PL B1. Preparat do rozrzedzalnika nasienia knura i sposób otrzymywania preparatu do rozrzedzalnika nasienia knura

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) Int.Cl. A01N 1/02 ( ) G01N 33/48 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54) Preparat do rozrzedzalnika nasienia knura i sposób otrzymywania preparatu do rozrzedzalnika nasienia knura (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 25/15 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 01/17 (73) Uprawniony z patentu: ZACHODNIOPOMORSKI UNIWERSYTET TECHNOLOGICZNY W SZCZECINIE, Szczecin, PL (72) Twórca(y) wynalazku: MAGDALENA SKÓLMOWSKA, Szczecin, PL MAREK KMIEĆ, Szczecin, PL TADEUSZ OGOŃSKI, Szczecin, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Renata Zawadzka

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest preparat do rozrzedzalnika nasienia knura i sposób otrzymywania preparatu do rozrzedzalnika nasienia knura. Preparat przeznaczony jest do stosowania w rozrzedzalniku do przechowywania nasienia knura w stanie niezamrożonym. Dwa główne czynniki wpływają na funkcjonowanie komórek plemników po ejakulacji nasienia i w trakcie ich przechowywania in vitro: temperatura, w której nasienie jest pobierane i przechowywane po rozcieńczeniu oraz parametry fizykochemiczne rozrzedzalnika. Nasienie knura różni się w kilku aspektach od nasienia innych zwierząt domowych: jest produkowane w dużych ilościach i jest bardzo wrażliwe na udary chłodowe lub nagłe chłodzenie natychmiast po pobraniu. Szybkie schłodzenie plemników z temperatury ciała do temperatury bliskiej temperaturze zamarzania nieodwracalnie zmniejsza zdolności zapładniające plemników. W takich warunkach plemniki tracą integralność błon i ruchliwość z nieodwracalnym obniżeniem metabolizmu, jak również dochodzi do uszkodzenia ich DNA. Szybkie chłodzenie powoduje także uwalnianie enzymów wewnątrzkomórkowych. Aby przedłużyć żywotność plemników w warunkach in vitro niezbędne jest zmniejszenie ich aktywności metabolicznej przy pomocy chemicznych inhibitorów bądź przez obniżenie temperatury. W obu przypadkach konieczne jest rozcieńczenie nasienia. Wymagania dotyczące składu przeznaczonego do tego celu rozrzedzalnika zostały opracowane w latach 90-tych. Wykazano również, że dla uzyskania pozytywnych efektów przechowywania należy poddać kontroli: ph, siłę jonową, rodzaj jonów i ciśnienie osmotyczne medium. Również często dodawane są substancje bakteriostatyczne. W świeżym ejakulacie nasienia knura ph waha się w granicach 7,2 7,5. Poniżej tego ph ruchliwość i metabolizm plemników ulegają stopniowemu zmniejszeniu. Wysokie stężenie glukozy w większości rozcieńczalników nasienia knurów powoduje zmniejszenie wewnątrzkomórkowego ph poniżej 6,0. Ta wewnątrzkomórkowa kwasica pozwala komórkom przetrwać kilka dni przechowywania w temperaturze otoczenia. Aby zapobiec rozwojowi mikroflory w przechowywanym nasieniu, rozcieńczalniki uzupełniane są antybiotykami: gentamycyną, neomycyną, penicyliną, streptomycyną, linkomycyną, spektynomycyną. Nowsze rozcieńczalniki oparte są na obojnaczo-jonowych buforach organicznych, zwłaszcza TES i HEPES, które wychwytują metale ciężkie i kontrolują ph. Do krótkoterminowego przechowywania nasienia knurów, poniżej 3 dni, powszechnie używany jest prosty rozrzedzalnik BTS (Beltsville Thawing Solution), natomiast do przechowywania długoterminowego, od 5 do 7 dni, stosowane są rozrzedzalniki złożone, zawierające między innymi HEPES i BSA, takie jak Androhep Plus czy Bio dil. W publikacji Funahashi H. i Sano T. (2005) Select antioxidants improve the function of extended boar semen stored at 10 C. Theriogenology 63; opisano doświadczenie, w którym do rozrzedzalnika, w którym przechowywano plemniki knura w temperaturze 10 C, przez co najmniej 14 dni, dodawano glutation lub cysteinę o stężeniu 5 mmol/l i stwierdzono poprawę żywotności i integralności funkcjonalnej plemników. Odsetek plemników zdolnych do ruchu postępowego nie różnił się pomiędzy dniem 0 (tuż po pobraniu; 90,8 ± 2,0%) a 21 dniem przechowywania (76,7 ± 4,6%), ale uległ znacznemu obniżeniu w 29 dniu (52,5 ± 6,6%). W badaniu in vitro wykazano, że plemniki przechowywane w obecności cysteiny były zdolne do zapłodnienia nawet po 29 dniach. W publikacji Roca J., Rodriguez M.J., Gil M.A., Carvajal G., Garcia E.M., Cuello C., Vazquez J.M., Martinez E.A. (2005) Survival and in vitro fertility of boar spermatozoa frozen in the presence of Superoxide Dismutase and/or Catalase. Journal of Andrology Vol. 26(1); przedstawiono możliwość zastosowania enzymów antyoksydacyjnych katalazy (CAT) i dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) w celu ograniczenia strat w czasie przechowywania plemników knura. Nasienie było poddawane mrożeniu w ciekłym azocie. Dodanie SOD w ilości 150 i 300 IU/ml do rozrzedzalnika z plemnikami powodowało istotny wzrost całkowitej ruchliwości plemników w porównaniu z grupą kontrolną. Dodanie SOD do rozrzedzalnika podnosiło również odsetek żywotnych plemników z nienaruszonym akrosomem, w próbach po rozmrożeniu. Badania wykazały znacznie niższy poziom reaktywnych form tlenu (RFT) w rozmrożonych plemnikach, które zostały zamrożone z dodatkiem SOD, niż w grupie kontrolnej. Dodanie CAT w ilościach 200 i 400 IU/ml do rozrzedzalnika poddanego zamrażaniu spowodowało istotny wzrost całkowitej ruchliwości plemników i szybkości ruchu postępowego w porównaniu z grupą kontrolną. Dodanie CAT do rozrzedzalnika dało po rozmrożeniu znacznie wyższy odsetek plemników z nienaruszonym akrosomem. Próbki plemników poddawane mrożeniu z dodatkiem CAT wykazywały znacznie niższy poziom RFT po rozmrożeniu w porównaniu z próbą kontrolną. Również, dodanie do rozrzedzalnika mieszaniny SOD i CAT poprawiło odsetek plemników ruchliwych i szybkość ich ruchu postępowego

3 PL B1 3 oraz, po rozmrożeniu, znacznie wyższy odsetek plemników z nienaruszonym akrosomem w porównaniu do próby kontrolnej. Badania wykazywały znacznie niższy poziom RFT w próbach po rozmrożeniu, zawierających SOD i CAT, niż w grupie kontrolnej. Z polskiego opisu patentowego znany jest rozcieńczalnik do nasienia knura zawierający glukozę, cytrynian sodu, EDTA i KCl, który w jednym litrze destylowanej wody zawiera 27,66 g glukozy, 8,16 g cytrynianu sodu, 2,45 g EDTA, 1,23 g NaHCO 3, 1,04 g poliwinylopirolidonu, 0,77 g KCl i 0,20 g gentamycyny. Z opisu patentowego PL znany jest sposób konserwacji nasienia knura, które jest wykorzystywane do badania uszkodzeń chromatyny (DNA) polegający na tym, że dawkę nasienia rozcieńcza się w stosunku 1:1 rozrzedzalnikiem z dodatkiem glicerolu, zaś całość zamyka się w naczyniu mrożeniowym i zamraża. Z polskiego zgłoszenia patentowego P znany jest sposób konserwacji nasienia knura do badań laboratoryjnych polegający na tym, że do próbki nasienia dodaje się glikol propylenowy w ilości co najmniej 1%, miesza się i zamraża. Ze zgłoszenia patentowego RU znane jest podłoże do przechowywania nasienia knurów w stanie ochłodzonym, zawierające glukozę, odwodnioną sól disodową kwasu NNNN-etylenodiamino-tetraoctowego, tripodstawiony pięciowodny cytrynian sodowy, siarczan amonu, węglan sodowy, alkohol etylowy i wodę destylowaną. Preparat do rozrzedzalnika nasienia knura, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że stanowi go kapsułka lipidowo-enzymowa ALEC-LCCD4, w której składniki lipidowe cholesterol (Chol) i lecytyna (Lec) są połączone w stosunku molowym nie mniejszym niż 2:3, a enzymy antyoksydacyjne katalaza (CAT), i dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), są połączone kowalencyjnie, za pomocą aldehydu dekstranu (AD), w stosunku molowym nie mniejszym niż 1:1, na jeden monomer katalazy przypada nie mniej niż 1 monomer dysmutazy ponadtlenkowej. Sposób otrzymywania preparatu do rozrzedzalnika nasienia knura, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że aldehyd dekstranu (AD), otrzymany z dekstranu (D), który utlenia się nadmiarem NaIO 4 w czasie 20 minut, w temperaturze 30 C, miesza się w stosunku molowym 3:20 z katalazą (CAT), rozpuszczoną w 30 mmol/l buforze węglanowym o ph 9,0 i inkubuje 24 godziny w temperaturze 4 C. Zmodyfikowaną kowalencyjnie katalazę CAT-AD miesza się w stosunku molowym 1:4 z dysmutazą ponadtlenkową (SOD) rozpuszczoną w buforze węglanowym o stężeniu 30 mmol/l i ph 9,0 i pozostawia do inkubacji na 24 godziny w temperaturze 4 C. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się NaBH 4 o stężeniu 1 g/l, pozostawia na 24 godziny, po czym dializuje wobec wody destylowanej przez 16 godzin. Otrzymany koniugat katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej (CAT-AD-SOD) zamyka się w liposomy lecytynowo-cholesterolowe (Lec/Chol), w których stosunek molowy cholesterolu do lecytyny wynosi co najmniej 2:3, otrzymując preparat lipidowo-enzymowy (ALEC-LCCD4) w postaci kapsułki. Koniugat CAT-AD-SOD zamyka się w liposomy lecytynowo-cholesterolowe poddając hydratacji suchy film lipidowy, który 6-krotnie zamraża się i rozmraża w temperaturach 196 C i +40 C i kalibruje przy pomocy ekstrudera ręcznego z membranowym filtrem poliwęglanowym o średnicy porów 400 nm. Otrzymany preparat oczyszcza się na kolumnie wypełnionej Sephadex em G50 zrównoważonej buforem fosforanowym o stężeniu 50 mmol/l i ph 7,4, w temperaturze pokojowej. Antyoksydacyjna kapsułka lipidowo-enzymowa ALEC/LCCD4 według wynalazku może być stosowana z każdym rodzajem rozrzedzalnika do przechowywania nasienia knura dostępnym na rynku. Wzbogacenie standardowo stosowanego rozrzedzalnika liposomami z koniugatem katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej (CAT-AD-SOD) zabezpiecza plemniki przed szkodliwym działaniem reaktywnych form tlenu (RFT). Zastosowanie preparatu umożliwia przechowywanie nasienia przez 12 dni zabezpieczając plemniki przed uszkodzeniem ich aparatu ruchu, nie ograniczając jednocześnie aktywności enzymów mitochondrialnego systemu transportu elektronów. Rozwiązanie według wynalazku przedstawione jest na przykładach wykonania. P r z y k ł a d 1 Przygotowano aldehyd dekstranu (AD) w ten sposób, że 5 ml dekstranu (D) o stężeniu 0,3 mmol/l utleniano przy pomocy NaIO 4 o stężeniu 0,1 mol/l (0,107 g w 5 ml) w czasie 20 minut w temperaturze 30 C, po czym, w celu usunięcia nadmiaru NaIO 4, dodano 0,279 ml glikolu etylenowego o stężeniu 1 mol/l i inkubowano 20 minut w temperaturze 30 C. Otrzymany AD, w ilości 0,050 ml 15 mol/l, mieszano z 1 ml 5 mol/l katalazy rozpuszczonej w 30 mmol/l buforze węglanowym o ph 9,0 i inkubowano 24 godziny w temperaturze 4 C. Po zakończeniu inkubacji roztwór reakcyjny, zawierający 1 ml CAT-AD o stężeniu 5 mol/l, mieszano z 0,350 ml SOD o stężeniu 57,9 mol/l rozpuszczonej w buforze węglanowym o stężeniu 30 mmol/l i ph 9,0 i pozostawiano do inkubacji na 24 godziny w temperaturze 4 C. Następnie, do mieszaniny

4 4 PL B1 reakcyjnej dodawano NaBH 4 o stężeniu 1 mg/ml, pozostawiano na 24 godziny, po czym dializowano wobec wody destylowanej przez 16 godzin. Otrzymany koniugat CAT-AD-SOD oczyszczano w temperaturze pokojowej na sicie molekularnym (Sephacryl HR300, bufor fosforanowy o stężeniu 50 mmol/l, ph 7,4) i zamykano w liposomy lecytynowo-cholesterolowe przy stosunku Lec/Chol wynoszącym 6:4, mol/mol. Otrzymany preparat enzymowy oczyszczano na sicie molekularnym (Sephadex G50, bufor fosforanowy o stężeniu 50 mmol/l, ph 7,4). Skład koniugatów określano na podstawie ich masy molekularnej w oparciu o algorytm umożliwiający badanie krzywych elucji z uwzględnieniem współczynników kalibracji kolumny. Liposomy otrzymywano z lecytyny i cholesterolu, zmieszanych w stosunku molowym 3:2, w wyniku hydratacji suchego filmu lipidowego poddawanego 6-krotnemu procesowi zamrażania i rozmrażania w temperaturach 196 C i +40 C i kalibracji przy pomocy ekstrudera ręcznego z membranowym filtrem poliwęglanowym o średnicy porów 400 nm. Preparat oczyszczano metodą sączenia molekularnego i stosowano jako dodatek do rozrzedzalnika nasienia knura przechowywanego w stanie niezamrożonym w ilości, która odpowiadała aktywnościom enzymatycznym katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej wynoszącym 200/150 U CAT /U SOD na 1 ml nasienia zawieszonego w rozrzedzalniku. Do badań używano rozrzedzalnika Bio'dil (Francja). P r z y k ł a d 2 Przygotowano aldehyd dekstranu (AD) w ten sposób, że 13 ml dekstranu (D) o stężeniu 0,3 mmol/l utleniano przy pomocy NaIO 4 o stężeniu 0,1 mol/l (0,278 g w 13 ml) w czasie 20 minut w temperaturze 30 C, po czym, w celu usunięcia nadmiaru NaIO 4, dodawano 0,725 ml glikolu etylenowego o stężeniu 1 mol/l i inkubowano 20 minut w temperaturze 30 C. Otrzymany AD, w ilości 0,130 ml 15 mol/l, mieszano z 2,6 ml 5 mol/l katalazy rozpuszczonej w 30 mmol/l buforze węglanowym o ph 9,0 i inkubowano 24 godziny w temperaturze 4 C. Po zakończeniu inkubacji roztwór reakcyjny, zawierający 2,6 ml CAT-AD o stężeniu 5 mol/l, mieszano z 0,91 ml SOD o stężeniu 57,9 mol/l rozpuszczonej w buforze węglanowym o stężeniu 30 mmol/l i ph 9,0 i pozostawiano do inkubacji na 24 godziny w temperaturze 4 C. Następnie, do mieszaniny reakcyjnej dodawano NaBH 4 o stężeniu 1 mg/ml, pozostawiano na 24 godziny, po czym dializowano wobec wody destylowanej przez 16 godzin. Otrzymany koniugat CAT-AD-SOD oczyszczano w temperaturze pokojowej na sicie molekularnym (Sephacryl HR300, bufor fosforanowy o stężeniu 50 mmol/l, ph 7,4) i zamykano w liposomy lecytynowo-cholesterolowe przy stosunku Lec/Chol wynoszącym 6:4, mol/mol. Otrzymany preparat enzymatyczny oczyszczano na sicie molekularnym (Sephadex G50, bufor fosforanowy o stężeniu 50 mmol/l, ph 7,4). Skład koniugatów określano na podstawie ich masy molekularnej w oparciu o algorytm umożliwiający badanie krzywych elucji z uwzględnieniem współczynnika kalibracji kolumny. Liposomy otrzymywano z lecytyny i cholesterolu, zmieszanych w stosunku molowym 3:2, w wyniku hydratacji suchego filmu lipidowego poddawanego 6-krotnemu procesowi zamrażania i rozmrażania w temperaturach 196 C i +40 C i kalibracji przy pomocy ekstrudera ręcznego z membranowym filtrem poliwęglanowym o średnicy porów 400 nm. Preparat oczyszczano metodą sączenia molekularnego i stosowano jako dodatek do rozrzedzalnika nasienia knura przechowywanego w stanie niezamrożonym w ilości, która odpowiadała aktywnościom enzymatycznym katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej wynoszącym 200/150 U CAT /U SOD na 1 ml nasienia zawieszonego w rozrzedzalniku. Do badań używano rozrzedzalnika Bio'dil (Francja). Zastrzeżenia patentowe 1. Preparat do rozrzedzalnika nasienia knura, znamienny tym, że stanowi go kapsułka lipidowo-enzymowa ALEC-LCCD4, w której składniki lipidowe cholesterol i lecytyna są połączone w stosunku molowym nie mniejszym niż 2:3, a enzymy antyoksydacyjne katalaza, i dysmutaza ponadtlenkowa są połączone kowalencyjnie, za pomocą aldehydu dekstranu w stosunku molowym nie mniejszym niż 1:1, z zachowaniem aktywności katalitycznych. 2. Sposób otrzymywania preparatu do rozrzedzalnika nasienia knura, znamienny tym, że aldehyd dekstranu (AD), otrzymany z dekstranu (D), który utlenia się nadmiarem NaIO 4 w czasie 20 minut, w temperaturze 30 C, miesza się w stosunku molowym 3:20 z katalazą, CAT, rozpuszczoną w 30 mmol/l buforze węglanowym o ph 9,0 i inkubuje 24 godziny w temperaturze 4 C, po czym zmodyfikowaną kowalencyjnie katalazę CAT-AD miesza się w stosunku molowym 1:4 z dysmutazą ponad-

5 PL B1 5 tlenkową (SOD) rozpuszczoną w buforze węglanowym o stężeniu 30 mmol/l i ph 9,0 i pozostawia do inkubacji na 24 godziny w temperaturze 4 C, następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się NaBH 4 o stężeniu 1 g/l, pozostawia na 24 godziny, po czym dializuje wobec wody destylowanej przez 16 godzin, a otrzymany koniugat CAT-AD-SOD zamyka się w liposomy lecytynowo-cholesterolowe (Lec/Chol), otrzymując preparat lipidowo-enzymowy ALEC-LCCD4 w postaci kapsułki. 3. Sposób otrzymywania według zastrz. 2, znamienny tym, że koniugat CAT-AD-SOD zamyka się w liposomy lecytynowo-cholesterolowe, Lec/Chol, w których stosunek cholesterolu do lecytyny jest nie mniejszy niż 2:3, poddając hydratacji suchy film lipidowy, który 6-krotnie zamraża się i rozmraża w temperaturach 196 C i +40 C i kalibruje przy pomocy ekstrudera ręcznego z membranowym filtrem poliwęglanowym o średnicy porów 400 nm i oczyszcza metodą sączenia molekularnego. 4. Sposób otrzymywania według zastrz. 2, znamienny tym, że otrzymany preparat oczyszcza się na kolumnie wypełnionej Sephadex em G50 i zrównoważonej buforem fosforanowym o stężeniu 50 mmol/l i ph 7,4 w temperaturze pokojowej.

6 6 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)