Katarzyna Poniedziałek-Kempny, Iwona Rajska, Izabela Mandryk, Barbara Gajda. Pozaustrojowe uzyskiwanie zarodków świni

Transkrypt

1 1

2 Katarzyna Poniedziałek-Kempny, Iwona Rajska, Izabela Mandryk, Barbara Gajda Pozaustrojowe uzyskiwanie zarodków świni Kraków 2015

3 Instrukcja wdrożeniowa Nr i-1/2015 DYREKTOR INSTYTUTU ZOOTECHNIKI PIB prof. dr hab. Eugeniusz Herbut Opracowano: w Dziale Biotechnologii Rozrodu Zwierząt Kierownik: prof. dr hab. Zdzisław Smorąg Recenzenci: dr Jarosław Wieczorek Opracowanie redakcyjne: mgr Magdalena Bielska Zdjęcie na okładce: abc.news.go.com Skład komputerowy, druk i oprawa: Maria Makarewicz ISBN Drukowano w Zespole Wydawnictw i Poligrafii IZ PIB. 2

4 Niniejsza instrukcja przedstawia stosowane w Dziale Biotechnologii Rozrodu Zwierząt Instytutu Zootechniki Państwowego Instytutu Badawczego techniki zapłodnienia in vitro metodą standardową oraz metodą ICSI oocytów świni. Techniki te są stosowane i optymalizowane w ramach prac badawczych związanych z realizacją tematów statutowych, grantów autorskich oraz Funduszu Badań Własnych IZ PIB, jak również realizowanych prac magisterskich i doktorskich. Autorzy 3

5 Wstęp Rozwój biotechnologii rozrodu świń, a w szczególności transgenezy oraz klonowania, pociąga za sobą potrzebę rozwoju metod, które zapewniają uzyskiwanie dobrej jakości gamet i zarodków tego gatunku. Podstawową technologią jest tutaj pozaustrojowe uzyskiwanie zarodków, które jest cennym alternatywnym dla uzyskiwanych w warunkach in vivo źródłem zarodków. Jest to metoda kompleksowa pozwalająca też w sposób bardziej precyzyjny, niż ma to miejsce w warunkach in vivo, na uzyskiwanie zarodków w ściśle określonym stadium rozwoju. Pozaustrojowe uzyskiwanie zarodków składa się z kilku etapów biologicznych takich jak: dojrzewanie in vitro oocytów, zapłodnienie in vitro oraz hodowla in vitro zarodków. Metody dojrzewania in vitro oocytów oraz hodowla in vitro zarodków świni zostały zaprezentowane w broszurach pt. Dojrzewanie in vitro oocytów świni oraz Hodowla in vitro zarodków ssaków. Niniejsza broszura dotyczy jednego z etapów pozaustrojowego uzyskiwania zarodków świni, tj. zapłodnienia in vitro. Pierwsze udane próby zapłodnienia in vitro u świni przeprowadzili w 1986 roku Cheng i inni. Pozwoliły one na uzyskanie prosięcia po zapłodnieniu oocytów dojrzałych in vivo nasieniem świeżym, ejakulowanym. Kolejną próbą uwieńczoną sukcesem były badania przeprowadzone przez Mattioli i in. (1989) z użyciem do zapłodnienia oocytów dojrzałych in vitro, z których po przeniesieniu uzyskano żywe prosięta. Te osiągnięcia zapoczątkowały intensywne badania zmierzające do opracowania technologii o wysokiej efektywności. Koncentrowały się one na badaniach takich czynników jak: jakość oocytów przeznaczonych do dojrzewania i zapłodnienia czy jakość plemników i ich przygotowanie. Mimo tych wysiłków efektywność pozaustrojowego uzyskiwania zarodków u świń nadal pozostaje na niskim poziomie. Do zapłodnienia in vitro u świń wykorzystuje się nasienie knura ejakulowane (Binh i in., 2009) lub najądrzowe (Kolbe i Holtz, 1999), bezpośrednio po pobraniu ((Kolbe i Holtz, 2000), po konserwacji w stanie płynnym (Kim i in., 1998) lub zamrożonym (Garcia-Rosello i in., 2006). Podejmowane są też próby zapłodnienia nasieniem liofilizowanym (Kang i in., 2014). 4

6 Obecnie stosowane metody zapłodnienia in vitro u świń pozwalają na uzyskanie ok % zapłodnionych oocytów. Jednakże odsetek prawidłowych oocytów zapłodnionych pojedynczym plemnikiem jest znacznie niższy. Wniknięcie do oocytu więcej niż jednego plemnika, czyli zapłodnienie polispermiczne jest jednym z głównych problemów zapłodnienia in vitro u świń. Zjawisko to występuje u ponad 50% zapłodnionych oocytów. Rozwiązaniem problemu polispermii może być wykorzystanie do zapłodnienia techniki docytoplazmatycznej iniekcji plemnika lub główki plemnika lub samego jądra do oocytu, czyli metoda ICSI (ang. Intra Cytoplasmic Sperm Injection). Oprócz ICSI podejmowane są próby stosowania innych technik umożliwiających wprowadzenie plemnika do oocytu takich jak: częściowe nacięcie osłonki przejrzystej oocytu PZD (Partial Zona Dissection), mechaniczne lub chemiczne wykonanie otworu w osłonce przejrzystej ZD (Zona Drilling) oraz iniekcja plemnika pod osłonkę przejrzystą oocytu SUZI (Subzonal Sperm Injection). U świń po raz pierwszy zapłodnienie techniką ICSI przeprowadzili Catt i Rhodes w 1995 roku, ale dopiero późniejsze doświadczenia przeprowadzone przez Kolbe i Holtza (2000) oraz Martina (2000) pozwoliły uzyskać na tej drodze żywe potomstwo. Iniekcję plemnika do oocytu przeprowadza się w mikroskopie odwróconym z wykorzystaniem mikromanipulatorów wyposażonych w pipetę podtrzymującą oraz iniekcyjną. Po dokonaniu iniekcji oocyty poddaje się sztucznej aktywacji i przeznacza do hodowli in vitro. Zaletą metody ICSI może być wykorzystanie jej do zapłodnienia nasieniem o obniżonej koncentracji lub ruchliwości plemników (Kolbe i Holtz, 1999), nasieniem seksowanym (Probst i Rath, 2003), kriokonserwowanym (Lopez-Saucedo i in., 2012) czy też pobranym post mortem (Li i in., 2013). Metoda ICSI jest obecnie rutynowo stosowana w zapłodnieniu pozaustrojowym u ludzi w większości klinik na świecie, również w Polsce. W przypadku zwierząt gospodarskich metoda ta nie znalazła szerszego zastosowania m. in. z powodu niskiej efektywności (Mandryk, 2013). W tej sytuacji uzasadnionym jest zastosowanie tej metody do takich celów jak uzyskiwanie zwierząt transgenicznych poprzez wykorzystanie plemników jako wektorów egzogennego DNA (Perry i in., 1999), ochrona gatunków zagrożonych wyginięciem (Cheng i in., 2012) 5

7 czy też w programach zachowania bioróżnorodności (Lee i Yang, 2004). Niezależnie od celów, w jakich metoda ICSI jest stosowana, badania z jej wykorzystaniem przyczyniły się do poznania fundamentalnych mechanizmów zachodzących w trakcie zapłodnienia i wczesnego rozwoju zarodkowego u ssaków (Yong i in., 2003). W niniejszej broszurze przedstawione zostały metody postępowania w zapłodnieniu in vitro u świń metodą standardową oraz metodą ICSI, które były i nadal są stosowane w pracach badawczych w Dziale Biotechnologii Rozrodu Zwierząt Instytutu Zootechniki Państwowego Instytutu Badawczego. 6

8 Zapłodnienie in vitro u świni metodą standardową Do standardowego zapłodnienia in vitro przeznacza się oocyty dojrzałe, czyli takie, które osiągnęły stadium metafazy II. Zdolność do zapłodnienia muszą posiadać także plemniki. W warunkach in vivo zdolność do zapłodnienia plemniki uzyskują w drogach rodnych samicy, gdzie ulegają kapacytacji. Proces ten można przeprowadzić również w warunkach in vitro. Kapacytacja in vitro plemników polega na ich inkubacji w odpowiedniej pożywce kapacytacyjnej o zbliżonym składzie do płynu jajowodowego. Zawarte w pożywce związki stymulują procesy biochemiczne prowadzące do zmian na powierzchni błon komórkowych plemnika umożliwiające uzyskanie zdolności do zapłodnienia. Pożywki stosowane do zapłodnienia Pożywki przygotowuje się w laboratorium. Po odważeniu odczynników (kat. Sigma) na wadze analitycznej rozpuszcza się je w wodzie destylowanej, dostępnej komercyjnie (kat. Sigma). Pożywki przed zastosowaniem filtruje się przy pomocy filtrów miliporowych 0,22 µl Millex- GS (f. Renner). Bezpośrednio, przed użyciem pożywkę ogrzewa się do temperatury 39 o C i stabilizuje się w inkubatorze CO 2 (w warunkach 5% stężenia CO 2 w atmosferze i maksymalnej wilgotności) a) Pożywka do kapacytacji plemników Kapacytację plemników przeprowadza się w pożywce zmodyfikowanej mm199. Pożywka kapacytacyjna powinna posiadać ph 6,0 6,2. Skład pożywki mm199 do kapacytacji plemników (na 50 ml H 2 0): 1) TCM 199 (M2520) 0,7350 g 2) CaCl 2 0,0162 g 3) Pirogronian sodu g 4) NaHCO 3 0,1000 g 5) Glukoza 0,0275 g 6) HEPES 0,2980 g 7) BSA 0,2000 g 7

9 b) Pożywka do zapłodnienia Standardowe zapłodnienie in vitro przeprowadza się w zmodyfikowanej pożywce mm199 (modified Medium 199, Yang i in. 1999) z dodatkiem kofeiny. Skład pożywki mm199 do zapłodnienia (na 50 ml H 2 O): 1) TCM 199 (M2520) 0,7350 g 2) CaCl 2 0,0162 g 3) Pirogronian sodu g 4) NaHCO 3 0,1000 g 5) Glukoza 0,0275 g 6) HEPES 0,2980 g 7) BSA 0,2000 g 8) Kofeina 0,0975 g Po rozpuszczeniu składników oznacza się ph pożywki za pomocą aparatu do oznaczania ph lub pasków wskaźnikowych. Pożywka powinna mieć wartość ph 7,0 7,2. 1) Postępowanie z oocytami Oocyty świni dojrzałe in vitro przed inkubacją z plemnikami pozbawia się komórek wzgórka jajonośnego metodą enzymatyczną poprzez umieszczenie oocytów w 0,02% roztworze hialuronidazy (0,002 g/ml PBS). Pozostałe komórki oczyszcza się metodą mechaniczną za pomocą specjalnej pipetki. Następnie oocyty umieszcza się we wcześniej przygotowanych kroplach 50 µl pożywki IVF pod olejem mineralnym. Fot. 1. Holder wraz z pipetką do usuwania komórek wzgórka jajonośnego (f. Vitrolife) 8

10 Fot. 2. Oocyt dojrzały z rozproszonym wieńcem komórek wzgórka jajonośnego Fot. 3. Oocyt dojrzały pozbawiony komórek wzgórka jajonośnego z widocznym ciałkiem kierunkowym 9

11 2) Postępowanie z nasieniem 1 ml świeżego nasienia knura (ejakulowanego, rozrzedzonego w jednym z komercyjnych rozrzedzalników) odwirowuje się przez 25 sekund (6000 rpm). Uzyskaną frakcję plemników wiruje się ponownie 2-krotnie w roztworze PBS z dodatkiem 0,001 g/ml BSA (albumina surowicy bydlęcej). Kolejną uzyskaną frakcję plemników rozcieńcza się w pożywce do kapacytacji w celu otrzymania koncentracji plemników 1mln/ml. Następnie plemniki inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze 39 o C i w atmosferze 5% CO 2 w powietrzu. Fot. 4. Wirówka laboratoryjna (f. Eppendorf) Ocena nasienia Nasienie przeznaczone do zapłodnienia poddaje się ocenie pod mikroskopem biologicznym. Ocenia się ruch ogólny, ruch postępowy oraz koncentrację plemników. Ocenę ruchu postępowego oraz koncentrację przeprowadza się w komorach Leja 20 (Leja Products BV) przy użyciu komputerowo wspomaganej analizy SCA (Computer Assisted Sperm System). Koncentrację plemników można także oceniać przy pomocy komory Bürkera. 10

12 Fot. 5. Mikroskop biologiczny do oceny nasienia (f. Nikon) Fot. 6. Komora Bürkera do oceny koncentracji plemników Fot. 7. Komora Leja do oceny plemników przy pomocy programu SCA 11

13 Fot. 8. Ocena nasienia przy pomocy programu komputerowego SCA 3) Inkubacja gamet Do kropli z oocytami dodaje się 50 µl pożywki kapacytacyjnej z plemnikami. Inkubację gamet przeprowadza się w temperaturze 39 o C, atmosferze 5% CO 2 w powietrzu przez 4 godziny. Fot. 9. Inkubacja gamet w kroplach pożywki do zapłodnienia 4) Hodowla in vitro potencjalnych zygot Po inkubacji potencjalne zygoty przepłukuje się 4-krotnie w pożywce do hodowli zarodków NCSU-23 i przekłada się do pożywki NCSU-23 znajdującej się w plastikowych naczynkach 4-oczkowych (f. Nunc). W jednym oczku naczynka umieszcza się zarodków. Hodowlę prowadzi się w temperaturze 39 o C, 5% stężeniu CO 2 w po- 12

14 wietrzu i maksymalnej wilgotności (inkubator CO 2 ). Czas hodowli wynosi 6 8 dni. Co 24 godziny przeprowadza się ocenę zarodków pod mikroskopem stereoskopowym. Szczegółowy opis metody hodowli in vitro zarodków przedstawiono w instrukcji pt. Hodowla in vitro zarodków ssaków. Fot. 10. Inkubator do hodowli oocytów i zarodków (f. Eppendorf) Fot. 11. Blastocysta ekspandująca uzyskana w wyniku zapłodnienia i hodowli in vitro 13

15 Zapłodnienie in vitro u świń metodą ICSI Pożywki Wszystkie manipulacje z oocytami oraz iniekcję plemnika do cytoplazmy oocytu przeprowadza się w zmodyfikowanej pożywce NCSU-37 bez glukozy (IVC-PyrLac-HEPES), uzupełnionej pirogronianem sodu, mleczanem sodu, β-merkaptoetanolem, BSA oraz HEPES. Wartość ph pożywki IVC-PyrLac-HEPES powinna wynosić 7,2. a) Pożywka do manipulacji z oocytami i do iniekcji plemnika (IVC-PyrLac-HEPES) (na 50 ml H 2 O): 1. NaCl 0,3177 g 2. NaHCO 3 0,1053 g 3. KCl 0,0178 g 4. KH 2 PO 4 0,0081 g 5. MgSO 4 7H 2 O 0,0147 g 6. CaCl 2 2H 2 O 0,0125 g 7. D-sorbitol 0,1093 g 8. Penicylina 0,0032 g 9. Streptomycyna 0,0025 g Uzupełnienie do pożywki IVC-PyrLac-HEPES (na 30 ml H 2 O): 1. Pirogronian sodu 0,0006 g 2. Mleczan sodu 0,0092 g 3. β-merkaptoetanol 1,50 µl 4. BSA 0,1200 g 5. HEPES 0,1431 g b) Pożywka do przygotowania plemników (na 10 ml PBS): 1. BSA 0,004 g/ml c) Pożywka do manipulacji z plemnikami (IVC-PyrLac- HEPES-PVP): 1. PVP 0,2 g 2. PBS 4,8 ml Wartość ph pożywki IVC-PyrLac-HEPES-PVP powinna wynosić 7,0. 14

16 d) Roztwór do aktywacji oocytów po iniekcji (na 10 ml H 2 O): 1. D-mannitol 0,0005 g 2. CaCl 2 0,0001 g 3. MgSO 4 0,0001 g 4. BSA 0,01 g 1. Postępowanie z oocytami Podobnie jak w przypadku zapłodnienia metodą standardową, dojrzałe in vitro oocyty oczyszcza się enzymatycznie z komórek wzgórka jajonośnego. Pozbawione komórek oocyty wiruje się w 0,5 ml pożywki IVC-PyrLac-HEPES przez 4 minuty (16000 rpm) celem odsunięcia ciemnych kropel lipidowych na brzeg oocytu. Fot. 12. Dojrzały oocyt świni po odwirowaniu 2. Postępowanie z plemnikami 1 ml nasienia knura wiruje się przez 4 minuty (1000 rpm). Uzyskaną frakcję plemników przemywa się w pożywce PBS-BSA i wiruje 3-krotnie w pożywce IVC-PyrLac-Hepes-PVP. Tak przygotowane plemniki przeznacza się bezpośrednio do iniekcji oocytów. 3. Iniekcja plemnika do cytoplazmy oocytu Iniekcję plemnika do oocytu przeprowadza się w temperaturze 38,5 C, w mikroskopie odwróconym z dołączonymi mikromanipulatorami. 15

17 Fot. 13. Mikroskop odwrócony f. Nikon z dołączonymi mikromanipulatorami W tym celu przygotowuje się sterylną szalkę Petriego z 3 µl kroplą mieszaniny plemników w pożywce IVC-PyrLac-Hepes-PVP oraz 10 µl kroplą pożywki manipulacyjnej IVC-PyrLac-Hepes do której wprowadza się oocyty. Wszystkie krople pokrywa się ogrzanym olejem mineralnym. Fot. 14. Szalka Petriego z dwoma kroplami pożywki IVC-PyrLac-Hepes-PVP Iniekcję plemnika do cytoplazmy oocytu przeprowadza się za pomocą szklanej pipety iniekcyjnej przygotowanej w warunkach laboratoryjnych lub dostępnej komercyjnie. Za pomocą drugiej pipety podtrzymującej unieruchamia się oocyt tak, aby I ciałko kierunkowe było 16

18 widoczne w pozycji godziny 12 lub 6. Takie ułożenie oocytu pozwala na przeprowadzenie iniekcji bez uszkodzenia jego wrzeciona kariokinetycznego. Po wyszukaniu plemnika o prawidłowej budowie morfologicznej, końcem pipety iniekcyjnej unieruchamia się go poprzez złamanie wstawki lub witki i wraz z niewielką ilością pożywki aspiruje od strony witki lub główki do wnętrza pipety. Następnie pipetą iniekcyjną w pozycji godziny 3, w sposób manualny przebija się otoczkę przejrzystą oocytu, aspiruje niewielką ilość cytoplazmy oocytu, uwalniając do wnętrza oocytu zawartość pipety iniekcyjnej (plemnik wraz z pobraną cytoplazmą oraz niewielką objętością pożywki). Fot. 15. Iniekcja plemnika do cytoplazmy dojrzałego oocytu (Martin, 2000) Bezpośrednio po iniekcji usuwa się pipetę iniekcyjną i uwalnia oocyt z pipety podtrzymującej. Ma to na celu zminimalizowanie ciśnienia wewnątrzkomórkowego wywieranego na oocyt. 4. Aktywacja oocytów po iniekcji Po wykonaniu iniekcji oocyty wraz z wprowadzonym plemnikiem poddawane są aktywacji w komorze do elektroporacji, pomiędzy dwoma równoległymi elektrodami i stymulowane impulsem 1,5 kv/cm przez 20 µs. 5. Hodowla in vitro potencjalnych zygot Potencjalne zygoty uzyskane w wyniku zapłodnienia metodą ICSI hoduje się podobnie jak uzyskane po zapłodnieniu metodą standardową. 17

19 Wykaz wyposażenia 1. Aparatura Komora laminarna Mikroskop stereoskopowy, np. Nikon SMZ-10A Mikroskop stereoskopowy, np. Nikon SMZ-1270 Mikroskop odwrócony, np. Nikon z dołączonym mikromanipulatorem Stolik podgrzewany + płytka grzejna jako urządzenie dodatkowe do mikroskopu stereoskopowego (prod. firmy SEMIC) i mikroskopu odwróconego Mikroskop fluorescencyjny (do oceny jakości uzyskanych blastocyst) np. Nikon ECLIPSE E600 Komora do elektroporacji BTX ElectroCell Manipulator 2000 Inkubator CO 2 (z automatyczną regulacją dwutlenkiem węgla) np. MCO-17AIC (f. SANYO) lub Galaxy 48R (f. Eppendorf) Program komputerowy CASA do analizy nasienia Butla z dwutlenkiem węgla Waga laboratoryjna, np. MSA125P-100-DA (f. Sartorius) Lodówka z zamrażarką Autoklaw Wirówka R5430 (f. Eppendorf ) 2. Drobny sprzęt laboratoryjny Pipety automatyczne o poj.: 0,5 10 µl + jednorazowe sterylne końcówki 2 20 µl + jednorazowe sterylne końcówki µl + jednorazowe sterylne końcówki µl + jednorazowe sterylne końcówki µl + jednorazowe sterylne końcówki Statyw do pipet automatycznych Holder Pipeta do usuwania komórek wzgórka jajonośnego (np. f. Vitrolife) 18

20 Końcówki do Holdera np. nr kat , 14302, 14306, (f. Vitrolife) Pipety ICSI np. nr kat , (f. Vitrolife) Pipety holdingowe np. nr kat (f. Vitrolife) 3. Szkło i plastiki laboratoryjne Szkło: Naczynka wagowe + szpatułki Naczynka embriologiczne z wklęsłym dnem wzór użytkowy nr Szkiełka zegarkowe o średnicy 40 mm Szkiełka laboratoryjne podstawowe Szkiełka laboratoryjne nakrywkowe Komora Bürkera Komora Leja Plastiki: Probówki wolnostojące Falcon o poj. 50 ml kat. nr P15-G Probówki stożkowe Falcon o poj. 15 ml kat. nr P15-C Probówki Eppendorf Safe-Lock PCR Clean o poj. 0,5 ml kat. nr Probówki Eppendorf Safe-Lock PCR Clean o poj. 1,5 ml kat. nr Strzykawki jednorazowe o poj. 5, 10 i 20 ml Igły do strzykawek 1,2 x 40 mm Filtry miliporowe 0,22 µl Millex-GS (prod. Renner) Szalka Petriego BD Falcon 100 x 15 mm Szalka Petriego BD Falcon 60 x 15 mm Szalka Petriego BD Falcon 60 x 15 mm IVF Round Dish Naczynka plastikowe 4-oczkowe (prod. Nunc) Zlewki plastikowe o poj. 500 ml 19

21 4. Materiały medyczne Kompresy jałowe z gazy 13-nitkowej o wymiarach 7 x 7 cm Rękawice jałowe Trzonek do skalpela + wymienne ostrza nr 22 Pęsety anatomiczne Nożyczki okulistyczne 5. Płyny i pożywki Płyn do manipulacji z oocytami: Dulbecco s Phosphate Buffered Saline op. 100 ml kat. Sigma nr D4031 Albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V op. 25 g kat. Sigma nr A491 Surowica płodów bydlęcych (FCS) op. 100 ml kat. Sigma nr F7524 Pożywka TCM-199 op. 1 L kat. Sigma nr M2520 HEPES op. 5 g kat. Sigma nr H4034 Płyn pęcherzykowy przygotowany w laboratorium 6. Odczynniki H 2 0 op. 100 ml kat. Sigma nr W3500 NaCl op. 500 g kat. Sigma nr S5886 KCl op. 250 g kat. Sigma nr P5405 CaCl 2 op. 100 g kat. Sigma nr C1016 KH 2 PO 4 op. 100 g kat. Sigma nr P5655 MgSO 4 op. 500 g kat. Sigma nr M2643 NaHCO 3 op. 500 g kat. Sigma nr S5761 Penicylina op. 10 MU kat. Sigma nr P3032 Streptomycyna op. 5 g kat. Sigma nr S1277 Phenol Red op. 5 g kat. Sigma nr P3532 Tauryna op. 25 g kat. Sigma nr T8691 Hipotauryna op. 5 g kat. Sigma nr H1384 Glukoza op. 100 g kat. Sigma nr G8270 α-glutamina op. 25 g kat. Sigma nr G8540 Kofeina op. 5 g kat. Sigma nr C0750 Pirogronian sodu op. 25 g kat. Sigma nr P

22 Hialuronidaza op. 500 mg kat. Sigma nr H3506 Olej mineralny op. 500 ml kat. Sigma nr M8410 D-sorbitol op. 100 g kat. Sigma nr S1876 Mleczan sodu op. 5 g kat. Sigma nr L7022 MgSO 4 7H 2 O op. 25 g kat. Sigma nr CaCl 2 2H 2 O op. 5 g kat. Sigma nr C7902 β-merkaptoetanol op. 5 g kat. Sigma nr M6250 Poliwinylopirolidon op. 100 g kat. Sigma nr PVP 360 Kanamycyna op. 5 g kat. Sigma nr K1377 L-cysteina op. 25 g kat. Sigma nr C N roztwór NaOH przygotowany w laboratorium Dodatkowe wyposażenie: Paski wskaźnikowe ph 6,2-8,2 kat. nr (prod. firmy Avantor Performance Materials Poland) Termos do transportu jajników i nasienia do laboratorium Fot. 12.: : Pozostałe fotografie wykonali: Prof. dr hab. Barbara Gajda Dr inż. Izabela Mandryk Mgr inż. Katarzyna Poniedziałek-Kempny Mgr inż. Iwona Rajska 21

23 Literatura Binh N.T., Van Thuan N., Miyake M. (2009). Effects of liquid preservation of sperm on their ability to activate oocytes and initiate preimplantational development after intracytoplasmic sperm injection in the pig. Theriogenology 71, Catt J.W., Rhodes S.L. (1995). Comparative intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in human and domestic species. Reprod. Fert. Develop., 7: Cheng W.T.K, Polge C., Moor R.M. (1986). In vitro fertilization of pig and sheep. Theriogenology 25, p. 146 (abstract). Cheng W.M., Wu Z.H., Zhang X., Zhu Y.B., Pang Y.W., Guo M., Wang D., Tian J.H. (2012). Effects of different activation regimens on pronuclear formation and developmental competence of in vitro-matured porcine oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Reprod. Domest. Anim., 47: Garcia-Rosello E., Coy P., Vasquez F.A.G., Ruiz S., Matas C. (2006). Analysis of different factors influencing the intracytoplasmic sperm injection (ICSI) yield in pigs. Theriogenology, 66: Kang H.H., Lee J.W., Kang M.J., Kim K.H., Moon S.J. (2014). In vitro development of porcine oocytes following intracytoplasmic sperm injection of freezedried spermatozoa with trehalose. J. Embryo Transfer, 29: Kim N.H., Lee J.W., Jun S.H., Lee H.T., Chung K.S. (1998). Fertilization of porcine oocytes following intracytoplasmic spermatozoon or isolated sperm head injection. Mol. Reprod. Dev., 51: Kolbe T., Holtz W. (1999). Intracytoplasmic injection (ICSI) of in vivo or in vitro matured oocytes with fresh ejaculated or frozen-thawed epididymal spermatozoa and additional calcium-ionophore activation in the pig. Theriogenology, 52: Kolbe T., Holtz W. (2000). Birth of a piglet derived from an oocyte fertilized by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Anim. Reprod. Sci., 64: Lee J.W., Yang X. (2004). Factors affecting fertilization of porcine oocytes following intracytoplasmic injection of sperm. Mol. Reprod. Dev., 68:

24 Li X.X., Lee D.S., Kim K.J., Lee J.H., Kim E.Y., Park J.Y. (2013). Leptin and nonessential amino acids enhance porcine preimplantation embryo development in vitro by intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology, 79: Lopez-Saucedo J., Paramio-Nieto M.T., Fierro R., Pina-Aguilar R.E. (2012). Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in small ruminants. Anim. Reprod. Sci., 133: Mandryk I. (2013). Optymalizacja warunków hodowli zarodków uzyskanych po zapłodnieniu metodą ICSI świeżych i kriokonserwowanych oocytów świni. Praca doktorska, Wyd. IZ PIB. Martin M.J. (2000). Development of in vivo-matured porcine oocytes following intracytoplasmic sperm injection. Biol. Reprod., 63: Mattioli M., Bacci M.L., Galeati G., Seren E. (1989). Developmental competence of pig oocytes matured and fertilized in vitro. Theriogenology, 31: Probst S., Rath D. (2003). Production of piglets using intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with flowcytometrically sorted boar semen and artificially activated oocytes. Theriogenology, 59, Perry A.C., Wakayama T., Kishikawa H., Kasai T., Okabe M., Toyoda Y., Yanagimachi R. (1999). Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection. Science, 284: Rajska I. (2015). Iniekcja plemnika do cytoplazmy (ICSI) jako alternatywa dla standardowego zapłodnienia in vitro u świń. Rocz. Nauk. PTZ, 11: Yang J.G., Chen W.Y., Li P.S. (1999). Effects of glucocorticoids on maturation of pig oocytes and their subsequent fertilizing capacity in vitro. Biol. Reprod., 60: Yong H.Y., Pyo B.S., Hong J.Y., Kang S.K., Lee B.C., Lee E.S., Hwang W.S. (2003). A modified method for ICSI in the pig: injection of head membranedamaged sperm using a 3-4 µm diameter injection pipette. Hum. Reprod., 18:

25 SPIS TREŚCI Wstęp Zapłodnienie in vitro metodą standardową u świni.... Pożywki stosowane do zapłodnienia Postępowanie z oocytami Postępowanie z nasieniem Ocena nasienia Inkubacja gamet Hodowla in vitro potencjalnych zygot... Zapłodnienie in vitro metodą ICSI Pożywki Postępowanie z oocytami Postępowanie z plemnikami Iniekcja plemnika do cytoplazmy oocytu. Aktywacja oocytów po iniekcji Hodowla in vitro potencjalnych zygot... Wykaz wyposażenia Literatura