzi typu Th1 są związane z produkcją INF-γ i cytokin IL-2 przez limfocyty T. Inne cytokiny często bezpośrednio związane z indukcją odpowiedzi odpornościowej typu Th1 nie są produkowane przez komórki T, takie jak IL-12. Przeciwnie, odpowiedzi typu Th2 są związane z wydzielaniem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Odpowiednie systemy adiuwantowe, które sprzyjają odpowiedzi przede wszystkim Th1, obejmująmonofosforylolipid A lub jego pochodną szczególnie 3-de-O-acylowany monofosforylolipd A, i kombinację monofosforylolipidu A, korzystnie 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A, korzystnie 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A (3D-MPL), razem z solą glinu. Ulepszony system obejmuje kombinację monofosforylolipidu A i pochodnej saponiny, szczególnie kombinację QS21 i 3D-MPL jak ujawniono w WO 94/00153 lub kompozycję mniej reaktogenną, gdzie QS21 jest wygaszony cholesterolem, jak ujawniono w WO 96/ Szczególnie silną formulacją adiuwantu obejmującą QS21, 3D-MPL i tokoferol w emulsji olej-w- -wodzie opisano w WO 95/17210 i jest to korzystna formulacja. Korzystnie szczepionka dodatkowo zawiera saponinę, bardziej korzystnie QS21. Formulacja może też zawierać emulsję olej-w-wodzie i tokoferol (WO 95/17210). Oligonukleotydy zawierające niemetylowany CpG (WO 96/02555) są także korzystnymi induktorami odpowiedzi Th1 i są odpowiednie do stosowania w niniejszym wynalazku.

7 PL B1 7 Według jednego z wykonań wynalazku kompozycja zawiera koniugat polisacharydu pneumokoków i adiuwant Th1 (korzystnie 3D-MPL), który jest zdolny do serokonwersji lub indukcji odpowiedzi humoralnej przeciwciał przeciwko antygenowi polisacharydowemu w populacji nieodpowiadającej. Wiadomo, że 10-30% populacji nie reaguje na immunizację polisacharydami (nie odpowiadają na ponad 50% serotypów w szczepionce) (Konradsen i wsp., Scand. J. Immun 40:251 (1994); Rodriquez i wsp., JID, 173: 1347 (1996)). Może też być tak w przypadku szczepionek koniugowanych (Musher i wsp. Clin. Inf. Dis. 27:1487 (1998). Może być to szczególnie poważne w obszarach wysokiego zagrożenia populacji (niemowlęta, małe dzieci i osoby starsze). Obecni wynalazcy stwierdzili, że kombinacja koniugowanego polisacharydu pneumokoków (na które część populacji może mieć niską odpowiedź) z adiuwantem Th1 może zadziwiająco obejść ten brak odpowiedzi. Korzystnie powinien być stosowany 3D-MPL, a najbardziej korzystnie 3D-MPL pozbawiony adiuwantu na bazie glinu (co daje jeszcze lepszą odpowiedź). Niniejszy wynalazek dostarcza więc takich kompozycji, które umożliwiają leczenie osób nie reagujących na polisacharydy pneumokoków. Sposób zapobiegania lub łagodzenia zapalenia płuc u osób starszych obejmuje podanie bezpiecznej i skutecznej ilości szczepionki tu opisanej, zawierającej antygen polisacharydowy Streptococcus pneumoniae i adiuwant Th1 temu starszemu pacjentowi. Również sposób zapobiegania lub łagodzenia zapalenia ucha środkowego u niemowląt lub małych dzieci obejmuje podanie bezpiecznej i skutecznej ilości szczepionki tu opisanej zawierającej antygen polisacharydowy Streptococcus pneumoniae i adiuwant Th1 temu niemowlęciu lub małemu dziecku. Szczepionki według niniejszego wynalazku mogą być stosowane do chronienia lub leczenia ssaka podatnego na zakażenie przez podanie tej szczepionki drogą ogólnoustrojową lub przez śluzówki. Te podania mogą obejmować iniekcje przez drogi domięśniowe, dootrzewnowe, śródskórne lub podskórne lub przez podanie śluzówkowe do dróg ustnych/pokarmowych, oddechowych i moczowo- -płciowych. Do leczenia zapalenia płuc lub zapalenia ucha środkowego korzystne jest donosowe podanie szczepionek (ponieważ można bardziej skutecznie zapobiec nosicielstwu pneumokoków w nosogardzieli, w ten sposób osłabiając zakażenie w jego najwcześniejszym stadium). Ilość koniugowanego antygenu w każdej dawce szczepionki jest wybierana jako ilość, która indukuje odpowiedź immunoochronną bez znaczących niekorzystnych efektów ubocznych w typowych szczepionkach. Taka ilość będzie zmienna w zależności od tego, który specyficzny immunogen jest stosowany i jak jest prezentowany. Na ogół oczekuje się, że każda dawka będzie zawierała 0,1-100 μg polisacharydu, korzystnie 0,1-50 μg, korzystnie 0,1-10 μg, z czego 1 do 5 μg jest najbardziej korzystnym zakresem. Optymalne ilości składników dla danej szczepionki można ustalić przez standardowe badania obejmujące obserwację odpowiednich odpowiedzi immunologicznych u osobników. Po wstępnym szczepieniu, osobnicy mogą otrzymywać jedno lub więcej odpowiednio rozłożonych w czasie szczepień przypominających. Przygotowanie szczepionki jest ogólnie opisane w Vaccine Design ( The subunit and adjuvant approach (wyd. Powell M.F. i Newman M.J.) (1995) Plenum Press Nowy Jork). Kapsułkowanie w obrębie liposomów jest opisane przez Fullerton, opis patentowy USA 4,235,877. Dla celów niniejszego wynalazku określenie koniugaty polisacharydów pneumokoków według wynalazku obejmuje te koniugaty polisacharydów otoczki Streptococcus pneumoniae, które są bardziej immunogenne w kompozycjach zawierających 3D-MPL w porównaniu z kompozycjami zawierającymi 3D-MPL w połączeniu z adiuwantem na bazie glinu (na przykład koniugaty serotypu 4, serotypu 6B, serotypu 18C, serotypu 19F, lub serotypu 23F). Dla celów niniejszego wynalazku określenie zasadniczo wolna od adiuwantów na bazie glinu obejmuje kompozycję, która nie zawiera dostatecznej ilości adiuwantu na bazie glinu (na przykład wodorotlenku glinu i w szczególności fosforanu glinu), aby spowodować jakiekolwiek zmniejszenie immunogenności koniugatu polisacharydu pneumokoków w kompozycji według wynalazku w porównaniu z ekwiwalentną kompozycją zawierającą 3D-MPL bez dodanego adiuwantu na bazie glinu. Korzystnie kompozycja antygenowa powinna zawierać adiuwant, który składa się zasadniczo z 3D-MPL. Ilości adiuwantu na bazie glinu dodawane na dawkę powinny korzystnie być mniejsze niż 50 μg, bardziej korzystnie mniejsze niż 30 μg, jeszcze bardziej korzystnie mniejsze niż 10 μg i najbardziej korzystnie immunogenne kompozycje według wynalazku nie zawierają adiuwantu na bazie glinu. Dla celów niniejszego wynalazku określenie, czy koniugat polisacharydu pneumokoków jest znacząco bardziej immunogenny w kompozycjach zawierających 3D-MPL w porównaniu z kompozycjami zawierającymi 3D-MPL w połączeniu z adiuwantem na bazie glinu, powinno być prowadzone jak opisano w Przykładzie 2. Jako wskazanie czy kompozycja jest znacząco bardziej immunogenna, gdy zawiera sam

8 8 PL B1 3D-MPL, stosunek stężenia GMC IgG (określony jak w Przykładzie 2) między kompozycjami zawierającymi sam 3D-MPL w porównaniu z ekwiwalentną kompozycją zawierającą 3D-MPL w połączeniu z fosforanem glinu jako adiuwantem powinien być większy niż 2, korzystnie większy niż 5, bardziej korzystnie większy niż 7, jeszcze bardziej korzystnie większy niż 9 i jeszcze bardziej korzystnie większy niż 14. Wśród problemów związanym z podejściem polisacharydowym do szczepienia jest fakt, że polisacharydy jako takie są słabo immunogenne. Strategie zaprojektowane by przezwyciężyć ten brak immunogenności obejmują podłączenie polisacharydu do dużych nośników białkowych, które zapewniają pomoc obecnych komórek T. Jest korzystne by pneumokokowe polisacharydy w kompozycji według wynalazku były podłączone do nośnika białkowego, który zapewnia pomoc obecnych komórek T. Przykłady takich nośników, które mogą być stosowane obejmują anatoksynę dyfterytu, mutanta dyfterytu i tężca (odpowiednio DT, CRM197 i TT), hemocyjaninę skałoczepu (KLH) i oczyszczoną białkową pochodną tuberkuliny (PPD) i OMPC Neisseria meningitidis. Według wynalazku nośnikiem białkowym jest białko D z Haemophilus influenzae (EP B) lub jego fragmenty. W jednym wykonaniu kompozycja antygenowa według wynalazku zawiera polisacharyd pneumokoków serotyp (PS) 4 skoniugowany z białkiem immunogennym D i formułowany z adiuwantem 3D-MPL, przy czym ta kompozycja jest zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu. W dalszych wykonaniach kompozycja antygenowa obejmuje PS 6B, 18C, 19F lub 23F, odpowiednio, skoniugowane z białkiem immunogennym i formułowane z adiuwantem 3D-MPL przy czym kompozycja jest zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu. W jeszcze dalszym wykonaniu wynalazku dostarczona jest skojarzona kompozycja antygenowa zawierająca dwa lub więcej koniugaty polisacharydów pneumokoków z grupy PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F i PS 23F, formułowanych z adiuwantem 3D-MPL, przy czym kompozycja jest zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu. Na immunogenność koniugatów pneumokokowych polisacharydów według wynalazku nie wpływa znacząco kombinacja z innymi koniugatami polisacharydów pneumokoków (Przykład 3). Kompozycja immunogenna według wynalazku jest kombinowaną kompozycją antygenową zawierającą jeden lub więcej koniugatów polisacharydów pneumokoków w kombinacji z jednym lub więcej dalszych koniugatów polisacharydów pneumokoków, sformułowana z adiuwantem 3D-MPL, ale jest zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu. W dalszych korzystnych wykonaniach wynalazku dostarczone są skojarzone kompozycje antygenowe, które zawierają przynajmniej jeden, a korzystnie 2, 3, 4 lub wszystkie 5 z koniugatów polisacharydów pneumokoków z grupy PS 4, 6B, 18C, 19F lub 23F, i w dodatku dowolną kombinację innych koniugatów polisacharydów pneumokoków, formułowanych z adiuwantem 3D-MPL ale zasadniczo pozbawionych adiuwantów na bazie glinu. Typowo skojarzona kompozycja antygenowa Streptococcus pneumoniae według niniejszego wynalazku będzie zawierała koniugowane antygeny polisacharydowe, które pochodzą z przynajmniej czterech, siedmiu, jedenastu, trzynastu, piętnastu lub dwudziestu trzech serotypów. Kompozycje antygenowe według wynalazku są korzystnie stosowane w szczepionkach, które stosuje się aby zapobiegać (lub leczyć) zakażenia pneumokokami, szczególnie u osób starszych i niemowląt i małych dzieci. Korzystnie kompozycje immunogenne (i szczepionki) opisane tu uprzednio są liofilizowane aż do momentu stosowania, gdy są rekonstytuowane rozcieńczalnikiem. Bardziej korzystnie są liofilizowane w obecności 3D-MPL i są rekonstytuowane roztworem soli fizjologicznej. Liofilizacja kompozycji daje w efekcie bardziej stabilną kompozycję (na przykład zapobiega rozpadowi antygenów polisacharydów). Proces jest też zadziwiająco odpowiedzialny za wyższe miano przeciwciał przeciw polisacharydom pneumokoków. Wykazano, że ma to szczególne znaczenie dla koniugatów PS 6B. Trend do szczepionek skojarzonych ma zaletę zmniejszenia niedogodności u biorcy, ułatwienia rozkładu szczepień, i zapewnienia zakończenia cyklu szczepień; ale istnieje zarazem równoczesne ryzyko zmniejszenia skuteczności szczepionki (patrz dyskusja o supresji epitopu przez nadużycie białek nośnikowych powyżej). Byłoby więc korzystne przygotowanie kombinacji szczepionek, które spełniają potrzeby populacji i które dodatkowo nie wykazują interferencji immunogennej między składnikami. Te korzyści mogą być uzyskane przez kompozycje immunogenne (lub szczepionki) według wynalazku, które są szczególnie korzystnie do podawania kombinowanych szczepionek grupom wysokiego ryzyka, takim jak niemowlęta, małe dzieci lub osoby starsze.

9 PL B1 9 Białko D, które jest składnikiem koniugatu z polisacharydem bakteryjnym, jest białkiem wiążącym IgD z Haemophilus influenzae (EP BI) i jest potencjalnym immunogenem. Polisacharydy do koniugacji z białkiem D obejmują korzystnie, antygen polisacharydowy Vi przeciwko Salmonella typhi, polisacharydy meningokoków (w tym typ A, C, W 135 i Y, i polisacharyd i modyfikowane polisacharydy meningokoków grupy B), polisacharydy ze Staphylococcus aureus, polisacharydy ze Streptococcus agalactiae, polisacharydy z Streptococcus pneumoniae, polisacharydy z Mycobacterium np. Mycobacterium tuberculosis (takie jak mannofosfoinozytydy trehalozy, kwas mykolinowy, arabinomannany zakończone mannozą otoczka z nich i arabinogalaktany), polisacharyd z Cryptococcus neoformans, lipopolisacharydy nietypowalnego Haemophilus influenzae, polisacharyd otoczki z Haemophilus influenzae b, lipopolisacharydy Moraxella catharralis, lipopolisacharydy Shigella sonnei, lipopeptydofosfoglikan (LPPG) Trypanosoma cruzi. Polisacharyd może być połączony z białkiem nośnikowym dowolnym znanym sposobem (na przykład Likhite, opis patentowy USA, 4,372,945 i Armor i wsp., opis patentowy US 4,474,757). Korzystnie przeprowadza się koniugację CDAP (WO 95/08348). W CDAP do syntezy koniugatów polisacharyd-białko jest korzystnie stosowany odczynnik cyjanylujący, tetrafluoroboran 1-cyjano-dimetyloamonopirydyniowy (CDAP). Reakcja cyjanylacji może być przeprowadzona w stosunkowo łagodnych warunkach, przez co unika się hydrolizy polisacharydów wrażliwych na zasady. Ta synteza pozwala na bezpośrednie połączenie z białkiem nośnikowym. Polisacharyd jest solubilizowany w wodzie lub roztworze soli fizjologicznej. CDAP rozpuszcza się w acetonitrylu i dodaje natychmiast do roztworu polisacharydu. CDAP reaguje z grupami hydroksylowymi polisacharydu tworząc ester cyjanowy. Po etapie aktywacji dodaje się białko nośnikowe. Grupy aminowe lizyny reagują z aktywowanym polisacharydem tworząc kowalencyjne wiązanie izomocznikowe. Po reakcji sprzęgania dodaje się duży nadmiar glicyny, by wygasić resztkowe aktywowane grupy funkcyjne. Produkt następnie poddaje się sączeniu w żelu, aby usunąć nieprzereagowane białko nośnikowe i resztkowe odczynniki. Tak więc, sposób produkcji koniugatów polisacharyd-białko D obejmuje etap aktywacji polisacharydu i połączenia polisacharydu z białkiem D. W korzystnym wykonaniu według wynalazku dostarczona jest formulacja kompozycji immunogennej (lub szczepionki) dla zapobiegania zakażeniom Streptococcus pneumoniae. Mechanizmy, za pomocą których pneumokoki rozchodzą się do płuca, płynu mózgowordzeniowego i krwi, są słabo zrozumiane. Wzrost bakterii osiągających normalne pęcherzyki płucne jest hamowany przez ich stosunkową suchość i aktywność fagocytową makro fagów pęcherzykowych. Każde zmiany anatomiczne lub fizjologiczne tych skoordynowanych mechanizmów obrony mają skłonność do zwiększania podatności płuc na zakażenie. Ściana komórkowa Streptococcus pneumoniae odgrywa ważną rolę w generacji odpowiedzi zapalnej w pęcherzykach płuca (Gillespie i wsp. (1997)I&I 65:3936). Typowo szczepionka Streptococcus pneumoniae według niniejszego wynalazku będzie zawierała koniugaty polisacharydowe z białkiem D, w których polisacharyd pochodzi z przynajmniej czterech, siedmiu, jedenastu, trzynastu, piętnastu lub 23 serotypów, a kombinacja serotypów zależy od choroby, która ma być leczona. W dalszym wykonaniu dostarczona jest szczepionka Neisseria meningitidis, w szczególności z serotypów A, B, C W-135 i Y. Neiserria meningitidis jest jednym z najważniejszych źródeł bakteryjnego zapalenia opon mózgowych. Otoczka węglowodanowa tych organizmów może działać jako determinanta wirulencji i cel dla przeciwciała ochronnego. Jednak wiadomo, że węglowodany są słabymi immunogenami u małych dzieci. Zgodnie z wynalazkiem dostarczony jest szczególnie odpowiedni nośnik białkowy dla tych polisacharydów, białko D, które dostarcza epitopy komórek T, które mogą aktywować odpowiedź komórek T, aby pomóc w proliferacji i dojrzewaniu komórek B specyficznej dla antygenu polisacharydowego, jak i w indukcji pamięci immunologicznej. W alternatywnym wykonaniu wynalazku kompozycja obejmuje koniugat polisacharyd otoczki Haemophilus influenzae b (PRP)-białko D. Wynalazek obejmuje też szczepionki skojarzone, które dostarczają ochrony przed szeregiem różnych patogenów. Białko D jako nośnik jest nieoczekiwanie użyteczne jako nośnik w szczepionkach skojarzonych, zawierających wiele koniugowanych antygenów polisacharydowych. Jak wspomniano powyżej, jest prawdopodobne zajście supresji epitopu jeśli dla każdego polisacharydu jest stosowany ten sam nośnik. W WO 98/51339 przedstawiono kompozycje, w których próbowano zminimalizować tę interferencję przez koniugację części polisacharydów w kompozycji na DT i resztę na TT.

10 10 PL B1 Nieoczekiwanie, obecni wynalazcy stwierdzili, że białko D jest szczególnie odpowiednie do minimalizacji takich efektów supresji epitopów w szczepionkach skojarzonych, w których wszystkie antygeny są koniugowane z białkiem D. Korzystna kombinacja obejmuje szczepionkę, która nadaje ochronę przed zakażeniem Neisseria meningitidis C i Y (i korzystnie A) zawierająca antygen polisacharydowy z jednego lub więcej z serotypów Y i C (i najbardziej korzystnie A) połączony z białkiem D. Szczepionka oparta na polisacharydzie z Haemophilus influenzae (PRP koniugowany z korzystnie TT, DT lub CRM197, lub najbardziej korzystnie z białkiem D) może być sformułowana z powyższymi szczepionkami skojarzonymi. Wiele szczepionek pediatrycznych jest obecnie podawanych jako szczepionka skojarzona, tak aby zmniejszyć liczbę iniekcji, które dziecko musi otrzymać. Tak więc dla szczepionek pediatrycznych inne antygeny mogą być formułowane ze szczepionkami według wynalazku. Na przykład, szczepionki według wynalazku mogą być formułowane z lub podawane oddzielnie ale w tym samym czasie ze znaną triwalentną szczepionką skojarzoną zawierającą anatoksynę dyfterytu (DT), anatoksynę tężca (TT) i składniki kokluszu (typowo detoksyfikowaną anatoksynę kokluszu (PT) i filamentalną hemaglutyninę (FHA) ewentualnie z pertaktyną (PRN) i/lub aglutyniną 1+2], na przykład jak sprzedawana szczepionka INFANRIX-DTPa (SmithKlineBeecham Biologicals), która zawiera antygeny DT, TT, PT, FHA i PRN, lub z całymi komórkami bakterii wywołującej koklusz, na przykład jak sprzedawana przez SmithKlineBeecham Biologicals s.a. jako Tritanrix. Szczepionka skojarzona może też zawierać inne antygeny, takie jak antygen powierzchniowy wirusowego zapalenia wątroby typu B (HBsAg), antygeny wirusa polio (na przykład inaktywowany triwalentny wirus polio - IPV), białka błony zewnętrznej Moraxella catarrhalis, białka nietypowalnego Haemophilus influenzae, białka zewnętrznej błony N. meningitidis B. Przykłady korzystnych antygenów białkowych Moraxella catarrhalis w szczepionce skojarzonej (szczególnie dla zapobiegania zapaleniu ucha środkowego) obejmują: OMP106 [WO 97/41731( Amtex) i WO 96/34960 (PMC)]. OMP21; LbpA i LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA i TbpB [WO 97/13785 i WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME i wsp. (1993) Infect Immun, 61: ]; UspAl/2 [WO 93/03761 (University of Texas); i OmpCD. Przykłady antygenów nietypowalnego Haemophilus influenzae, które mogą być włączone do szczepionki skojarzonej (szczególnie do zapobiegania zapaleniu ucha środkowego) obejmują: białko fimbryny [(US Ohio State Research Foundation)] i fuzje zawierające pochodzące stąd peptydy [np. fuzje peptydowe LB1(f); US (OSU) lub WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP (State University of New York)]; TbpA i TbpB; Hia; Hmw1,2; Hap i D15. Korzystne szczepionki pediatryczne rozważane przez niniejszy wynalazek obejmują: a) Koniugat polisacharydu C N. meningitidis i koniugat polisacharydu Haemophilus influenzae b, ewentualnie z koniugatem polisacharydu N. meningitidis A i/lub Y, pod warunkiem, że wszystkie polisacharydy są skoniugowane z białkiem D. b) Szczepionka a) z DT, TT, składnikami kokluszu (korzystnie PT, FHA i PRN), antygenem powierzchniowym wirusowego zapalenia wątroby typu B i IPV (inaktywowana triwalentna szczepionka wirusa polio). c) Antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae koniugowane z białkiem D. d) Szczepionka c) z jednym lub więcej antygenami z Moraxella catarrhalis i/lub nietypowalnego Haemophilus influenzae. Wszystkie powyższe szczepionki skojarzone mogą skorzystać z włączenia białka D jako nośnika. Jest jasne, że im więcej nośników bierze udział w skojarzonej szczepionce (na przykład by zapobiec supresji epitopu) tym droższa i bardziej złożona będzie ostateczna szczepionka. Zatem uzyskuje się znaczne korzyści, gdy wszystkie antygeny polisacharydowe są koniugowane z białkiem D. W szczepionce według wynalazku antygeny polisacharydowe z białkiem D korzystnie zawierają adiuwant. Odpowiednie adiuwanty obejmują sól glinową taką jak żel wodorotlenku glinu (alum) lub fosforan glinu, ale mogą też być solą wapnia, żelaza lub cynku, lub mogą być nierozpuszczalną zawiesiną acylowanej tyrozyny, lub acylowanych cukrów, kationowymi lub anionowymi pochodnymi polisacharydów, lub polifosfazenami. Do szczepionek dla osób starszych korzystnie adiuwant jest preferencyjnym induktorem odpowiedzi typu Th1. Białko D jest korzystnie stosowane w szczepionce przeciwko zapaleniu ucha środkowego, ponieważ samo jest immunogenem zdolnym do generowania ochrony z udziałem komórek B przeciwko nietypowalnym H. influenzae (nthi), które mogą wnikać do komórek gospodarza i unikać efektów z udziałem komórek B indukowanych przez antygen białkowy. Obecni wynalazcy wykryli nieoczekiwanie

11 PL B1 11 znaleźli sposób zwiększenia skuteczności białka D (albo samego albo jako nośnika dla polisacharydu) jako antygenu dla szczepionki przeciw zapaleniu ucha środkowego. Sposób ten polega na dodaniu adiuwantu do białka D, co indukuje silną odpowiedź Th1 u pacjenta tak, że ramię komórkowe układu odpornościowego jest optymalizowane przeciw białku D. Jest to nieoczekiwanie osiągnięte przez stosowanie liofilizowanej kompozycji zawierającej białko D i adiuwant Th1 (korzystnie 3D-MPL), która jest rekonstytuowana krótko przed podaniem. W szerszym znaczeniu wynalazcy przewidują że liofilizacja immunogenu w obecności adiuwantu Th1, korzystnie 3D-MPL, zazwyczaj będzie wzmagała odpowiedź Th1 przeciw immunogenowi. P r z y k ł a d y Przykłady ilustrują lecz nie ograniczają wynalazku. P r z y k ł a d 1 Polisacharyd otoczki S. pneumoniae: 11-walentny kandydat na szczepionkę obejmuje serotypy polisacharydów otoczki 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F, przygotowane zasadniczo tak jak opisano w EP Każdy polisacharyd jest aktywowany i derywatyzowany metodą chemii CDAP (WO 95/08348) i koniugowany z nośnikiem białkowym. Wszystkie polisacharydy koniuguje się w ich formie natywnej, oprócz serotypu 3 (którego rozmiar zmniejszono w celu obniżenia jego lepkości). Nośnik białkowy: Wybranym nośnikiem białkowym jest zrekombinowane białko D (PD) z nietypowalnego Haemophilus influenzae, wyrażane w E. coli. Ekspresja białka D Białko D z Haemophilus influenzae Konstrukty genetyczne do ekspresji białka D Materiały wyjściowe DNA kodujący białko D Białko D jest silnie konserwowane pośród wszystkich serotypów H. influenze i szczepów nietypowalnych. Wektor phic348 zawierający sekwencję DNA kodującą całe białko D otrzymano od dr A. Forsgren, Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmo General Hospital, Malmo, Sweden. Sekwencja DNA białka D została opublikowana przez Janson i wsp. (1991) Infect. Immun. 59: Wektor ekspresyjny pmg1 Wektor ekspresyjny pmg1 pochodzi od pbr322 (Grossi i wsp., 1985), do którego wprowadzono elementy kontrolne dla transkrypcji i translacji wstawionych obcych genów, pochodzące z bakteriofaga λ, (Shatzman i wsp., 1983). Ponadto gen oporności na ampicylinę zastąpiono genem oporności na kanamycynę. Szczep E. coli AR58 Szczep E. coli AR58 uzyskano przez transdukcję N99 wyjściową zawiesiną faga P1 wcześniej hodowanego na pochodnej SA500 (gale::tn10, lambdakil - ci857 ΔH1). N99 i SA500 są szczepami E. coli K12 pochodzącymi z laboratorium dr Martina Rosenberga w National Health Institute. Wektor ekspresyjny wektora pmg1 W celu produkcji białka D, DNA kodujący białko wklonowano do wektora ekspresyjnego pmg 1. Plazmid ten do kierowania transkrypcją i translacją wstawionych obcych genów wykorzystuje sygnały z DNA faga lambda. Wektor zawiera promotor PL, operator OL i dwa miejsca wykorzystywania (NutL i NutR) do uwolnienia mechanizmów polarności transkrypcyjnej po dostarczeniu białka N (Gross i wsp., 1985). Wektory zawierające promotor PL wprowadza się do lizogenicznego szczepu E. coli aby stabilizować DNA plazmidowy. Lizogeniczne szczepy gospodarze zawierają wadliwy pod względem replikacji DNA faga lambda wintegrowany w genom (Shatzman i wsp., 1983). Chromosomowy DNA faga lambda kieruje syntezą białka represora cl, które wiąże się z represorem OL w wektorze i zapobiega wiązaniu się polimerazy RNA z promotorem PL, a więc transkrypcji wstawionego genu. Gen cl szczepu ekspresyjnego AR58 zawiera mutanta termowrażliwego, tak że, transkrypcja kierowana przez PL może być regulowana przez zmianę temperatury, tj. wzrost temperatury hodowli inaktywuje represor i rozpoczyna się synteza obcego białka. System ekspresyjny pozwala na kontrolowaną syntezę obcych białek, szczególnie takich, które mogą być toksyczne dla komórki (Shimataka i Rosenberg, 1981). Szczep E. coli AR58 Lizogeniczny szczep E. coli wykorzystywany do produkcji nośnikowego białka D jest pochodną standardowego szczepu E. coli K12 z NIH - N99 (F - su - galk2, lacz -, thr - ). Zawiera wadliwy lizogenny

12 12 PL B1 fag lambda (gale::tn10, lambdakil - ci857 ΔH1). Fenotyp Kil - zapobiega wyłączeniu syntezy makrocząsteczek gospodarza. Mutacja ci857 nadaje patologiczną zmianę termo wrażliwą represorowi cl. Delecja ΔH1 usuwa prawy operon faga lambda i loci gospodarza bio, uvr3 i chla. Szczep AR58 uzyskano przez transdukcję N99 wyjściową zawiesiną faga P1 wcześniej hodowanego na pochodnej SA500 (ga- 1E::TN10, lambdakil - ci857 ΔH1). Wprowadzenie defektywnego lizogenu do N99 selekcjonowano na tetracyklinie dzięki obecności transpozonu TN10 kodującego oporność na tetracyklinę w przylegającym genie gale. Konstrukcja wektora pmgmdpprd Wektora pmg 1, który zawiera gen kodujący niestrukturalne białko S1 wirusa grypy (pmgnsi) użyto do skonstruowania pmgmdpprd. Gen białka D amplifikowano techniką PCR z wektora phic348 (Janson i wsp., 1991) za pomocą starterów do PCR zawierających miejsca restrykcyjne Ncol i Xbal, odpowiednio, na końcach 5' i 3'. Fragment NcoI/Xbal następnie wprowadzono do pmgns1 między Ncol i Xbal, w ten sposób tworząc fuzję białkową zawierającą 81 N-końcowych aminokwasów białka NS1, po których następuje białko PD. Wektor ten oznaczono jako pmgns1prd. W oparciu o konstrukt opisany powyżej wytworzono ostateczny konstrukt do ekspresji białka D. Fragment BamHI/BamHI usunięto z pmgns1prd. Taka hydroliza DNA usuwa region kodujący NS1, oprócz pierwszych trzech N-końcowych aminokwasów. Po ponownej ligacji wektora, wytworzono gen kodujący fuzję białkową o następującej sekwencji aminokwasowej na N końcu: ----MDP SSHSSNMANT---- NS1 Białko D Białko D nie zawiera peptydu liderowego lub N-końcowej cysteiny, do której normalnie przyłączone są łańcuchy lipidowe. Białko nie jest więc ani wydzielane do periplazmy, ani lipidowane i pozostaje w cytoplazmie w formie rozpuszczalnej. Końcowy konstrukt pmg-mdpprd wprowadzono do szczepu gospodarza AR58 przez szok temperaturowy w 37 C. Bakterie zawierające plazmid selekcjonowano w obecności kanamycyny. Obecność wstawki DNA kodującego białko D wykazano przez trawienie wyizolowanego DNA plazmidu wybranymi endonukleazami. Zrekombinowany szczep E. coli określono jako ECD4. Ekspresja białka D jest pod kontrolą promotora lambda P L /operatora O L. Szczep gospodarz AR58 zawiera w genomie termo wrażliwy gen cl, który przez wiązanie z O L blokuje ekspresję z lambda P L w niskiej temperaturze. Gdy temperatura się podniesie, cl uwalnia się z O L i białko D ulega ekspresji. Pod koniec fermentacji komórki zagęszcza się i zamraża. Ekstrakcję z zebranych komórek i oczyszczanie białka D przeprowadzono w następujący sposób. Zamrożony osad hodowli komórek rozmrożono i zawieszono w roztworze do rozrywania komórek (bufor cytrynianowy ph 6,0) do końcowego OD 650 = 60. Zawiesinę dwukrotnie przepuszczano przez homogenizator wysokociśnieniowy przy P = 100 Pa. Homogenat hodowli komórek klarowano przez wirowanie i szczątki komórek usuwano przez filtrację. Na pierwszym etapie oczyszczania filtrowany lizat nanoszono na kolumnę do chromatografii kationowymiennej (SP Sepharose Fast Flow ). PD wiąże się z matrycą żelową przez oddziaływanie jonowe i jest wypłukiwane przez stopniowy wzrost siły jonowej buforu do wypłukiwania. Na drugim etapie oczyszczania zanieczyszczenia zatrzymują się na matrycy anionowymiennej (Q Sepharose Fast Flow). PD nie wiąże się z żelem i można je zebrać z cieczą przepływającą. Na obu etapach chromatografii kolumnowej zbieranie frakcji śledzi się przez OD. Ciecz wypływającą z anionowymiennej chromatografii kolumnowej zawierającą oczyszczone białko D zagęszcza się przez ultrafiltrację. Retentat z ultrafiltracji zawierający białko D na końcu przepuszcza się przez błonę 0,2 μm. Chemia Aktywacja i chemia sprzęgania: Warunki aktywacji i sprzęgania są specyficzne dla każdego polisacharydu. Podano je w Tabeli 1. Natywne polisacharydy (oprócz PS3) rozpuszczano w 2M NaCl lub w wodzie do wstrzykiwania. Optymalne stężenie polisacharydów ustalono dla wszystkich serotypów. Ze 100 mg/ml roztworu wyjściowego w acetonitrylu, dodano CDAP (stosunek CDAP/PS 0,75 mg/mg PS) do roztworu polisacharydu. 1,5 minuty później dodano 0,2M trietyloaminy, aby otrzymać specyficzne ph aktywacji. Aktywację polisacharydu przeprowadzano w tym ph w ciągu 2 minut w 25 C. Białko D (ilość zależy od początkowego stosunku PS/PD) dodano do aktywowanego polisacharydu i przeprowadzono reakcję sprzęgania w specyficznym ph przez 1 godzinę. Reakcję następnie tłumiono glicyną przez 30 minut w 25 C i przez noc w 4 C.