Toksykometria. Cele badań toksykometrycznych. Ocena toksyczności związku na podstawie zależności struktura chemiczna aktywność biologiczna

Transkrypt

1 Toksykometria Toksykometria zajmujesię oceną toksycznego działania substancji. istnieje ok. 52 mln substancji chemicznych ok związków chemicznych (spisy substancji TSCA,EINECS) ok to substancje wielkotonażowe (10.000ton/rok) ok nowych substancji na rynku rocznie (leki, barwniki, rozpuszczalniki, składniki mas plastycznych, kosmetyki, pestycydy, środki dodawane do żywności lub paszy zwierzęcej) Cele badań toksykometrycznych wykrycie szkodliwego działania związku jakościowa i ilościowa charakterystyka związku ustalenie przyczyny zgonu wyjaśnienie mechanizmów działania toksycznego odpowiednie zabezpieczenie przy produkcji, transporcie, przechowywaniu, dystrybucji i użyciu określonej substancji określenie dopuszczalnych parametrów ekspozycji człowieka i środowiska naturalnego (dopuszczalne stężenia, dawki dzienne) badania toksykometryczne przeprowadzane są na zwierzętach i testach in vitro (względy etyczne) wyspecjalizowane laboratoria, personel, zwierzętarnie, aparatura badawcza ujednolicenie metod i zakresu badań Wytyczne do badań substancji chemicznych (OECD Organization for Economic Cooperation and Development, Organizacja Współpracy Ekonomicznej i Rozwoju) Etapy badań toksykometrycznych Ocena właściwości fizykochemicznych Porównanie ze związkami podobnymi (struktura chemiczna aktywność biologiczna) Ocena efektów odległych Genotoksyczność, rakotwórczość, teratotwórczość Wpływ na płodność, rozrodczość i potomstwo Ocena toksyczności ostrej Działania drażniącego Działania uczulającego Badania dodatkowe (drogi podania, toksykokinetyka, metabolizm) Ocena toksyczności przewlekłej w teście 2 letnim (lub rocznym) Ocena toksyczności podostrej 14, 21, 28 dni (przy powtarzanym dawkowaniu) Ocena działania kumulatywnego Ocena toksyczności podprzewlekłej 90 dni (przy powtarzanym dawkowaniu) Ocena toksyczności związku na podstawie zależności struktura chemiczna aktywność biologiczna Aldehydy = dz. drażniące Nitrozwiązki aromatyczne i aminopochodne = dz. methemoglobinotwórcze Chloropochodne alifatyczne = uszkodzenia wątroby Związki fosforoorganiczne = inh. acetylocholinoesterazy (AChE) Ocena działania neurotoksycznego 1

2 Ocena toksyczności związku na podstawie zależności struktura chemiczna aktywność biologiczna Ocena toksyczności związku na podstawie zależności struktura chemiczna aktywność biologiczna Zależność aktywności działania toksycznego i kancerogennego od struktury chemicznej i właściwości fizykochemicznych związku (QSAR quantitative structure activity relationship) Budowa chemiczna Ze wzrostem liczby atomów C w cząsteczce alkoholi alifatycznych rośnie siła ich narkotycznego działania (prawo Richardsona, 1869 r.), podobnie alkany, alkeny, chloropochodne węglowodory, ketony, estry. Toksyczność węglowodorów alifatycznych rośnie ze wzrostem rozgałęzienia łańcucha Węglowodory nienasycone (benzen) są bardziej toksyczne niż nasycone Właściwości fizykochemiczne Aktywność chemiczna (cykloheksan) Aktywność biologiczna Ocena toksyczności związku na podstawie zależności struktura chemiczna aktywność biologiczna Ocena toksyczności związku na podstawie zależności struktura chemiczna aktywność biologiczna Toksyczność związków zwiększa się, gdy dodane podstawniki: Toksyczność związków zmniejsza się, gdy dodane podstawniki: OH w związkach aromatycznych (fenol bardziej toksyczny niż benzen) OH w związkach alifatycznych (glicerol bardzo mało toksyczny w CH 3 w związkach pierścieniowych porównaniu z propanolem) NH 2 dz. methemoglobinotwórcze COOH w związkach łańcuchowych i pierścieniowych (zwiększa NO 2, NO silne działanie utleniające rozpuszczalność i ułatwia wydalanie przez nerki) CN, F prowadzi do syntezy letalnej SO 3 H zwiększa rozpuszczalność związków w wodzie, lepsze wydalanie przez nerki SH, CH 3 CO CH 3 O C 2 H 5 O, N=N Ocena toksyczności związku na podstawie zależności struktura chemiczna aktywność biologiczna Właściwości fizykochemiczne wpływają na toksyczność (temperatura wrzenia benzenu 80 o C, niższa niż homologów, np. toluenu, ksylenu), zbliżone wartości LD 50 a ryzyko zatrucia benzenem największe Lipofilowość substancji (współczynnik podziału olej/woda) Łazariew, 1944 r. Ułatwia transport do receptora (przenikanie przez bariery lipidowe), ale nadmierna lipofilowość powoduje zatrzymanie substancji w pierwszej napotkanej warstwie lipidowej. P o / w C C o w Zwierzęta doświadczalne Zalecane stosowanie dwóch różnych gatunków zwierząt (jeden z nich nie może być gryzoniem), najczęściej myszy i szczury W szczególnych przypadkach koty, psy, naczelne, jednodniowe kurczęta, kury, pstrągi, świnki morskie, chomiki Używa się obu płci (wpływ hormonów i różna aktywność enzymów) Zwierzęta zdrowe, młode, dojrzałe płciowo, o zbliżonej masie ciała (+/ 10%), aklimatyzowane do warunków doświadczalnych min. 5 dni Stabilne warunki klimatyczne (temp. 23 o C, wilgotność wzgl %), cykl oświetlenia 12h/12h Swobodny dostęp do wody i karmy (kontrola zanieczyszczeń) Grupa kontrolna przebywa w tych samych warunkach 2

3 Drogi narażenia Ocena toksyczności ostrej doustnie (p.o. per os) inhalacyjnie (inh. inhalation) dożylnie (i.v. via intervenosa) skórnie (cutanous, derm) podskórnie (s.c. via subcutanea) naskórnie (p.c. via percutanea) domięśniowo (i.m. via intramuscularia) dootrzewnowo (i.p. via intraperitonealis) Toksyczność ostra jest to zdolność substancji do wywołania efektu toksycznego po jej podaniu (wchłonięciu) do organizmu w dawce jednorazowej lub po jednorazowym narażeniu. Toksyczność ostrą określa się ilościowo, wyznaczając LD 50 powodującąśmierć 50% zwierzątużytych w doświadczeniu. Daje odpowiedź na pytania: 1. Jaka jest dawka potrzebna, aby zwierzę padło? 2. Jakie narządy ulegają uszkodzeniu? 3. Czy substancja ma działanie drażniące, czy uczulające? Ocena toksyczności ostrej Według OECD wyróżnia się cztery sposoby badań toksyczności ostrej substancji i wyznaczania LD 50 : 1) metodę klasyczną, 2) metodę ustalonej dawki (FD Fixed Dose Procedure, wytyczne OECD nr 420), 3) metodę klas ostrej toksyczności (ATC Acute Toxic Class Method, wytyczne OECD nr 423), 4) metodę skokową (Up Down Up, wytyczne OECD nr 425). Ocena toksyczności ostrej Dokładne postępowanie w badaniach toksyczności ostrej jest opisane w Załączniku do Rozporządzenia Ministra Zdrowia z 2003 roku, wktórymczytamy badania na zwierzętach przeprowadza się w sposób humanitarny, zgodnie z przepisami dotyczącymi zwierząt laboratoryjnych oraz zgodnie z międzynarodowymi zaleceniami w tej dziedzinie. W przypadku istnienia kilku równoważnych metod badań wybiera się spośród nich tę, która wymaga użycia najmniejszej liczby zwierząt. Podczas badania toksyczności ostrej substancji podanej drogą pokarmową preferuje się stosowanie metody ustalonej dawki lub metody klas ostrej toksyczności. Metoda klasyczna Polega na podawaniu grupie zwierząt składającej się z5 10 samców i takiej samej liczby samic badanej substancji w 3 6 różnych dawkach. Jako graniczny poziom dawkowania przyjmuje się 2000 mg/kg m.c. Wdoświadczeniu wykorzystuje się przynajmniej 3 gatunki zwierząt, zktórychniewięcej niż jedno powinno być gryzoniem i nie więcej niż jedno ptakiem. Substancje podawane są trzema drogami: p.o., i.v., s.c. Podczas eksperymentu systematycznie kontroluje się masę ciała, zauważone zmiany w zachowaniu, wygląd skóry,sierści, oczu. Szczególną uwagę zwraca się na czasy wystąpienia i trwania objawów toksycznych (wymioty, ślinotok, biegunki, senność, drżenie) oraz czas padnięć poszczególnych zwierząt. Eksperyment prowadzi się przez 14 dni. Metoda klasyczna Po zakończeniu doświadczenia uśmierca się także zwierzęta, które przeżyły, w celu wykonania badań makro i mikroskopowych narządów. Uzyskane dane zestawia się wtabele,wktórychumieszczasię liczbę zwierząt napoczątku doświadczenia, liczbę zwierząt wykazujących objawy zatrucia oraz opis objawów toksycznych, liczbę i czas padnięć, wyniki sekcji. Dane powinny być wystarczające do opisania zależności dawka odpowiedź i obliczenia LD 50. 3

4 Metoda ustalonej dawki (podanie drogą pokarmową) Badanie metodą ustalonej dawki składa się z dwóch etapów: wstępnego i właściwego. W badaniu wstępnym bada się skutki różnych dawek (5, 50, 500, 2000 mg/kg m.c.) podawanych kolejno pojedynczym zwierzętom, preferowanym gatunkiem jest szczur. Badanie to dostarcza informacji o zależności objawów toksycznych od zastosowanej dawki i pozwala na oszacowanie minimalnej dawki letalnej. Zazwyczajwbadaniu wstępnymnie przewidujesię użycia więcejniż 5zwierząt. W badaniu właściwym substancję należy podać drogą pokarmową grupie 5 samców i 5 samic w jednej spośród 4 dawek: 5, 50, 500 i 2000 mg/kg m.c. Dawkę powinno się dobrać tak, aby wywołała objawy widocznej toksyczności, ale nie śmierć zwierzęcia. Metoda ustalonej dawki (podanie drogą pokarmową) Po podaniu substancji trzeba dokonywać obserwacji występujących objawów. Obserwacje powinny obejmować zachowanie, zmiany masy ciała, skóry, sierści, oczu, błon śluzowych, jak również układu oddechowego, krążenia i nerwowego. Szczególną uwagę zwraca się na występowanie drgawek, ślinotoku, biegunki, letargu, senności, śpiączki. Jeżeli początkowa dawka wywoła wyraźne objawy toksyczne, ale nie śmierć zwierzęcia, nie ma potrzeby prowadzenia dalszych badań. Jeżeli nie zaobserwowano wyraźnych objawów toksycznych przy danym poziomie dawkowania, przechodzi się do badań z użyciem wyższej dawki substancji, natomiast w razie śmierci zwierząt, substancję bada się,podającwkolejnej,niższej dawce. Ocena i interpretacja wyników w metodzie ustalonej dawki Metoda ustalonej dawki (podanie drogą pokarmową) Taka procedura umożliwia wyznaczenie dawki różnicującej, tj. najwyższej spośród wstępnie ustalonych, którą można podać bez obawy wywołania śmierci zwierząt. W metodzie tej jako parametr końcowy zamiast śmierci zwierząt, przyjmuje się wyniki obserwacji wyraźnych objawów toksycznych. Zarówno u zwierząt, które padną wczasiedoświadczenia, jak i u tych, które przeżyją, należy wykonać sekcję. Po zakończeniu badań sporządza się sprawozdanie, a uzyskane wyniki powinny być przedstawione w formie tabel. Dawka Wyniki Interpretacja [mg/kg m.c.] mniej niż 100% przeżycia substancje, które mogą być bardzo toksyczne 5 100% przeżycia, lecz widoczna toksyczność substancje, które mogą być toksyczne 100% przeżycia, brak widocznej toksyczności należy ocenić wynik po podaniu 50 mg/kg mniej niż 100% przeżycia substancje, które mogą być bardzo toksyczne lub toksyczne; wynik należy ocenić po podaniu 5 mg/kg % przeżycia, lecz widoczna toksyczność substancje, które mogą być szkodliwe 100% przeżycia, brak widocznej toksyczności należy ocenić wynik po podaniu 50 mg/kg mniej niż 100% przeżycia substancje, które mogą być bardzo toksyczne lub toksyczne; wynik należy ocenić po podaniu 50 mg/kg % przeżycia, lecz widoczna toksyczność należy rozważyć, czy substancja nie stwarza ryzyka wystąpienia istotnych objawów ostrego zatrucia 100% przeżycia, brak widocznej toksyczności wynik należy ocenić po podaniu 2000 mg/kg mniej niż 100% przeżycia wynik należy ocenić po podaniu 500 mg/kg % przeżycia, z widoczną lub niewidoczną substancja nie stwarza ryzyka ostrego zatrucia toksycznością Metoda klas ostrej toksyczności (podanie drogą pokarmową) W metodzie tej grupie zwierząt podajesię dożołądkowo substancję w jednej z ustalonych dawek. Dawkę początkową wybiera się spośród trzech ustalonych poziomów, tj. 25, 200 i 2000 mg/kg m.c. Substancję bada się etapowo, wykorzystując na każdym etapie troje zwierząt jednej płci. Występowanie śmiertelności lub jej brak na jednym etapie decyduje o etapie następnym, tzn. o tym, że: nie ma potrzeby dalszego badania, następny etap należy przeprowadzić ztą samą dawką, lecz na zwierzętach innej płci, następny etap należy przeprowadzić na kolejnym wyższym lub niższym poziomie dawkowania. Metoda klas ostrej toksyczności (podanie drogą pokarmową) Kolejne etapy postępowania (stosowanie dawek wyższych lub niższych) zależą od liczby padłych i przeżywających zwierząt przy pierwszej dawce. Na podstawie wyników badań nie wylicza się dokładnie LD 50, a jedynie zakres narażenia, w którym spodziewane są zejścia śmiertelne, ponieważ padnięcia części zwierząt są zasadniczym parametrem ocenianym w tym badaniu. Metoda ostrej toksyczności dostarcza informacji służących zarówno do szacowania zagrożenia, jak i do klasyfikacji, a jej zaletą jest mała liczba zwierząt wykorzystanych w eksperymencie. 4

5 Metoda skokowa Metoda oparta jest na ocenie śmiertelności zwierząt, którym pojedynczo podaje się badaną substancję w 3 dawkach wzrastających lub malejących, w zależności od reakcji po podaniu poprzedniej dawki. Podobną metodę opracowani w 1943r. Deichman i LeBlanc. Po zakończeniu badań laboratoryjnych na zwierzętach i tabelarycznym zestawieniu danych oblicza się LD 50. W celu wyliczenia LD 50 stosuje się metody: Blissa, Finneya, Lichfielda i Wilcoxona, Behrensa, Kraebera, Thompsona, Weila. Wartość LD 50 jest podstawą do klasyfikacji substancji chemicznych. Dla substancji toksycznych gazowych w miejsce LD 50 można ustalić medialne stężenie letalne (LC 50 ) w powietrzu (w Europie wyrażane w mg/m 3 ). Do doświadczeń wykorzystuje się komory inhalacyjne. Prawo Habera Prawo Habera W pewnym zakresie stężeń zgon zwierzęcia można spowodować niższym stężeniem substancji w powietrzu, przedłużając czas ekspozycji. Zjawisko to znane jako prawo Habera określa wzór: E 0 = C. t Dla wywołania efektu letalnego E 0 potrzebne jest osiągnięcie odpowiedniego iloczynu stężenia C i czasu ekspozycji t. Zgon nastąpi, gdy iloczyn ten osiągnie pewną stałą wartość. Prawo Habera spełnione jest tylko dla krótkich odstępów czasu (rzędu godzin). Później wpływają już procesy biotransformacji i wydalania. stężenie C 1 C 2 t 1 t 2 E 0 = C. t czas Stopień toksyczności 1 Klasyfikacja toksyczności trucizn wg Hodge a i Sternera (USA) Nazwa Nadzwyczaj toksyczna LD 50 (g/kg m.c.) droga doustna; szczury LD 50 (g/kg m.c.) droga dermalna; króliki LD 50 (ppm) droga inhalacyjna; szczury Prawdopodobna dawka śmiertelna dla dorosłego człowieka w gramach 0,001 0, ,065 2 Bardzo toksyczna 0,05 0, Średnio toksyczna 0,5 0, Słabo toksyczna 5,0 2, Klasyfikacja działania toksycznego substancji chemicznych po podaniu dożołądkowym, stosowana w krajach UE (Dyrektywa RE 93/32/EWG r.) Metoda klasyczna, metoda klas toksyczności ostrej (dawka p.o. dla szczura) [mg/kg m.c.] Metoda ustalonej dawki (dawka różnicująca) Klasa toksyczności (symbol)* LD50 < 25 < 5 bardzo toksyczna (T+) I 25 < LD50 < toksyczna (T) II 200 < LD50 < lub 500 szkodliwa (Xn) III 2000 < LD ** mało szkodliwa IV * stosowany na opakowaniach i kartach charakterystyki substancji ** substancja nie stwarza ryzyka ostrego zatrucia 5 6 Praktycznie nietoksyczna Stosunkowo nieszkodliwa 15,0 22, >15,0 >22,6 > >1000 5

6 Ocena toksyczności podostrej (test 28 dniowy) W teście tym bada się substancje o spodziewanej małej toksyczności, produkowane w małych ilościach i mające ograniczone przeznaczenie. Badaną substancję podaje się doustnie codziennie w zróżnicowanych dawkach kilku grupom zwierząt, stosując jeden poziom dawkowania na grupę przez 28 dni. Należy testować na przynajmniej 10 zwierzętach (5 samcach i 5 samicach) na każdym etapie dawkowania, zalecanym gatunkiem jest szczur. Powinno się badać przynajmniej 3 grupy narażenia i grupę kontrolną. Przez okres podawania substancji prowadzi się dokładne obserwacje ogólne zwierząt w celu uchwycenia objawów toksycznych. Na zakończenie badania przeprowadza się oznaczania hematologiczne, biochemiczne, makroskopowe i histopatologiczne. Ocena toksyczności podostrej (test 28 dniowy) Zarównozwierzęta, które padną wczasiedoświadczenia, jak ite, które przeżyły, po uśmierceniu poddaje się sekcji. Uzyskane wyniki zbiera się w formie tabeli i poddaje się ocenie statystycznej. Na zakończenie badania sporządza się dokładne sprawozdanie. Specyficznym parametrem kontrolnym w tej metodzie są zmiany neurologiczne. Za pomocą tej metody można wykazać zmiany immunologiczne oraztoksyczność wobec narządówrozrodczych. Ocena toksyczności podprzewlekłej (test 90 dniowy) Badanie to dostarcza informacji o możliwym zagrożeniu dla zdrowia, mogącym być następstwem powtarzanej, przedłużonej ekspozycji obejmującej okres dojrzewania i wzrostu, aż do okresu dojrzałości. Badaną substancję podaje się doustnie codziennie w stopniowanych dawkach kilku grupom zwierząt przez90 dni; jedna dawka dla każdej grupy. Należy testować na przynajmniej 20 zwierzętach (10 samcach i 10 samicach) na każdym etapie dawkowania, zalecanym gatunkiem jest szczur. Powinno się stosować przynajmniej 3 grupy narażenia i grupę kontrolną. Podczas trwania eksperymentu prowadzi się ogólne obserwacje zwierząt, kontroluje się ich masę ciała, zmiany w wyglądzie i zachowaniu. Prowadzi się także systematycznie badania krwi, moczu, a takżewybranychnarządów i tkanek. Na zakończenie badania przeprowadza się oznaczania hematologiczne, biochemiczne oraz histopatologiczne. Ocena toksyczności podprzewlekłej (test 90 dniowy) Ocena toksyczności przewlekłej Zarówno zwierzęta, które padną w czasie doświadczenia, jak i te, które przeżyły, po uśmierceniu poddaje się sekcji. Otrzymane wyniki powinny być zebrane w formie tabeli i poddane ocenie przy użyciu odpowiedniej metody statystycznej, następnie sporządza się sprawozdanie z badań. Test90 dniowy powinien wskazać narządy krytyczne i możliwość kumulacji oraz pozwolić na oszacowanie najwyższej dawki lub poziomu ekspozycji, przy którym nie obserwuje się szkodliwych objawów wynikających z podawania substancji testowanej (NOAEL No Observed Adverse Effect Level). Badanie powinno pozwolić na identyfikację substancji chemicznych mogących wywoływać efekty neurotoksyczne, immunologiczne i reprodukcyjne oraz na uzyskanie informacji na temat wielkości dawek, które powinny być stosowane w następnym etapie badań. Celem tych badań jest poznanie działania toksycznego w wyniku długotrwałej ekspozycji, określenie narządów krytycznych, w których substancja jest kumulowana oraz wstępne określenie ewentualnego działania rakotwórczego badanej substancji. Eksperyment prowadzi się przez przynajmniej 12 miesięcy, awwypadkułącznego badania toksyczności przewlekłej i działania rakotwórczego 2 lata na 3 grupach zwierząt; równocześnie powinna być stosowana grupa kontrolna. Każdej grupie podaje się inną dawkę substancji badanej. Zakres systematycznych obserwacji i badań jest podobny do badań prowadzonych podczas ustalania toksyczności podprzewlekłej. Dzięki ocenie toksyczności przewlekłej można poznać mechanizmy i efekty działania toksycznego oraz określić narządy krytyczne. 6

7 Ocena toksyczności przewlekłej Ocena efektów odległych Te długotrwałe doświadczenia prowadzi się w celu ustalenia stężeń, przy których wielokrotnie narażenie nie wywoływałoby efektów toksycznych. Należytuwyznaczyć: NOAEL (ang. No Observed Adverse Effect Level) najwyższy poziom niewywołujący efektów LOAEL (ang. Lowest Observed Adverse Effect Level) najniższy poziom wywołujący efekty Dzięki nim można wyznaczyć normy: NDS (Najwyższe Dopuszczalne Stężenie) NDSCh (Najwyższe Dopuszczalne Stężenie Chwilowe) NDD (Najwyższa Dopuszczalna Dawka) ADI (ang. Acceptable Daily Intake) dopuszczalne dzienne pobranie z żywnością Efekt odległy efekt toksyczny pojawiający się po pewnym czasie (okresutajenia) od zakończenia narażenia jednorazowego lub wielokrotnego na substancję chemiczną. Efekty takie mogą występować worganizmiebezpośrednio narażonym na czynnik toksyczny lub dopiero w następnych pokoleniach. Czynniki chemiczne mogą uszkadzać materiał genetyczny komórki. W wyniku takiego uszkodzenia komórka replikuje DNA i syntetyzuje białka w sposób odmienny od normalnego dla danego gatunku lub osobnika. Ocena efektów odległych Ocena działania mutagennego nowotwory Działanie genotoksyczne teratogeneza zmiany fenotypu Uszkodzenie możenastępować w komórce somatycznej i wtedy zmiany ujawnią się u tego samego osobnika (nowotwory) lub w komórce aparatu rozrodczego i wtedy zmiany zostaną przekazane potomstwu. Efekty genotoksyczne w okresie embrionalnym i płodowym mogą ujawnić się w postaci zniekształceń anatomicznych (działanie teratogenne). Działanie mutagenne ujawniające się pod wpływem związku chemicznego (zmiany materiału genetycznego mutacje indukowane): mutacje genowe (zmiany sekwencji nukleotydów w genie), mutacje (aberracje) chromosomowe (poprzeczne złamanie chromosomu i ponownepołączenie fragmentów w cyklu komórkowym), uszkodzenia DNA. Ok. 90% związków rakotwórczych wykazuje także działanie mutagenne w prostych testach bakteryjnych, opracowano ponad 100 testów stosowanych do oceny genotoksyczności, które przeprowadza się m.in.: bakteriach, grzybach, roślinach, owadach, ssakach, hodowlach tkankowych in vitro. OECD zaleca w swych Wytycznych 15 testów. Ocena działania rakotwórczego Ocena działania rakotwórczego Działanie rakotwórcze można stwierdzić dwiema metodami: przez ocenę zależności między częstością występowania nowotworów a obecnością substancji rakotwórczej w środowisku (nie do zaakceptowania, ponieważ wyniki uzyskuje się post factum); przez odpowiednie badania laboratoryjne na zwierzętach (wadą tej metody jest długi okres eksperymentów i ich wysokie koszty). Proces przenoszenia w komórce informacji z DNA do białek (przez translację) Substancje nowe należybadaćna 2 gatunkach zwierząt Badania powinny trwać 18 mies. (myszy, chomiki) lub 2 lata (szczury) Należy używać grup zwierząt (wyjściowo po 100 szt. każdej płci), tak aby po 2 latach liczyły oneminimum 25sztuk. Stosuje się 3 poziomy dawkowania (ustalone na podstawie toksyczności podostrej). 7

8 Ocena działania rakotwórczego Ocena działania rakotwórczego Na podstawie danych z badań epidemiologicznych, doświadczalnych i uzupełniających, ocenianą substancję, mieszaninę substancji lub proces technologiczny zalicza się do jednejz niżej podanychgrup czynników: Grupa 1. Czynniki rakotwórcze dla ludzi. Do grupy tej klasyfikowane są czynniki jedynie wtedy, gdy istnieje wystarczający dowód rakotwórczości u ludzi. Grupa 2. Czynniki prawdopodobnie lub przypuszczalnie rakotwórcze dla ludzi. Do grupy tej klasyfikowane są zarówno czynniki, w stosunku do których wykazano prawie wystarczający dowód ich rakotwórczości u ludzi, jak i czynniki, dla których brak jest danych o ich rakotwórczości u ludzi, ale istnieje wystarczający dowód rakotwórczości u zwierząt doświadczalnych. Czynniki te są klasyfikowane do grupy 2A (prawdopodobnie rakotwórcze) lub 2B (przypuszczalnie rakotwórcze). Grupa 3. Czynniki nie dające się sklasyfikować pod względem rakotwórczości u ludzi. W grupie tej umieszcza się te czynniki, których nie można zaliczyć do innej grupy. Grupa 4. Czynniki prawdopodobnie nierakotwórcze dla ludzi. Do grupy tej zalicza się czynniki, w stosunku do których istnieją dowody wskazujące na brak działania rakotwórczego u ludzi i zwierząt doświadczalnych. W niektórych przypadkach mogą być również zaliczone do tej grupy czynniki, dla których istnieje niewystarczający dowód lub brak jakichkolwiek danych o rakotwórczości u ludzi, natomiast istnieje dowód wskazujący na brak działania rakotwórczego u zwierząt doświadczalnych, uzupełniony szerokim zakresem innych odpowiednich danych. Ocena działania teratogennego Ocena działania teratogennego Działanie teratogenne działanie genotoksyczne związku na komórki somatyczne embrionu i płodu prowadzące do zaburzeń w rozwoju różnych narządów o charakterze deformacji makroanatomicznych przy takich dawkach substancji, które nie wywołują jeszcze wyraźnych efektów toksycznych u matki. Upośledzenie umysłowe nie są zaliczane do efektów teratogennych, jeżeli nie towarzyszą im zniekształcenia anatomiczne. Działanie embriotoksyczne obejmuje wszelkie niekorzystne zmiany, jakie związek chemiczny możewywołać uembrionalubpłodu. Schemat rozwoju embrionu Ocena działania teratogennego Wykorzystuje się szczury, myszy, chomiki lub króliki Dobiera się samice młode, ale dojrzałe płciowo Aplikuje się 3 poziomy dawek o dużej rozpiętości, np.: 1/250, 1/50 i 1/5 LD 50 Związek podaje się z karmą, wodą pitną lub za pomocą sondy do żołądka w okresie organogenezy (u myszy i szczurów między 6. a 15. dniem ciąży, u chomika między 6. a 14. dniem, u królika zaś między 6. a 18. dniem). W okresie podawania związku obserwuje się zwierzęta, jak w badaniu ostrym i 28 dniowym. W ostatnim dniu przed porodem płody wyjmuje się przez cesarskie cięcie i ocenia: liczbę płodów, ich płeć, masę ciała, masę płodu z łożyskiem, długość ciemieniowo siedzeniową ciała, długość ogona, zaburzenia rozwojowe (deformacje makroskopowe i deformacje szkieletu). Ocena działania teratogennego Talidomid studium przypadku talidomid enancjomer R (działanie lecznicze) talidomid enancjomer S (silny mutagen) Talidomid (Contergan) lek o działaniu przeciwwymiotnym, przeciwbólowym, usypiającym i hipnotycznym. Został otrzymany przez chemików z Chemie Grünenthal z RFN w Pierwotnie otrzymywano jako racemat mieszaninę zawierającą w równych proporcjach oba enancjomery. Wówczas jeszcze nie wiedziano, że jeden z enancjomerów (o konfiguracji absolutnej R) ma działanie lecznicze, a drugi (S) jest silnym teratogenem działającym na DNA płodu oraz wykazującym działanie hamujące na angiogenezę (tzn. hamuje tworzenie nowych naczyń krwionośnych w kończynach oraz rozwój już istniejących). 8

9 Talidomid studium przypadku Talidomid wykazuje efekty przy dawce ok. 0,5 1,0 mg/kg m.c., spowodował upośledzenie ok. 15 tys. ludzkich płodów, z czego 12 tys. zostało donoszonych i urodziłosię zwadamigenetycznymi (niedorozwójkończyn, zwłaszcza górnych). Talidomid studium przypadku Talidomid przeszedł rutynowe testy na toksyczność na zwierzętach. W żadnym z krajów, gdzie talidomid był rejestrowany, nie było wówczas jeszcze obowiązku wykonywania testów na teratogenność przeprowadzanych na ciężarnych samicach zwierząt. W 1960 Chemie Grünenthal zdecydowało się wejść z tym lekiem na rynek USA i w związku z tym zgłosiło formalny wniosek do FDA o jego rejestrację. Kilka miesięcy zwłoki w rejestracji leku na skutek uporu Frances O. Kelsey uratowało prawdopodobnie życie tysiącom Amerykanów. Talidomid usunięto z listy leków, a jego produkcję wstrzymano na wiele lat. Ustalono, który z enancjomerów ma działanie teratogenne oraz opracowano syntezę asymetryczną Frances Oldham Kelsey i John F. prowadzącą do otrzymania tylko enancjomeru o działaniu Kennedy podczas uroczystości leczniczym. Jednak, w organizmach żywych związek ten ulega wręczenia jej President's Award for Distinguished Federal Civilian stopniowej racemizacji, zatem nawet podanie czystego Service,1962 enancjomeru o działaniu leczniczym nie jest do końca bezpieczne. Cała historia spowodowała, że na całym świecie procedury rejestracji nowych leków zostały drastycznie zaostrzone, aby w przyszłości nigdy nie doszło ponownie do podobnej tragedii. Talidomid studium przypadku Ocena toksycznego wpływu na płodność, rozrodczość i potomstwo Pod koniec lat 90. XX w. dowiedziono, że talidomid wykazuje silne działanie immunosupresyjne (zmniejsza więc ryzyko odrzutu przeszczepów), zapobiega niektórym symptomom zaawansowanego AIDS, a także powstrzymuje rozwój niektórych form raka (zwłaszcza prostaty). Spowodowało to ponowne wpisanie tej substancji na listę leków (wyłącznie czystego enancjomeru leczniczego), którego podawanie osobom niebędącym w ciąży i nieplanującym w przyszłości potomstwa jest obciążone niewielkim ryzykiem. Sprawa ponownego uruchomienia produkcji preparatu, która nastąpiła w 2001, budzi jednak kontrowersje. Mimo tych zastrzeżeń, talidomid jest stosowany w leczeniu szpiczaka mnogiego. W takim zastosowaniu przejawia sporo działań niepożądanych (np. zmęczenie, polineuropatię, wysypki skórne, zaparcia, zwiększone ryzyko żylnej choroby zakrzepowo zatorowej). Oprócz zastosowania w leczeniu nowotworów talidomid bywa także stosowanyw leczeniu trądu, chociaż takie jego używanie w nie jest obecnie zalecane przez WHO. Badania tego typu to doświadczenia wielogeneracyjne. OECD zaleca obecnie testy jedno lub dwupokoleniowe. Badanie wykonuje się na szczurach, przy czym oprócz grupy kontrolnej są jeszcze grupy z 3 poziomami ekspozycji ustalonymi w badaniu toksyczności przewlekłej. Wskład jednej grupy wchodzi 10 samców i 20 samic. Po dwóch miesiącach eksponowania (jeden pełny cykl spermatogenezy, dwa pełne cykle rui) zwierzęta kojarzy się wobrębie grupy (po 2 samice na 1 samca). Badania mają na celu stwierdzenie wpływu ksenobiotyków na czynności gruczołów płciowych, cykl rujowy, kojarzenie, procent zapłodnień, okrestrwania ciąży, poród, masę. Ocena działania neurotoksycznego Jako miarę zaawansowania w rozwoju przyjmowano dawniej stosunek masy mózgu do masy ciała.wskaźnik taki, wyrażony w procentach, wynosi u lwa 0,11 0,14, u psa ok. 0,2, u goryla ok. 0,8, a u człowieka ok. 2,2 2,5. W przypadku myszy jest on jednak jeszcze wyższyiwynosi3,2. Obecnie wskaźnik ten zastąpiono tzw. współczynnikiem cefalizacji (K c ), który jest potęgową funkcją masy ciała: E Kc a m gdzie: E masa mózgu, m masa ciała, a wykładnik potęgowy ustalony na ok. 0,56. Gatunek Współczynnik cefalizacji, K c szczur 0,07 świnia 0,14 kot 0,29 pies 0,29 0,44 nietoperz 0,67 szympans 0,74 delfin 2,25 człowiek 2,8 Im wyższy współczynnik cefalizacji gatunku, tym łatwiejsze jest przenoszenie wynikównaczłowieka, ale tym większe są zastrzeżeniunaturyetycznej. 9

10 Ocena działania neurotoksycznego Efekty neurotoksyczne u ludzi, wywołane zatruciami, przejawiające się zaburzeniami funkcji układu nerwowego, mogą mieć charakter przejściowy i ustąpić pozmniejszeniu stężenia substancji toksycznej w mózgu (efekt narkotyczny). Długotrwałe utrzymywanie w tkance nerwowej stężeń toksycznych lub systematyczne powtarzanie ekspozycji na związki może wywołać głębsze zmiany o charakterze organicznym. Jeżeli zmiany organiczne są wywołane jednorazową ekspozycją znacznego stopnia, pojawiają się one z pewnym opóźnieniem (efekt opóźniony). Zmiany organiczne w tkance nerwowej mogą dotyczyć zarówno o.u.n. (mózg, rdzeń kręgowy) lub jego określonych ośrodków, jak i obwodowego układu nerwowego i układu autonomicznego. Anatomicznie mogą się ujawniać uszkodzenia aksonu (aksjonopatie) oraz mieliny. Zmiany w układzie nerwowym są zwykle trudno odwracalne lub nieodwracalne (jeśli zmiany są poważne). Ocena działania neurotoksycznego Objawy zaburzeń toksycznych w układzie nerwowym: zmiany samopoczucia, zmiany pobudliwości, spadek energii, popędu seksualnego, bóle głowy, bezsenność itp. spadek siłymięśniowej, zaburzeń koncentracji i inteligencji zmiany w układzie sensorycznym (wzroku, słuchu) i ruchowym (ataksja). Ocena działania neurotoksycznego Efekty neurotoksyczne rozpoznane u ludzi, a wywołane niedotlenieniem mózgu (anoksja) są typowe dla zatrucia tlenkiem węgla. Następstwa uszkodzenia osłonki mielinowej występują m.in. przy zatruciu ołowiem (neuropatie obwodowe). Alkohol, akryloamid, disiarczek węgla, estry kwasu fosforowego i fosfonowego uszkadzają aksony (aksonopatie). Uszkodzenia ciała (perykarionu) komórek nerwów obwodowych to efekt działania m.in. organicznych związków rtęci. Silne toksyny naturalne, m.in. botulina, tetrodotoksyna, batrachotoksyna i in. powodują zaburzenia w płytkach ruchowych nerwów motorycznych. Przykładem substancji, której atak jest skierowany na wybrane ośrodki o.u.n., jest metylortęć. Ocena działania neurotoksycznego Metody badawcze stosowane w ocenie neurotoksyczności u zwierząt laboratoryjnych to testy: behawioralne (pomiar spontanicznej aktywności ruchowej (dostarczają informacji o ogólnym stanie zdrowia zwierzęcia), badanie prostych reakcji bezwarunkowych (pozwalają ocenić reaktywność układu nerwowego, ustalić, czy zaburzenia dotyczą sfery ruchowej, czuciowej i określają, jaki rodzaj czucia jest upośledzony) oraz warunkowe reakcje instrumentalne). elektrofizjologiczne (rejestruje się i analizuje zjawiska elektryczne zachodzące w tkankach i narządach. Do oceny stanu czynnościowego nerwów obwodowych stosuje się pomiar szybkości przewodzenia bodźców. Technikę potencjałów wywołanych wykorzystuje się do wykrywania zaburzeń czucia i lokalizowania miejsc uszkodzenia w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym. Najbardziej popularne są badania elektroencefalograficzne). Ocena działania neurotoksycznego Metody obliczeniowe w ocenie toksyczności Efekt - zmiana biologiczna spowodowana działaniem związku toksycznego. morfologiczne (pozwalają wykryć zmiany morfologiczne tkanki nerwowej w odpowiednio przygotowanych preparatach histopatologicznych). biochemiczne (służą głównie do wyjaśnienia mechanizmów działania toksycznego związku na układ nerwowy. Metody te pozwalają na wykorzystanie oznaczeń biochemicznych, histochemicznych i immunochemicznych do dokładnego umiejscowienia skutków działania ksenobiotyku). Kiedy efekt ulega zwiększeniu lub zmniejszeniu ze wzrostem dawki (stężenia biologicznego) danej substancji mówimy o istnieniu zależności typu dawka efekt. Zależność taką ustala się na podstawie pomiarów wielkości efektuuróżnych osobników, którym podano różne dawki substancji (charakter statystyczny). Zależność typu dawka efekt 10

11 Metody obliczeniowe w ocenie toksyczności Efekt możemieć charakter: ilościowy gdy większy lub mniejszy efekt może być wyrażony liczbowo w odniesieniu do zmian mierzonych u jednego osobnika np. działanie methemoglobinotwórcze azotanów jakościowy (efekt kwantalny, zero jedynkowy) (tak/nie) gdy obserwuje się wystąpienie reakcji na ksenobiotyk lub całkowity brak reakcji, bez stanów pośrednich, np. efekt letalny (zwierzę przeżyło lub padło), efekt kancerogenezy (nowotwór powstał lub nie), czasami określa się tak zmiany biochemiczne, ale tylko ogólnie, np. proteinuria wystąpiła lub nie. Natężenie reakcji kwantalnej można badać, jednak nie u jednego osobnika, ale wśród pewnej populacji zwierząt. Natężenie występowania efektu kwantalnego wyraża się jako odsetek osobników, u których zaobserwowano efekt działania określonej dawki toksyny (np. efekt letalny u 30% zwierząt). Tak wyrażoną reakcję populacji nazywa się odpowiedzią. Metody obliczeniowe w ocenie toksyczności Zależność dawka odpowiedź określa odsetek populacji wykazującej reakcję pozytywną wzależności od wielkości dawki (poziomu substancji w ustroju). Typowe zależności dawka odpowiedź mają charakter asymetrycznej litery S. Ten typ krzywej obrazuje efekt kumulatywny: odsetek populacji reagującej na daną dawkę obejmuje sumę odpowiedzi na daną dawkę iwszystkiedawkimniejsze. Krzywa procentu zgonów (typu dawka odpowiedź) wzależności od dawki Krzywa procentu zgonów (typu dawka odpowiedź) wukładzie półlogarytmicznym Metody obliczeniowe w ocenie toksyczności Dawka progowa (dosis minima, DM) graniczna ilość substancji wywołująca pierwsze dostrzegalne zmiany w organizmie. Wyznacza ona próg działania toksycznego danej substancji i jest podstawą do określania wartości najwyższych dopuszczalnych stężeń (NDS) związków chemicznych, czyli stężeń substancji, które nie powinny wywierać żadnego ujemnego wpływu na organizmy żywe przez wiele lat działania. Metody obliczeniowe w ocenie toksyczności Krzywa wrażliwości informuje, jaka dawka jest niezbędna dla wywołania efektu w określonym odsetku populacji, czego nie można zmierzyć bezpośrednio, ponieważ w rzeczywistości przy danej dawce reagować będzie odsetek wrażliwych na tę dawkę zwierząt łącznie z odsetkiem zwierzątwrażliwych na wszystkie dawki niższe. Zależność typu dawka odpowiedź Krzywe dawka odpowiedź dla dwóch substancji otejsamejld 50 ale różnych dawkach progowych Krzywa wrażliwości Symetryczna krzywa wrażliwości w logarytmicznej skali dawek 11