Prof. dr hab. Józef Korczak Poznań, 20 marca 2014 r. Katedra Technologii Żywienia Człowieka Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu.

Transkrypt

1 Prof. dr hab. Józef Korczak Poznań, 20 marca 2014 r. Katedra Technologii Żywienia Człowieka Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu Recenzja pracy doktorskiej Pani mgr inż. Kamili Borowiec p.t.: Aktywność antycholinoesterazowe, przeciwutleniające i przeciwcukrzycowe owoców borówki czarnej (Vaccinum myrtillus L.) w kontekście choroby Alzheimera, wykonanej pod kierunkiem Pana prof. dr hab. Zdzisława Targońskiego i Pana dr hab. Dominika Szwajgiera w Katedrze Biotechnologii, Żywienia Człowieka i Towaroznawstwa Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie. Wprowadzenie Składniki żywności o istotnych właściwościach biologicznych wzbudzają rosnące zainteresowanie technologów i chemików żywności, żywieniowców i dietetyków oraz biologów i biochemików. Wśród nich bardzo ważne znaczenie przypisuje się naturalnym przeciwutleniaczom, zdolnym do ograniczenia stresu oksydacyjnego w organizmie człowieka, stanowiącego czynnik ryzyka wielu schorzeń, w tym neurodegeneracyjnych, których przykładem jest choroba Alzheimera. Uznanym źródłem składników o prozdrowotnych właściwościach, w tym o działaniu przeciwutleniającym są owoce jagodowe, a wśród nich szczególną uwagę zwraca się na owoce czarnej borówki, znanej jako produkt o wielokierunkowym działaniu leczniczym wykorzystywanym w medycynie tradycyjnej. Poznanie mechanizmów ich ukierunkowanego prozdrowotnego oddziaływania w zapobieganiu choroby Alzheimera oraz cukrzycy, które dotąd nie były szerzej badane, stanowiło podstawę do sformułowania tez pracy, postawienia celu oraz przyjęcia zakresu badań przedstawionej do oceny dysertacji doktorskiej mgr inż. Kamili Borowiec. Ocena formalna rozprawy Przedstawiona do oceny dysertacja jest kompletnym, typowym opracowaniem o charakterze eksperymentalnym, obejmującym łącznie 179 stron, w tym 77 rysunków oraz 19 tabel. Struktura i podział części pracy są prawidłowe, część literaturowa zajmuje 38 stron, opis materiałów i metod 26 stron, a pozostałą część obejmują: prezentacja, omówienie i dyskusja uzyskanych wyników, wnioski oraz spis bibliografii. 1

2 Ocena mer ytoryczna pracy Pierwszy rozdział pracy stanowi krótki wstęp, w którym Autorka właściwie wprowadza czytelnika w problematykę swojej dysertacji oraz uzasadnia wybór tematu i celu badań. Następnie w kolejnych rozdziałach części literaturowej zostały dobrze scharakteryzowane podstawowe zagadnienia ściśle związane z zakresem pracy, a przez to uzasadniają sformułowanie tez pracy, postawienie głównego celu oraz przyjęcie metod postępowania w realizacji celów szczegółowych. Poszczególne rozdziały tej części zostały napisane starannie z wykorzystaniem ilustracji w postaci wzorów chemicznych, schematów przemian, rysunków i tabel. Bardzo wyczerpująco omówiono w nich prezentowane zagadnienia. Autorka przygotowała część literaturową na podstawie bardzo starannie dokonanego przeglądu piśmiennictwa, przede wszystkim o charakterze źródłowym. Dobór najnowszego piśmiennictwa o zasięgu światowym, łącznie w zestawieniu 500 pozycji, oraz jego wykorzystanie w części literaturowej, a także przy dyskusji wyników, świadczą o umiejętności Autorki w korzystaniu z dostępnej literatury i o jej dobrym rozeznaniu w badanej problematyce. Stwierdzenie to podkreśla także fakt odnoszenia do własnych oryginalnych opracowań. Hipoteza badawcza pracy i jej główny cel zostały określone prawidłowo. Autorka w swojej dysertacji zamierzała poznać składniki owoców borówki czarnej charakteryzujące się zdolnością do hamowania cholinoesteraz oraz właściwościami przeciwutleniającymi, których działanie może wpływać na rozwój choroby Alzheimera, przebieg cukrzycy oraz poprawę funkcji pamięciowych. Dodatkowo podjęta została próba optymalizacji procesu otrzymywania soku z owoców borówki czarnej w celu podwyższenia zdolności do hamowania aktywności cholinoesteraz oraz właściwości przeciwutleniających. Przyjęty zakres badań zrealizowano z zastosowaniem właściwych metod, wykorzystujących różnorodne techniki pracy, zarówno o charakterze technologicznym i żywieniowym, oraz zastosowano nowoczesne analizy biologiczne i chemiczne z wykorzystaniem zaawansowanych metod instrumentalnych. Poszczególne doświadczenia dokładnie opisano oraz właściwie uzasadniano przyjęte warianty badań, co ułatwiło czytelnikowi śledzenie sposobów realizacji kolejnych etapów pracy. Zasadniczy badany materiał stanowiły owoce borówki czarnej zakupione w postaci świeżej (latem) lub zamrożonej (zimą). Przygotowano z nich wyciągi metodą tradycyjną oraz z zastosowaniem obróbki cieplnej (dwa warianty) i enzymatycznej (7 preparatów 2

3 enzymatycznych, większość pektynolitycznych). Otrzymane soki poddano wieloetapowemu badaniu ich składu oraz właściwości prozdrowotnych. Pierwszymi etapami były oznaczenia ich zdolności do hamowania aktywności acetyloi butyrylocholinoesterazy oraz właściwości przeciwutleniających wobec rodników DPPH oraz ABTS. Te aktywności soków z owoców borówki czarnej porównywano z 19 wzorcowymi związkami występującymi w tych owocach. Dość zaskakującym stwierdzeniem było wykazanie, że związki te nie występowały we frakcji wyizolowanej z soku borówki czarnej o aktywności inhibitorów cholinoesteraz. Wykazano natomiast obecności innych związków, których występowania w owocach borówki czarnej wcześniej nie wykryto. Kolejnym, moim zdaniem najbardziej zaawansowanym analitycznie, etapem pracy była próba identyfikacji związków odpowiedzialnych za prozdrowotne działanie owoców borówki czarnej. W tym celu zastosowano takie techniki analityczne, jak ultrafiltrację, rozdział na kolumnie chromatograficznej, preparatywną i analityczną chromatografię cieczową, identyfikację związków za pomocą spektroskopii w podczerwieni oraz magnetycznego rezonansu jądrowego oraz chromatografię cieczową ze spektrometrią masową. Takie postępowanie pozwoliło Autorce wskazać dwa związki najbardziej aktywne w hamowaniu aktywności cholinoesteraz, oraz ich pochodne. Następnym etapem poznawania właściwości składników owoców czarnej borówki było badanie cytotoksyczności, genotoksyczności i mutagenności. Takie postępowanie jest bardzo istotne wobec faktu, że owoce borówki nie są spożywane powszechnie i konieczne jest określanie bezpieczeństwa ich zwiększonych dawek. Badania te prowadzono na liniach komórkowych nabłonka jelita IEC-6, gruczolaka jelita grubego Caco-2 oraz komórek wątroby HepG2, również w warunkach stresu oksydacyjnego oraz testem Amesa. Ciekawym wynikiem tych badań było stwierdzenie braku wpływu ultrafiltratu soku na proliferację i żywotność wszystkich trzech typów komórek oraz jego właściwości mutagennych i promutagennych. Składniki tego soku wykazały ponadto właściwości ochronne wobec DNA hepatocytów w wywołanym stresie oksydacyjnym. Etapem wieńczącym pracę były badania żywieniowe prowadzone na szczurach w celu wykazania znaczenia owoców borówki czarnej w poprawie funkcji pamięciowych oraz ich wpływu na rozwoju choroby Alzheimera oraz cukrzycy. W badaniach wykazano poprawę pamięci krótko- i długotrwałej zwierząt w czasie trzymiesięcznego podawania im owoców borówki czarnej. Nie stwierdzano natomiast istotnych różnic w większości oznaczanych parametrów biochemicznych we krwi w czasie długotrwałego ośmiomiesięcznym podawania 3

4 zwierzętom badanych owoców. Stwierdzano tylko wpływ takiej długotrwałej diety na prawidłową funkcję wątroby i nerek oraz zwiększenie masy mózgowia. Podobnie nie stwierdzano wpływu podawania owoców borówki na wskaźniki występowania cukrzycy u zwierząt z wywołaną cukrzycą w czasie sześciotygodniowego doświadczenia. Szkoda, że w tych doświadczeniach nie poszerzono zakres badań biochemicznych o wskaźniki statusu antyoksydacyjnego organizmów zwierząt. mogły to być np. enzymy antyoksydacyjne (np. SOD), zredukowany glutation lub markery uszkodzeń oksydacyjnych (np. TBARS, lub grupa karbonylowanych białek). Takie wskaźniki pozwoliłyby na pełniejsze określenie właściwości przeciwutleniających składników zawartych w badanych owocach czarnej borówki. W ogólnym stwierdzeniu pragnę zaznaczyć, że wyniki bardzo szerokiego zakresu badań zostały starannie opracowane, właściwie statystycznie oszacowane i przejrzyście przedstawione na rysunkach i w tabelach. Prezentacja wyników i ich mówienie zostały dokonane w sposób syntetyczny i precyzyjny, z zachowaniem podziału pracy na kolejne zadania badawcze. W wprowadzeniu do każdego rozdziału Doktorantka zawarła krótkie uzasadnienie zastosowanych wariantów doświadczeń i odnosiła do odpowiednich rozdziałów części metodycznej pracy. Takie wprowadzenie ułatwiło skupienie nad kolejnymi fragmentami wyników rozbudowanego zakresu doświadczeń. Przy omawianiu wyników Autorka sprawnie analizowała stwierdzane zależności, odnosząc się do bardzo skoncentrowanych zawartości materiałów ilustracyjnych. Godne podkreślenia jest również wskazywanie w wielu częściach tego rozdziału postulatów dalszych badań dla pełniejszego poznania badanej problematyki. W przedostatnim obszernym - 16 stronicowym rozdziale, została przeprowadzona wnikliwa dyskusja stwierdzonych zależności i ich odnoszenie do danych literaturowych, o ile takie można znaleźć, bowiem wiele zamieszczonych w dysertacji badań miało charakter nowatorski. Często Doktorantka odnosi wyniki uzyskane w swojej pracy także do publikacji, które ukazały się w ostatnim roku, a więc rezultatów badań prowadzonych równolegle, co świadczy o aktualności podjętej przez nią problematyki badawczej. W końcowej części pracy Autorka sformułowała 12 wniosków i stwierdzeń, których kolejność wynika bardziej z logiki, a mniej z kolejności przeprowadzonych doświadczeń. Tak ułożone wnioski uważam za właściwsze w porównaniu z kolejnością prezentacji wyników i ich dyskusji. Przedstawione wnioski, chociaż może zawierające za bardzo szczegółowe stwierdzenia, świadczą o zrealizowaniu głównego celu pracy. 4

5 Przytoczone wcześniej uwagi nie obniżają wartości naukowej pracy, którą oceniam bardzo wysoko. Stanowi ona bowiem oryginalne podejście do rozwiązanie problematyki poznawania mechanizmów biologicznego oddziaływania składników zawartych w owocach borówki czarnej w aspekcie prewencji i leczenia choroby Alzheimera oraz cukrzycy. Doktorantka wykazała się dobrym rozeznaniem w badanej problematyce oraz umiejętnością samodzielnego prowadzenia pracy naukowej. Jako najważniejsze, pod względem oryginalności naukowej chciałbym wskazać następujące osiągnięcia pracy: - Przeprowadzenie złożonej procedury identyfikacji składników owoców borówki czarnej wykazujących efektywność w hamowaniu aktywności cholinoesteraz; - Wykazanie prokognitywnego działania składników borówki czarnej w doświadczeniu przeprowadzonym na szczurach; - Stwierdzenie korzystnego działania składników owoców borówki czarnej na organizm szczurów w długookresowym doświadczeniu żywieniowym; - Optymalizacja technologii otrzymywania soku z czarnej borówki pozwalającej na zwiększenie w nim zawartości związków bioaktywnych. Wniosek końcowy Rozważając całość ocenianej dysertacji, stwierdzam, że zawiera wyróżniające się dobrym poziomem opracowanie eksperymentalne, w wielu elementach nowatorskie na skalę krajową i światową, przygotowane w laboratorium dobrze wyposażonym, zorganizowanym i kierowanym. Dlatego uważam, że rozprawa naukowa Pani mgr inż. Kamili Borowiec p.t.: Aktywność anty-cholinoesterazowe, przeciwutleniające i przeciwcukrzycowe owoców borówki czarnej (Vaccinum myrtillus L.) w kontekście choroby Alzheimera odpowiada wymaganiom stawianym pracom doktorskim. Dlatego przedkładam Radzie Wydziału Nauk o Żywności i Biotechnologii Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie wniosek o dopuszczenie Pani mgr inż. Kamili Borowiec do dalszych etapów przewodu doktorskiego. 5