Nr 3(48) Kraków Rok 13

Transkrypt

1 Nr 3(48) Kraków 2006 Rok 13

2 Redaktor naczelny: prof. dr hab. Tadeusz Sikora; tel./fax 012/ Sekretarz redakcji: dr Ewa Ślawska; tel. 012/ ; ; Redaktorzy: prof. dr hab. Bohdan Achremowicz, prof dr hab. Włodzimierz Grajek, prof dr hab. Danuta Kolożyn-Krajewska, prof. dr hab. Bogusław Król, prof. dr hab. Krzysztof Krygier, prof. dr hab. Mieczysław Pałasiński, dr Teresa Woźniakiewicz prof. dr hab. Stefan Ziajka Stali współpracownicy: prof. dr hab. Teresa Fortuna (Kraków), prof. dr hab. Jacek Kijowski (Poznań), dr Grażyna Morkis (Warszawa), dr hab. inż. Stanisław Popek (Kraków), prof. dr hab. Maria Soral-Śmietana (Olsztyn) RADA PROGRAMOWA: prof. dr Antoni Rutkowski (przewodniczący), dr hab. Kazimierz Dąbrowski (sekretarz), prof. dr hab. Barbara Baraniak, prof. dr hab. Nina Baryłko-Pikielna, prof. dr hab. Józefa Chrzanowska, prof. dr hab. Janusz Czapski, prof. dr hab. Zbigniew Czarnecki, prof. dr hab. Mirosław Fik, prof. dr hab. Józef Fornal, prof. dr hab. Roman A. Grzybowski, prof. dr hab. Jan Iciek, prof. dr hab. Edward Kołakowski, prof. dr hab. Henryk Kostyra, prof. dr hab. Andrzej Lenart, prof. dr hab. Paweł M. Pisulewski, prof. dr hab. Piotr Przybyłowski, prof. dr hab. Zdzisław E. Sikorski, prof. dr hab. Stanisław Tyszkiewicz KONSULTANCI NAUKOWI: prof. dr hab. Zbigniew Duda, prof. dr hab. Jan Kisza, prof. dr hab. Helena Oberman RADA KONSULTACYJNA: prof. dr Henryk Daun (USA), prof. dr Jerzy Jankun (USA), prof. dr Józef Korolczuk (Francja), prof. dr Marian Naczk (Kanada), prof. dr Jan Pokorny (Czechy), prof. dr Roman Przybylski (Kanada), dr Andrzej Sośnicki (USA), dr Leszek Stepaniak (Norwegia), dr Alina Surmacka-Szcześniak (USA), dr John Wojciak (Kanada) WYDAWCA: POLSKIE TOWARZYSTWO TECHNOLOGÓW ŻYWNOŚCI WYDAWNICTWO NAUKOWE PTTŻ W latach wydawcą kwartalnika był Oddział Małopolski PTTŻ Copyright by Polskie Towarzystwo Technologów Żywności, Kraków 2006 Printed in Poland Wydawanie publikacji dofinansowane przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego ADRES REDAKCJI: KRAKÓW, AL. 29 LISTOPADA 46 SKŁAD I DRUK: ISSN ISBN X Wydawnictwo Naukowe Akapit, Kraków tel./fax (012) ; wn@akapit.krakow.pl Nakład: 750 egz.

3 ŻYWNOŚĆ Organ naukowy PTTŻ kwartalnik Nr 3 (48) Kraków 2006 Rok 13 SPIS TREŚCI Od Redakcji... 3 SYLWIA BONIN: Zastosowanie mikroorganizmów immobilizowanych w winiarstwie... 5 MIROSŁAW M. MICHALSKI: Biotoksyny morskie występowanie i metody analizy MARIAN REMISZEWSKI, MAŁGORZATA KULCZAK, MARIA JEŻEWSKA, EUGENIUSZ KORBAS, DANUTA CZAJKOWSKA: Wpływ procesu dekontaminacji z zastosowaniem pary wodnej na jakość wybranych przypraw AGNIESZKA ZEMBOLD, JÓZEF BŁAŻEWICZ: Ziarno jęczmienia nagiego i oplewionego jako surowiec niesłodowany w piwowarstwie RENATA BIEŻANOWSKA-KOPEĆ, PAWEŁ M. PISULEWSKI: Wpływ procesów termicznych i biologicznych na pojemność przeciwutleniającą nasion fasoli (Phaseolus vulgaris L.) PIOTR GĘBCZYŃSKI: Porównanie jakości mrożonek z selera otrzymanych sposobem tradycyjnym i zmodyfikowanym...65 JARMILA LEHKOŽIVOVÁ, JOLANA KAROVIČOVÁ, ZLATICA KOHAJDOVÁ, MILAN SUHAJ, IVANA ŠIMONOVÁ: Izotachoforetyczne oznaczanie sztucznych środków słodzących oraz ocena zmian intensywności smaku słodkiego w napojach bezalkoholowych LESZEK GAJOWIECKI, MAREK KOTOWICZ, KAZIMIERZ LACHOWICZ, WALDEMAR DĄBROWSKI, ANNA KORONKIEWICZ, JOANNA ŻOCHOWSKA-KUJAWSKA, MAŁGORZATA SOBCZAK, ARKADIUSZ ŻYCH: Zastosowanie mleczanów do produkcji wyrobów drobiowych niezawierających dodatku azotanu(iii) sodu KRZYSZTOF KWIATEK, RAFAŁ ZASADNY: Ocena pożywek stosowanych w wykrywaniu obecności oraz oznaczaniu liczby Campylobacter spp. w mięsie drobiowym TADEUSZ TRZISZKA, MAREK NOWAK, MAŁGORZATA KAŹMIERSKA: Preferencje konsumentów jaj na rynku wrocławskim WIESŁAW ŁUKASIŃSKI: Rynek mleka i jego przetworów w Polsce w latach GRAŻYNA MORKIS: Stopień wdrożenia GHP, GMP i HACCP w przemyśle spożywczym GRAŻYNA MORKIS, WIOLETTA KARAŚ: Problematyka żywnościowa w ustawodawstwie polskim i unijnym HENRYK KOSTYRA, ELŻBIETA KOSTYRA, DAGMARA MIERZEJEWSKA: Współczesny leksykon wiedzy o żywności STANISŁAW POPEK: Nowe książki ZBIGNIEW DUDA: Recenzja książki: Zwierzęta rzeźne i mięso ocena i higiena Technolog Żywności Zamieszczone artykuły są recenzowane Czasopismo jest referowane przez: AGRO-LIBREX, Chemical Abstracts Service i IFIS

4 FOOD The Scientific Organ of Polish Food Technologists Society (PTTŻ) quarterly No 3 (48) Kraków 2006 Vol. 13 CONTENTS From the Editor... 3 SYLWIA BONIN: Application of immobilized microorganisms in wine-making... 5 MIROSŁAW M. MICHALSKI: Marine biotoxins - occurence and method of analysis MARIAN REMISZEWSKI, MAŁGORZATA KULCZAK, MARIA JEŻEWSKA, EUGENIUSZ KORBAS, DANUTA CZAJKOWSKA: Effect of decontamination with the use of steam on the quality of selected spices AGNIESZKA ZEMBOLD, JÓZEF BŁAŻEWICZ: The grain of naked and hulled barley as an unmalted raw material in brewing industry RENATA BIEŻANOWSKA-KOPEĆ, PAWEŁ M. PISULEWSKI: The effect of thermal and biological processing on antioxidant activity of common bean seeds (Phaseolus vulgaris L.) PIOTR GĘBCZYŃSKI: Comparison of quality of frozen celeriac produced using traditional and modified methods JARMILA LEHKOŽIVOVÁ, JOLANA KAROVIČOVÁ, ZLATICA KOHAJDOVÁ, MILAN SUHAJ, IVANA ŠIMONOVÁ: Isotachophoretic analysis of the artificial sweeteners and time-intensity sweetness evaluation of soft drinks...76 LESZEK GAJOWIECKI, MAREK KOTOWICZ, KAZIMIERZ LACHOWICZ, WALDEMAR DĄBROWSKI, ANNA KORONKIEWICZ, JOANNA ŻOCHOWSKA-KUJAWSKA, MAŁGORZATA SOBCZAK, ARKADIUSZ ŻYCH: Use of lactates in processing of poultry meat products without sodium nitrate (III) addition KRZYSZTOF KWIATEK, RAFAŁ ZASADNY: Evaluation of medium used for detection and enumeration of Campylobacter spp. in poultry meat TADEUSZ TRZISZKA, MAREK NOWAK, MAŁGORZATA KAŹMIERSKA: Egg consumers preferences in the market of Wrocław WIESŁAW ŁUKASIŃSKI: The milk market and its products in Poland in GRAŻYNA MORKIS: The level of GHP, GMP and HACCP system implementation in food industry GRAŻYNA MORKIS, WIOLETTA KARAŚ: Food Problems in Polish and EU Legislation HENRYK KOSTYRA, ELŻBIETA KOSTYRA, DAGMARA MIERZEJEWSKA: Food Science Lexicon Contemporary Terms STANISŁAW POPEK: Book Reviews ZBIGNIEW DUDA: REVIEW OF THE BOOK: Slaughter animals and meet - hygiene and evaluation The Food Technologist Only reviewed papers are published Covered by: AGRO-LIBREX and Chemical Abstracts Service and IFIS

5 OD REDAKCJI Szanowni Państwo, przekazujemy do rąk naszych Czytelników 3 (48) numer kwartalnika Żywność, w którym publikujemy kilkanaście interesujących artykułów naukowych. Od bieżącego numeru rozszerzamy przegląd polskiego prawa żywnościowego o unijne akty prawne. Zawartość czasopisma wzbogaca materiał informacyjny dotyczący działalności Polskiego Towarzystwa Technologów Żywności. Wobec napływających nadal do Redakcji pytań naszych Autorów ponawiamy wyjaśnienie, że kwartalnik Żywność znajduje się na liście czasopism punktowanych Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego. Według informacji zawartych na stronie opublikowanie artykułu naukowego na naszych łamach upoważnia do przyznania 4 punktów. Szczegółowe dane adresowe, które mogą pomóc Państwu w odszukaniu informacji związanych z punktacją czasopism naukowych zamieszczamy w Technologu Żywności, także w bieżącym numerze kwartalnika. Ponownie informujemy, że Polskie Towarzystwo Technologów Żywności jest organizacją pożytku publicznego, co umożliwia osobom prywatnym przekazanie 1% należnego podatku dochodowego za dany rok rozliczeniowy na rzecz naszego stowarzyszenia. Zachęcamy Państwa do wspierania działalności Towarzystwa i uprzejmie prosimy o wpłaty odpisu podatkowego za rok 2006 na konto PTTŻ nr: Adres: Polskie Towarzystwo Technologów Żywności, ul. Nowoursynowska 166, Warszawa. Kraków, wrzesień 2006 r. Redaktor Naczelny Tadeusz Sikora

6 KOMUNIKAT WETERYNARIA 2006 O LECZNICTWIE I BEZPIECZEŃSTWIE ŻYWNOŚCI Targi Lecznictwa Weterynaryjnego i Nadzoru nad Bezpieczeństwem Żywności Weterynaria 2006 odbędą się 30 listopada-2 grudnia 2006 w Pałacu Kultury i Nauki w Warszawie. Patronat nad imprezą objęła Krajowa Izba Lekarsko-Weterynaryjna zrzeszająca wszystkich lekarzy weterynarii w Polsce. Projekt powstaje przy współpracy merytorycznej Polskiego Towarzystwa Technologów Żywności oraz Stowarzyszenia Producentów i Importerów Leków Weterynaryjnych POLPROWET. Imprezę przygotowują Międzynarodowe Targi Polska. Ideą targów jest stworzenie platformy łączącej cele biznesowe z prezentacją i popularyzacją najnowszych osiągnięć nauki obejmujących weterynarię i bezpieczeństwo żywności. Podczas imprezy zostanie zaprezentowana bogata oferta rynkowa: producentów i dystrybutorów leków oraz sprzętu medycznego, laboratoriów weterynaryjnych oraz firm oferujących akcesoria i aparaturę analityczną, a także wyposażających gabinety weterynaryjne. Wystawcy promować będą także: urządzenia kontrolne oraz aparaturę pomiarowo-kontrolną dla przemysłu spożywczego. Będzie można także zapoznać się z propozycjami: producentów i dystrybutorów środków dezynfekcyjnych oraz używanych do deratyzacji i dezynsekcji, a także firm oferujących odzież, obuwie oraz akcesoria medyczne. Ponadto zaprezentują się: przedsiębiorstwa projektowe i wykonawcze obiektów dla weterynarii, firmy produkujące i dystrybuujące karmę, odżywki, pasze oraz premiksy, a także firmy consultingowe. Swoje propozycje wystawcy przedstawią: właścicielom oraz pracownikom gabinetów i klinik weterynaryjnych, reprezentantom samorządowych służb nadzoru weterynaryjnego oraz wojewódzkim i powiatowym lekarzom weterynarii, przedstawicielom laboratoriów i zakładów higieny weterynaryjnej. Do odwiedzenia targów zostaną także zaproszeni: producenci i technolodzy żywności, pracownicy działów kontroli jakości w zakładach produkcji żywności, a także kadra naukowa szkół wyższych oraz studenci działów weterynaryjnych i technologii żywności. Targom będą towarzyszyć interesujące merytorycznie seminaria i wykłady, które poprowadzą wybitni specjaliści. Pierwszy dzień zostanie poświęcony higienie i bezpieczeństwu żywności. Drugiego dnia tematyka dotyczyć będzie dużych zwierząt. Trzeciego dnia z kolei zostaną omówione niektóre choroby psów i kotów. Szczegółowe informacje na temat Targów Weterynaria 2006 oraz imprez towarzyszących znajdują się w serwisie:

7 ŻYWNOŚĆ 3(48), 2006 SYLWIA BONIN ZASTOSOWANIE MIKROORGANIZMÓW IMMOBILIZOWANYCH W WINIARSTWIE S t r e s z c z e n i e Zastosowanie komórek immobilizowanych w fermentacji alkoholowej jest korzystne ze względów technologicznych i ekonomicznych, w porównaniu z klasycznymi technologiami z komórkami wolnymi. W porównaniu z produkcją alkoholu przeznaczonego do celów chemicznych i opałowych, w winiarstwie ważne jest, aby nośniki były bezpieczne, odporne na alkohol i nie powodowały zmian jakości produktu, a końcowa zawartość alkoholu wynosiła co najmniej 11,5% obj. W artykule przedstawiono zagadnienia dotyczące zastosowania immobilizacji w winiarstwie, gdzie mikroorganizmy unieruchomione wykorzystywane są: w ciągłej oraz okresowej, powtarzanej produkcji wina, we wtórnej fermentacji (szampanizacji), kontrolowanej fermentacji jabłkowo-mlekowej i jabłkowo-alkoholowej oraz w celu poprawy jakości sensorycznej gotowych produktów. Słowa kluczowe: immobilizacja, produkcja wina, enologia, technologie fermentacji Wprowadzenie W fermentacji alkoholowej zastosowanie immobilizacji ma miejsce głównie w produkcji etanolu konsumpcyjnego, chemicznego i opałowego oraz w browarnictwie w przyspieszonym dojrzewaniu piwa i produkcji piwa bezalkoholowego. Są to prace zarówno w skali laboratoryjnej, a coraz częściej, także przemysłowej. W winiarstwie immobilizacja znalazła zastosowanie w ciągłej oraz okresowej, powtarzanej produkcji wina, we wtórnej fermentacji (szampanizacji), kontrolowanej fermentacji jabłkowomlekowej i jabłkowo-alkoholowej oraz w celu poprawy jakości sensorycznej gotowych produktów. Jednak w skali przemysłowej drożdże immobilizowane wykorzystywane są jedynie w szampanizacji [13, 18]. Dr S. Bonin, Katedra Biotechnologii, Mikrobiologii i Oceny Żywności, Wydz. Technologii Żywności, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, ul. Nowoursynowska 159C, Warszawa

8 6 Sylwia Bonin Zalety immobilizacji Prowadzenie procesów z komórkami immobilizowanymi wiąże się z technologicznymi i ekonomicznymi korzyściami w porównaniu z tradycyjnymi procesami wykorzystującymi komórki wolne. Do korzyści tych można zaliczyć [18]: wydłużenie aktywności i stabilności biokatalizatora, ponieważ nośnik może działać ochronnie w przypadku zmian ph, temperatury i składu podłoża, zwiększenie gęstości komórek w przeliczeniu na jednostkę objętości fermentora, co prowadzi do wyższej produktywności, skrócenia czasu fermentacji oraz eliminacji fazy namnażania się komórek, lepsze wykorzystanie substratu, w związku z czym proces przebiega z wyższą wydajnością, możliwość prowadzenia procesów ciągłych, ograniczenie występowanie zakażeń mikrobiologicznych, obniżenie pracochłonności i kosztów procesu, ponieważ biokatalizator wykorzystywany jest przez długi okres czasu. Metody immobilizacji W winiarstwie wykorzystywane są mikroorganizmy immobilizowane na powierzchni lub wewnątrz nośnika. Unieruchamianie na powierzchni nośnika Unieruchamianie na powierzchni nośnika występuje, gdy komórki wykazują naturalną zdolność przylegania do pewnych powierzchni lub innych organizmów, ewentualnie czynią to po zastosowaniu odpowiedniego chemicznego czynnika wiążącego. Jako nośniki w winiarstwie stosowane są m.in.: skały wulkaniczne (kissiris), szkło porowate, pochodne celulozy, gluten, jak również owoce. W metodzie tej mikroorganizmy unieruchamiane są na zasadzie adsorpcji lub adhezji. Podstawą immobilizacji jest oddziaływanie między nośnikiem a komórką dzięki tworzeniu wiązań: van der Waalsa, jonowych, kowalencyjnych, hydrofobowych lub też dzięki ich kombinacji (rys. 1 A). Uważa się, że w przypadku drożdży kluczową rolę w wiązaniu odgrywają oddziaływania jonowe między nośnikiem o dużej gęstości ładunków dodatnich a licznymi ujemnymi ładunkami na ścianie komórkowej [8]. Liczba komórek immobilizowanych na nośniku zależy od rodzaju nośnika [15], natomiast wydajność adsorpcji zależy od zastosowanych mikroorganizmów, ich wieku, metabolizmu i cech środowiska [16]. Zmiany składu pożywki podczas fermentacji obniżają stopień adsorpcji komórek. Ponadto może zachodzić częściowe uwalnianie komórek, które zależy głównie od szybkości przepływu fazy płynnej, turbulencji wokół powierzchni nośnika oraz od autolizy komórek niższych warstw [13]. W przypadku unieruchamiania drożdży na powierzchni nośnika zalecane jest używanie materiału makroporowatego, o średnicy porów co naj-

9 ZASTOSOWANIE MIKROORGANIZMÓW IMMOBILIZOWANYCH W WINIARSTWIE 7 mniej czterokrotnie większej niż średnica komórek. Taka porowatość zapewnia normalny cykl życiowy drożdży - pączkowanie [16]. A1 A2 A3 Adsorpcja na powierzchni Wiązanie elektrostatyczne Wiązanie kowalencyjne Adsorption on a surface Electrostatic binding Covalent binding B1 B2 B3 Pułapkowanie w Mikrokapsułkowanie Unieruchamianie wewnątrz porowatym nośniku membran Entrapment within Microencapsulation Immobilization between porous matrix membranes Rys. 1. Metody unieruchamiania komórek: A. Unieruchamianie na powierzchni nośnika, B. Unieruchamianie wewnątrz nośnika [18]. Fig.1. Methods of cell s immobilization: A. Immobilization on solid carrier, B. Immobilization within a carrier [18]. Unieruchamianie wewnątrz nośnika Polega ono na zamykaniu komórek w materiałach włóknistych lub porowatych pułapkowanie w kuleczkach żelu, zamykanie wewnątrz membran półprzepuszczalnych (rys. 1 B). Jako nośniki najczęściej stosowane są: alginiany, κ-karagenian, chitozan, agar, pektyna. W przypadku pułapkowania rozmieszczenie komórek w kuleczkach jest ograniczone dyfuzją substratów i tlenu przez warstwę żelu oraz wyższym, inhibującym stężeniem etanolu w części centralnej. Powoduje to, że drożdże tworzą warstwę w pobliżu powierzchni nośnika, a w części środkowej prawie nie występują [13, 18]. Zamykanie drożdży w żelach nie eliminuje przedostawania się komórek do fermentowanego podłoża. Zachodzi również pękanie kuleczek pod wpływem CO 2 powstającego podczas fermentacji. W celu ograniczenia pękania kuleczek oraz zapewnienia maksymalnej żywotności immobilizowanych drożdży należy dobrać odpowiednią liczbę komórek w zależności od porowatości żelu i wielkości kuleczek. Ponadto celem ograni-

10 8 Sylwia Bonin czenia ucieczki komórek z kuleczek prowadzi się utwardzanie, np. żelatyny - modyfikowaną skrobią [1]. Innym rozwiązaniem jest tworzenie płaszcza z alginianu wapnia, który ochrania kuleczki alginianowe z zamkniętymi w środku komórkami drożdży. Dzięki temu komórki, które wydostają się z żelu zatrzymują się w wolnej warstwie między kuleczką a płaszczem [11, 30]. Wykorzystywane najczęściej w fermentacji etanolowej żele alginianowe są w niewielkim stopniu przydatne do fermentacji winiarskiej, ponieważ w kwaśnym środowisku wina tracą swe właściwości mechaniczne, a przy dłuższym użyciu mogą ulegać destrukcji. Stabilność alginianu wapnia jest obniżana przez związki mające wysokie powinowactwo do jonów Ca 2+. Są to kwasy: winowy, fosforowy(v), cytrynowy i ich sole oraz jony Na +, K +, NH 4 +, a także związki chelatujące. Właściwości te uniemożliwiają powtórne wykorzystanie nośników, stąd ich zastosowanie jest nieekonomiczne [25]. Stwierdzono również negatywny wpływ alginianu na właściwości sensoryczne otrzymywanego wina [4]. Bardziej wytrzymałe w środowisku wina i nieoddziałujące negatywnie na jakość produktu są żele pektynowe [23]. Zastosowanie immobilizacji w winiarstwie Fermentacja okresowa, powtarzana i fermentacja ciągła W fermentacji winiarskiej drożdże immobilizowane wykorzystywane są zarówno w procesach okresowych, powtarzanych, jak i w fermentacjach ciągłych. Prowadzone prace dotyczą doboru nośników, warunków procesu i ich wpływu na cechy wina. W procesach okresowych, powtarzanych nośnik z unieruchomionymi drożdżami po zakończeniu fermentacji periodycznej jest przemywany 2-, 3-krotnie roztworem glukozy lub moszczem, a następnie wykorzystywany w kolejnej fermentacji. Stwarza to komórkom korzystniejsze warunki w porównaniu z procesem ciągłym, stąd takie drożdże wykazują aktywność fermentacyjną przez długi okres, np.: drożdże immobilizowane na wysuszonych rodzynkach przez ponad 4 miesiące [29], na kawałkach pigwy w 40-okresowych fermentacjach, których łączny czas wynosił 8 miesięcy [21], a unieruchomione na delignifikowanej celulozie w 55 kolejnych fermentacjach [6]. W cytowanych pracach uzyskiwano wytrawne wina gronowe, przy czym w kolejnych fermentacjach stopniowo obniżano temp. z 30 do 0 C. W całym zakresie temperatury produktywność była wyższa, a fermentacja zachodziła szybciej w porównaniu z procesem prowadzonym przy użyciu komórek wolnych, ponadto wino charakteryzowało się delikatnym aromatem. Fermentację ciągłą moszczu gronowego ze stopniowym obniżaniem temp. z 30 do 5ºC prowadzono z zastosowaniem drożdży psychrofilnych unieruchomionych na kawałkach jabłek [19] oraz na kawałkach pigwy [22]. W pierwszym przypadku proces

11 ZASTOSOWANIE MIKROORGANIZMÓW IMMOBILIZOWANYCH W WINIARSTWIE 9 trwał 95 dni, w drugim 46 dni, a uzyskiwane wina charakteryzowały się dobrą jakością. Do unieruchamiania drożdży stosowany jest również nieorganiczny nośnik o nazwie kissiris. Jest to porowaty, wulkaniczny minerał pochodzący z wysp greckich, który składa się z ok. 70% SiO 2, 13% Al 2 O 3 oraz innych tlenków. Drożdże unieruchomione na tym nośniku wykorzystano w trwającej 75 dni ciągłej fermentacji moszczu gronowego, ze stopniowym obniżaniem temp. z 27 do 5 C. Produkcja etanolu była wyższa w porównaniu z fermentacją klasyczną, przykładowo w temp. 7 C wzrost był 13-krotny [3]. W dalszych badaniach stwierdzono, że drożdże immobilizowane na kissiris wykazują aktywność fermentacyjną przez ponad 2,5 roku. W tym okresie unieruchomione drożdże wykorzystywano w powtarzanych, okresowych fermentacjach, a także w trwającej 64 dni fermentacji ciągłej. Temp. fermentacji wynosiła 30 C, natomiast pomiędzy poszczególnymi fermentacjami nośnik wraz z unieruchomionymi komórkami przechowywano w temp. 0 C, w roztworze rozcieńczonego moszczu. Zdaniem autorów długotrwała stabilność drożdży wynikała z biokatalitycznej, ochronnej właściwości kissiris [2]. Nośnikiem podobnym strukturalnie do kissiris jest szkło piankowe. Drożdże unieruchomione na szkle piankowym wykorzystywano w 3,5-miesięcznej ciągłej produkcji wina jabłkowego. Proces fermentacji ciągłej prowadzono przy użyciu dwóch szczepów drożdży odpornych na stosunkowo wysokie stężenie etanolu i cukru. Fermentacji poddawano nastawy zawierające ok. 320 g/cm 3 cukrów ogółem. W zależności od czasu pracy fermentora uzyskiwano ok % obj. alkoholu [9]. W fermentacjach ciągłych drożdże są narażone przez cały czas trwania procesu na niekorzystne działanie etanolu, ubocznych produktów fermentacji i beztlenowego środowiska. W przypadku długotrwałej fermentacji nastawów wysokocukrowych stwierdzono, że drożdże wyizolowane z nośnika po zakończeniu pracy fermentora charakteryzowały się zróżnicowanymi kształtami, a w przypadku niektórych komórek również zmienioną strukturą wewnątrzkomórkową [10]. Należy ponadto zwrócić uwagę, że zastosowany do immobilizacji drożdży nośnik wpływa na ilość otrzymywanego alkoholu i produktywność procesu. Podczas fermentacji ciągłej prowadzonej w tych samych warunkach, z wykorzystaniem drożdży unieruchomionych na kissiris, tlenku glinu i pułapkowanych w alginianie stwierdzono, że najwyższą zawartością etanolu i produktywnością charakteryzowała się fermentacja z komórkami pułapkowanymi w alginianie, a najniższą z unieruchomionymi na tlenku glinu. Prawdopodobnie było to związane z ochronnym dla drożdży mikrośrodowiskiem wewnątrz kuleczek, ponieważ proces prowadzono w temp. 7 C, a szczep drożdży był wyizolowany z winogron [5]. Podczas fermentacji przebiegających z wykorzystaniem drożdży unieruchomionych na kawałkach jabłek, gruszek i pigwy najwyższą produktywność uzyskano w przypadku jabłek, a najniższą gruszek [20].

12 10 Sylwia Bonin Ważnym wyznacznikiem jakości win jest skład produktów ubocznych fermentacji. Jest on różny w zależności od tego, czy proces prowadzony jest z komórkami wolnymi, czy immobilizowanymi, a w tym ostatnim przypadku zależy również od rodzaju użytego nośnika. W winie produkowanym z drożdżami unieruchomionymi na różnych nośnikach stwierdzano wyższe ilości octanu etylu w porównaniu z fermentacją okresową z komórkami wolnymi [4, 6, 7]. W przypadku zastosowania kissiris, tlenku glinu i alginianu obserwowano mniejsze zawartości n-propanolu, alkoholu amylowego i alkoholu izobutylowego w porównaniu z fermentacją z komórkami wolnymi [4]. W przypadku zaś unieruchomienia drożdży na kuleczkach glutenu i na delignifikowanej celulozie nie zaobserwowano różnic w ilości alkoholi wyższych w porównaniu z procesem tradycyjnym [6, 7]. Szczególnie duże różnice w składzie produktów ubocznych stwierdzano w winach produkowanych z wykorzystaniem drożdży immobilizowanych na owocach (jabłka, gruszki, pigwa). Przy czym skład win był inny w przypadku zastosowania tego samego nośnika w procesie okresowym i ciągłym. Stwierdzono ponadto, że nośniki nadały winom owocowy aromat i korzystny smak, przy czym najlepszymi cechami jakościowymi odznaczały się wina produkowane z drożdżami immobilizowanymi na jabłkach [20, 21, 22]. Fermentacja wtórna (szampanizacja) Drożdże pułapkowane znalazły zastosowanie w szampanizacji win metodą butelkową ze względu na zdolność do bardzo dobrej sedymentacji (remuage) i łatwość oddzielenia po zakończeniu fermentacji (degorgage). W procesie szampanizacji ważne jest, aby drożdże unieruchomione w nośniku nie wydostawały się na zewnątrz, stąd często stosuje się kuleczki pokryte dodatkową warstwą alginianu. Dzięki temu liczba uwalnianych komórek ulega zmniejszeniu w porównaniu z pułapkowaniem w samym alginianie wapnia. Produkty otrzymywane przy użyciu drożdży pułapkowanych są bardziej klarowne, charakteryzują się delikatniejszym perleniem i brakiem zmian w składzie chemicznym w porównaniu z produktami otrzymywanymi metodą tradycyjną, a produkcja CO 2 przebiega szybciej niż w procesie klasycznym [11, 30]. Zdaniem innych autorów wtórna fermentacja z drożdżami immobilizowanymi jest dłuższa, ale wykorzystanie substratów efektywniejsze. Powstający powoli CO 2 nie niszczy stabilności immobilizowanego systemu. Wolniejszy przebieg wtórnej fermentacji jest istotny także pod względem fizykochemicznym, ponieważ wiązanie CO 2 z rodnikami substancji organicznych jest trwalsze [26]. Fermentacja jabłkowo-mlekowa i jabłkowo-alkoholowa Fermentacja jabłkowo-mlekowa jest procesem wtórnym i polega na przekształceniu przez bakterie mlekowe, głównie z rodzaju Oenococcus, Lactobacillus, kwasu L- jabłkowego do L-mlekowego i CO 2. W procesie tym powstają także inne produkty

13 ZASTOSOWANIE MIKROORGANIZMÓW IMMOBILIZOWANYCH W WINIARSTWIE 11 uboczne, np. aldehyd octowy, diacetyl, octan etylu, alkohole wyższe. W konsekwencji kwasowość ogólna ulega obniżeniu, a właściwości sensoryczne i stabilność biologiczna wina polepszają się [24]. Prowadzenie fermentacji jabłkowo-mlekowej z komórkami wolnymi jest utrudnione, ponieważ bakterie są wrażliwe na warunki panujące w winie, do których zalicza się m.in. SO 2, etanol, polifenole, cukry resztkowe, niskie ph, niską temperaturę i obecność bakteriofagów. W przypadku zastosowania komórek immobilizowanych mikrośrodowisko nośnika działa na komórki ochronnie [18]. W prowadzonych badaniach bakterie Leuconostoc oenos były unieruchamiane w sześcianach z poliakrylamidu, karagenianu i kuleczkach alginianu, które umieszczano w reaktorach kolumnowych lub w reaktorach z mieszaniem. Czas przepływu wina przez urządzenie wynosił kilka godzin i był równoważny z czasem trwania fermentacji jabłkowo-mlekowej, natomiast proces tradycyjny trwa kilka dni lub tygodni [13]. W fermentacji jabłkowo-mlekowej win czerwonych, w systemie półciągłym wykorzystano także bakterie Oenococcus oeni unieruchomione na celulozowych gąbkach. W ciągu 24 godz. obserwowano przekształcenie około połowy zawartego w winie kwasu jabłkowego. Bakterie wykazywały zdolności fermentacyjne także po 21 dniach przechowywania nośnika w temp. 4ºC [24]. Ponadto nie stwierdzono różnic aktywności fermentacyjnej bakterii w zależności od sposobu immobilizacji. Zarówno bakterie Lactobacillus casei unieruchomione w kuleczkach pektynianu wapnia, jak i na powierzchni kuleczek modyfikowanego chitozanu, wykazywały o połowę większą zdolność rozkładu kwasu jabłkowego zawartego w winie Chardonnay w porównaniu z komórkami wolnymi. Ponadto komórki immobilizowane w pektynianie charakteryzowały się dobrą stabilnością fermentacyjną po 6 miesiącach przechowywania, a na powierzchni chitozanu po 2 miesiącach. Nie podano jednak warunków przechowywania unieruchomionych bakterii [17]. Zdolność przekształcania kwasu jabłkowego mają także drożdże Schizosaccharomyces pombe i niektóre szczepy z rodzaju Saccharomyces. Jednak przemiany biochemiczne są inne niż bakterii i zachodzi fermentacja jabłkowo-etanolowa. Drożdże S. pombe pułapkowane w kuleczkach o podwójnej warstwie alginianiu zastosowano do ciągłego odkwaszania moszczu gronowego. Proces prowadzono przez 6 tygodni i w tym okresie drożdże wykazywały wysoką aktywność rozkładu kwasu jabłkowego [18]. Ko-immobilizacja Zaletą technologii z zastosowaniem komórek immobilizowanych jest możliwość ko-immobilizacji różnych rodzajów mikroorganizmów, co umożliwia przeprowadzenie dwóch rodzajów fermentacji w jednym zintegrowanym systemie. W przemyśle winiarskim ko-immobilizacja znalazła zastosowanie w produkcji cydru. W klasycznej technologii fermentacja zachodzi pod wpływem mikroorganizmów obecnych na skórkach jabłek. Przez pierwsze 2-3 tygodnie ma miejsce fermentacja alkoholowa, a następnie

14 12 Sylwia Bonin przekształcenie kwasu jabłkowego w mlekowy, czyli proces dojrzewania, który trwa do 8 tygodni. W przypadku fermentacji spontanicznej uzyskuje się często produkt o różnej jakości. Zastosowanie ko-immobilizacji pozwala na znaczne skrócenie czasu produkcji cydru i otrzymywanie napoju o wyrównanych cechach sensorycznych [18, 27]. W okresowej produkcji cydru zastosowano ko-immobilizację na gąbkopodobnym materiale celulozowym. W pierwszym etapie prowadzono fermentację przy użyciu unieruchomionych drożdży Saccharomyces cerevisiae, a następnie dodawano zawiesinę komórek bakterii Lactobacillus plantarum, które osadzały się na zawierającym już drożdże nośniku. Stwierdzono, że na jakość otrzymywanego produktu wpływał czas od rozpoczęcia fermentacji, w którym stosowano dodatek bakterii. Produkcja cydru, łącznie z dojrzewaniem, trwała cztery tygodnie, a napój zawierał więcej etanolu w porównaniu z fermentacją klasyczną i odznaczał się wysoką jakością sensoryczną [28]. Produkcję cydru można także prowadzić w sposób ciągły. W tym celu wykorzystano ko-immobilizowane w alginianie drożdże Saccharomyces bayanus wraz z bakteriami Leuconostoc oenos. Fermentacja zachodziła w ciągu kilku godzin, a w zależności od tempa przepływu uzyskiwano cydr o stosunkowo wysokim stężeniu cukru lub wytrawny. W produkcie otrzymywanym metodą ciągłą stwierdzono zmniejszenie zawartości octanu izoamylu i alkoholi wyższych oraz zwiększenie zawartości diacetylu i aldehydu octowego w porównaniu z cydrem otrzymywanym w sposób tradycyjny, jednak smak napoju był zadowalający [27]. Poprawa jakości sensorycznej wina Unieruchomione mikroorganizmy stosuje się również w celu poprawy smaku i zapachu wina. W ostatnich latach stwierdzono, że drożdże Candida stellata odgrywają pozytywną rolę w kształtowaniu cech jakościowych tego napoju. Wykazano możliwość zastosowania tych drożdży, unieruchomionych w alginianie, w ciągłej prefermentacji moszczu gronowego, który następnie poddawano okresowej fermentacji z wolnymi komórkami Saccharomyces cerevisiae. W efekcie uzyskano wina wysokiej jakości, które nie zawierały żadnych cukrów resztkowych, natomiast różniły się składem produktów ubocznych w zależności od tempa przepływu moszczu przez kolumnę z komórkami Candida [12]. W prowadzonym, w skali półtechnicznej, procesie do fermentacji moszczu gronowego przez pierwsze 3 dni stosowano unieruchomione w alginianie komórki Candida stellata, następnie zaś dodawano drożdże Saccharomyces cerevisiae. Otrzymano wino o pozytywnym i interesującym profilu, które, w porównaniu z fermentacją bez C. stellata, charakteryzowało się wyższą zawartością glicerolu, kwasu bursztynowego, aldehydu octowego i octanu etylu, a niższą alkoholi wyższych [14].

15 ZASTOSOWANIE MIKROORGANIZMÓW IMMOBILIZOWANYCH W WINIARSTWIE 13 Podsumowanie W pracach dotyczących wykorzystania mikroorganizmów immobilizowanych w winiarstwie drobnoustroje są unieruchamiane na różnych nośnikach. We wszystkich procesach z zastosowaniem immobilizacji dobry nośnik powinien charakteryzować się obojętnością w stosunku do unieruchamianych mikroorganizmów, dużą zdolnością zatrzymywania komórek, zapewniać właściwą dyfuzję substratu i produktu oraz wysoką żywotność i stabilność operacyjną immobilizowanych biokatalizatorów przez długi czas. Ponadto powinna cechować go wysoka mechaniczna, chemiczna, biologiczna i termiczna stabilność, niska cena, łatwa dostępność, możliwość regeneracji i kilkakrotnego użycia oraz możliwość zastosowania w skali przemysłowej. W winiarstwie oprócz powyższych cech bardzo ważne jest, aby nośniki były bezpieczne, odporne na alkohol i nie powodowały zmian jakości produktu. Ponadto końcowa zawartość alkoholu w winie powinna wynosić co najmniej 11,5 % obj. [6, 18]. Literatura [1] Alteriis -de E., Porro D., Romano V., Parascandola P.: Relation between growth dynamics and diffusional limitations in Saccharomyces cerevisiae cells growing as entrapped in an insolubilised gelatin gel. FEMS Microbiol. Lett., 2001, 195, [2] Argiriou T., Kanellaki M., Voliotis S., Koutinas A.A.: Kissiris-suported yeast cells: high biocatalitic stability and productivity im provement by successive preservations at 0ºC. J. Agric. Food Chem., 1996, 44, [3] Bakoyianis V., Kanellaki M., Kaliafas A., Koutinas A.A.: Low-temperature wine making by immobilized cells on mineral kissiris. J. Agric. Food Chem., 1992, 40 (7), [4] Bakoyianis V., Kanellaki M., Psarianos C., Koutinas A.A.: Low temperature, countinuous winemaking by immobilized cells: a comparative study of the effect of temperature on volatile byproducts. Food Biotechnol., 1998, 12 (3), [5] Bakoyianis V., Koutinas A.A., Agelopoulos K., Kanellaki M.: Comparative study of kissiris, γ- alumina and calcium alginate as supports of cells for batch and continuous wine-making at low temperatures. J. Agric. Food Chem., 1997, 45, [6] Bardi E.P., Koutinas A.A.: Immobilization of yeast on delignified cellulosic material for room temperature and low-temperature wine making. J. Agric. Food Chem., 1994, 42, [7] Bardi E.P., Koutinas A.A., Psarianos C., Kanellaki M.: Volatile by-products formed in lowtemperature wine-making using immobilized yeast cells. Process Biochem., 1997, 32 (7), [8] Bekers M., Ventina E., Karsakevich A., Vina J., Rapoport A., Upite D., Kaminska E., Linde R.: Attachment of yeast to modified stainless steel wire spheres, growth of cells and ethanol production, Process Biochem., 2000, 35, [9] Bonin S., Wzorek W.: Porównanie ciągłych fermentacji winiarskich prowadzonych przy użyciu dwóch szczepów drożdży immobilizowanych na szkle piankowym. Acta Scien. Polon., Technol. Aliment., 2004, 3 (2), [10] Bonin S., Wzorek W.: Wpływ długotrwałej ciągłej fermentacji winiarskiej na morfologię drożdży immobilizowanych na szkle piankowym. Biotechnologia, 2003, 4 (63), [11] Busova K., Magyar T., Janky F.: Effect of immobilized yeasts on the quality of bottle-fermented sparkling wine. Acta Aliment., 1994, 23 (1), 9-23.

16 14 Sylwia Bonin [12] Ciani M., Ferraro L.: Enhanced glycerol content in wines made with immobilized Candida stellata cells. J. Appl. Microbiol., 1998, 85, [13] Divies Ch., Cachon R., Cavin J.F. Prevost H.: Immobilized cell technology in wine production. Critical Rev. Biotech., 1994, 14 (2), [14] Ferraro L., Fatichenti F., Ciani M.: Pilot scale vinification process using immobilized Candida stellata cells and Saccharomyces cerevisiae. Process Biochem., 2000, 35 (11), [15] Fujii N., Sakurai A., Onjoh K., Sakakibana M.: Influence of surface characteristics of cellulose carriers on ethanol production by immobilized yeast cells. Process Biochem., 1999, 34, [16] Klein J., Ziehr H.: Immobilization of microbial cells by adsorption. J. Biotechnol., 1990, 16, [17] Kosseva M., Beschkov V., Kennedy J.F., Lioyd L.L.: Malolactic fermentation in Chardonnay wine by immobilized Lactobacillus casei cells. Process Biochem., 1998, 33 (8), [18] Kourkoutas Y., Bekatorou A., Banat I.M., Marchant R., Koutinas A.A.: Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol beverages production: a review. Food Microbiol., 2004, 21, [19] Kourkoutas Y., Douma M., Koutinas A.A., Kanellaki M., Banat I.M., Marchant R.: Continuous winemaking fermentation using quince-immobilized yeast at room and low temperatures. Process Biochem., 2002, 39, [20] Kourkoutas Y., Kanellaki M., Koutinas A.A., Tzia C.: effect of fermentation conditions and immobilization supports on the wine making. J. Food Engin., 2005, 69, [21] Kourkoutas Y., Komaitis M., Koutinas A.A., Kaliafas A., Kanellaki M., Marchant R., Banat I.M.: Wine production using yeast immobilized on quince at temperatures between 30 and 0 0 C. Food Chemistry, 2003, 82, [22] Kourkoutas Y., Koutinas A.A., Kanellaki M., Banat I.M., Marchant R.: Continuous wine fermentation using a psychrophilic yeast immobilized on apple cuts at different temperatures. Food Microbiol., 2002, 19, [23] Krasny S., Malik F., Kozankova J., Nahalka J., Minarik E.: Immobilisierte Hefen im Gärungsprozeβ von Apfelmost. Mitt. Klosterneuburg, 1993, 43, [24] Maicas S., Pardo I., Ferrer S.: The potential of positively-charged cellulose sponge for malolactic fermentation of wine, using Oenococcus oeni. Enz. Microb. Technol., 2001, 28, [25] Malik F., Krasny S., Nahajka J., Minarik E.: Immobilisierte Helen im Prozeß der sekundären Wiengärung. Mitt. Klosterneuburg, 1993, 43, [26] Malik F., Smogrovicova D., Halama D., Pach L.: Zur Charakterisierung einiger Eigenschaften immobilisierter Weinhefen. 2. Mitteilung: Untersuchung zur Respiration immobilisierter Zellen. Mitt. Klosterneuburg, 1990, 40, [27] Nedovic V.A., Durieux A., van Nedervelde L., Rosseels P., Vadegans J.: Continuous cider fermentation with co-immobilized yeast and Leuconostoc oenos cells. Enz. Microb. Technol., 2000, 26 (9/10), [28] Scott J.A., O Reilly A.M.O.: Co-immobilization of selected yeast and bacteria for controlled flavour development in an alcoholic cider beverage. Process Biochem., 1996, 31 (2), [29] Tsakiris A., Bekatorou A., Psarianos C., Koutinas A.A., Marchant R., Banat I.M.: Immobilization of yeast on dried raisin berries for use in dry white wine-making. Food Chem., 2004, 87, [30] Yokotsuka K., Yajima M., Matsudo T.: Production of bottle-fermented sparkling wine using yeast immobilized in double-layer gel beads or strands. Am. J. Enol. Vitic., 1997, 48 (4),

17 ZASTOSOWANIE MIKROORGANIZMÓW IMMOBILIZOWANYCH W WINIARSTWIE 15 APPLICATION OF IMMOBILIZED MICROORGANISMS IN WINE-MAKING S u m m a r y Cell immobilization in alcoholic fermentation is a very beneficial due to its attractive technical and economic advantages compared to the conventional free cell system. However, the wine-making compared to fuel or chemical alcohol production has some additional prerequisites: a final alcohol content should be at least 11.5% v/v, the carrier must be food grade purity and must not affect product quality. This review describes issues concerning cell immobilization in wine-making, where immobilized microorganisms are used: repeated batch fermentation, continuous fermentation, production of sparkling wine ("champanois"), malolactic fermentation, cider-making and improvement of wine quality. Key words: immobilization, wine-making, oenology, fermentation technology

18 ŻYWNOŚĆ 3(48), 2006 MIROSŁAW M. MICHALSKI BIOTOKSYNY MORSKIE - WYSTĘPOWANIE I METODY ANALIZY S t r e s z c z e n i e W pracy scharakteryzowano 5 grup biotoksyn morskich występujących w małżach blaszkoskrzelnych (dwuskorupkowych) mogących być przyczyną zatruć po ich spożyciu. Należą do nich toksyny paraliżujące -PSP, wywołujące biegunkę - DSP i AZP, zaburzenia nerwowe - NSP i zaburzenia pamięci - ASP. Spożywanie małż, ostryg i omułków staje się w Polsce coraz popularniejsze, a więc i prawdopodobieństwo zatruć po spożyciu małż wzrasta. Wskazano źródła toksyn morskich, metody ich wykrywania oraz podstawowe akty prawne związanie z hodowlą, dystrybucją i nadzorem nad małżami przeznaczonymi do konsumpcji przez ludzi. Słowa kluczowe: małże dwuskorupkowe, plankton, toksyny morskie, zatrucia Wprowadzenie Mikroskopijne algi (plankton) są w oceanach podstawowym źródłem pożywienia dla mięczaków, takich jak: ostrygi, małże, przegrzebki czy też omułki oraz dla larw skorupiaków. Wśród około 5000 istniejących gatunków alg morskich około 300 może występować w bardzo dużej ilości, powodując tzw. kwitnienie wody połączone ze zmianą zabarwienia powierzchni wód i to zarówno słonych, jak i słodkich. Kwitnienie wód nosi również nazwę "red tides" czyli czerwony przypływ, chociaż nie zawsze wody zabarwiają się na czerwono. Wody zabarwiają się również na kolor żółty, zielony, brązowy lub niebieski w zależności od rodzaju planktonu, jego ilości i głębokości na jakiej występuje. Plankton może wytworzyć związki toksyczne dla ludzi, zwłaszcza w czasie tzw. "kwitnienia wód" wytwarza się szczególnie dużo różnorodnych toksyn [7, 10]. W ostatnich latach częstotliwość występowania kwitnienia alg znacznie się zwiększyła. Przyczyny tej ekspansji nie są do końca poznane. Wydaje się, że wpływ zanieczyszczenia środowiska substancjami mineralnymi, ścieki przemysłowe, podniesienie się temperatury wód przybrzeżnych wpływa znacznie na okresowy i gwałtowny rozwój jednokomórkowców. Również zmiany klimatyczne i zakłócenia hydrograficzne Dr inż. M.M. Michalski, Państwowy Instytut Weterynaryjny Państwowy Instytut Badawczy, Al. Partyzantów 57, Puławy

19 BIOTOKSYNY MORSKIE - WYSTĘPOWANIE I METODY ANALIZY 17 mają wpływ na ich rozwój. Jednak okresów i miejsc występowania nadmiernych ilości planktonu nie można dzisiaj przewidzieć [1, 14]. Termin morskie biotoksyny oznacza substancje toksyczne odkładające się w żywych małżach, zwłaszcza wskutek spożywania przez nie planktonu zawierającego toksyny. Substancje toksyczne przedostają się do organizmu mięczaków poprzez plankton jako ich pożywienie i kumulowane są w mięśniach i wątrobotrzustce. Biotoksyny morskie wytwarzane są przez glony planktonowe, gdy wystąpią korzystne warunki do ich rozwoju tj. dostępność substancji organicznej, dostępność mikroelementów, O 2 /CO 2, obecność światła, odpowiednia temperatura wody czy też zmiana zasolenia spowodowana prądami morskimi. Glony przenoszone są przez prądy morskie do miejsc bogatych w substancje odżywcze i w kierunku powierzchni, do światła. Coraz większą popularnością w naszym kraju cieszą się tzw. owoce morza, w tym małże blaszkoskrzelne (mięczaki). W krajach, takich jak: Hiszpania, Francja, Portugalia, USA czy Japonia owoce morza są spożywane bardzo powszechnie, co wiąże się ze zwiększonym ryzykiem zatruć po spożycia małż zawierających biotoksyny. Aby uniknąć przedostania się "skażonych" małż do obrotu stosuje się szereg procedur zabezpieczających, począwszy od nadzoru nad obszarami produkcyjnymi po gotowy produkt. Nadzór nad obszarem produkcji polega na monitorowaniu obecności glonów na różnych głębokościach, określaniu gatunku i ilości fitoplanktonu/glonów oraz obecności składników odżywczych (azotany(v), azotany(iii), amoniak, fosforany(v), krzemiany) w środowisku. Monitorowaniu podlega również woda, którą bada się na obecność metali, pestycydów, związków chloroorganicznych, dokonuje się pomiaru temperatury i stopnia zasolenia, ph, oznacza się zawartość tlenu rozpuszczonego w wodzie, jej przejrzystość itd. Kolejnymi etapami nadzoru jest oznaczanie obecności biotoksyn w glonach, biotoksyn w mięczakach i badania mikrobiologiczne obszaru produkcyjnego. Otrzymane dane pozwalają dokonać klasyfikacji obszarów produkcyjnych, tzn. dopuszczenie do zbioru małż i przekazanie do handlu lub do zakładów oczyszczania, gdzie toksyny są wymywane z małż blaszkoskrzelnych (dwuskorupkowych) czystą wodą. Proces wymywania w zależności od rodzaju małży i toksyny trwa od kilku dni do kilkunastu tygodni. Charakterystyka biotoksyn morskich Główne biotoksyny spotykane w mięczakach (shellfish marine biotoxins) to: PSP paraliżujące, NSP neurotoksyny, ASP anamnestyczne, DSP - wywołująca biegunki oraz AZA (kwas azaspirowy) wywołujący biegunki.

20 18 Mirosław M. Michalski Toksyna paralityczna - PSP (Paralitic Shellfish Poisoning) Toksyny paralityczne są najbardziej niebezpieczne dla człowieka i stanowią duży problem w krajach, gdzie spożywanie małż jest powszechne. I to zarówno tych pochodzących z hodowli, jak i zbieranych indywidualnie na wybrzeżu morza. Aktywną toksyną jest saksytoksyna (STX) oraz jej 21 izomerów (pochodne tetrahydropuryn, SXT's). W 1975 r. po raz pierwszy uzyskano krystaliczną syntetyczną pochodną saksytoksyny i zbadano jej strukturę [4]. Minimalna dawka saksytoksyny powodująca zatrucie to 20 μg/kg masy ciała. Dawka śmiertelna dla człowieka to 150 μg/kg masy ciała. Dopuszczalna zawartość PSP wynosi 80 μg/100 g mięsa mięczaków. Pierwsze udokumentowane zatrucie wystąpiło w 1948 r. w Japonii, a w USA w połowie lat 60. XX w. W Europie notowane są zatrucia od wczesnych lat 80. Pod koniec 1987 r. w Wielkiej Brytanii wiele osób zatruło się PSP, a 3 osoby zmarły. Pierwotnym źródłem SXT's są glony z rodzaju Alexandrium, a więc np. A. catenella, A. tamarensis, A. minutum, A. fundyense i A. cohorticula. Również żródłem STX's są Pyrodinium bahamense i Gymnodinum catenatum [12]. Podczas zakwitu Pyrodinium w 1987 r. w Gwatemali, w wyniku spożycia toksycznych małż, 187 osób było hospitalizowanych, a 26 osób zmarło. Również kraby, ślimaki morskie i krewetki mogą zawierać PSP. Objawy zatrucia saksytoksyną to: drętwienia języka, brak czucia, porażenie mięśni oddechowych i układu motorycznego, porażenie układu sercowo-naczyniowego, drżenie rąk i palców u nóg, bełkotliwa mowa, ślinienie się i kłopoty z oddychaniem. Śmiertelność wynosi około 10%. Do metod wykrywania należy test na myszach (MBA) (metoda referencyjna) lub na szczurach (RBA) i metody alternatywne tj. Elisa (immunoassay), HPLC, LC-MS, LC, chromatografia jonowymienna, elektroforeza, określenie stopnia blokowania kanałów sodowych (mouse in vitro) czy też techniki elektroforetyczne. Toksyny wywołujące biegunkę DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning) i AZP (Azaspiracid Shellfish Poisoning) DSP należą do toksyn lipofilnych, gromadzących się w tkance tłuszczowej mięczaków. Toksyny są termostabilne. Minimalna dawka toksyny powodująca biegunkę to 40 μg. Objawami zatrucia są uporczywe biegunki, wymioty, nudności i skurcze żołądka. Objawy są już widoczne nawet po 30 min od spożycia. Z reguły objawy zanikają po 3-4 dniach. Przy chronicznych zatruciach jest możliwa indukcja raka żołądka czy też przewodu pokarmowego [5]. W 1984 r., we Francji, około osób zatruło się po spożyciu skażonych mięczaków [6]. Do grupy toksyn DSP zalicza się kwas okadaikowy (OA) i jego pochodne - dinofysistoksyny (DTX1, DTX2, DTX3), pektenotoksyny (PTX1, PTX2) oraz yessotoksyny (YTX's). Dinofysiskotoksyny uszkadzają również wątrobę. Źródłem toksyn DSP są glony Dinophysis spp. oraz Prorocentrum. Metody wykrywania toksyn to MBA [15], HPLC (fluorometric detector), TLC, LC, LC-MS, LC ion-spray MS, Elisa, testy fosfatazowe (np. PP2A, Biosense) czy też testy cytotok-

21 BIOTOKSYNY MORSKIE - WYSTĘPOWANIE I METODY ANALIZY 19 syczne. Badania międzylaboratoryjne LC-MS wskazują na tę metodę jako referencyjną przy oznaczaniu toksyn ASP i DSP [8]. AZP jest oddzielną, nowo sklasyfikowaną grupą toksyn, w której substancją toksyczną jest kwas azaspirowy (AZA) i jego pochodne. Toksyna ta ma również swoje izomery, AZA2 do AZA5. Objawy przy zatruciu AZA są podobne do zatrucia DSP, a więc uporczywe biegunki, wymioty, nudności i skurcze żołądka. W listopadzie 1995 r. w Holandii 8 osób zachorowało po spożyciu hodowlanych omułków (Mytilus edulis) pochodzących z Irlandii, z Killary Harbour [11]. Następne zatrucie AZA wystąpiło w następnym roku w Irlandii, również po spożyciu omułków. Przypuszcza się, że plankton (brudnica) Protoceratum crissipes produkuje kwas azaspirowy [13]. Jak dotychczas AZA's znajdowano jedynie w omułkach i ostrygach [9]. Do metod wykrywania toksyn AZP można zaliczyć: RBA, MBA, LC-MS, LC-MS-MS, HPLC z detektorem fluorometrycznym, ELISA czy też testy czynnościowe [10]. Toksyna powodująca amnezję ASP (Amnestic Shellfish Poisoning) Głównym związkiem toksycznym jest kwas domoikowy i jego izomery. Po raz pierwszy zdiagnozowano zatrucie kwasem domoikowym w Kanadzie w 1987 r. w wyniku spożycia omułków (blue mussels). Omułki zawierały do 790 ug DA/g (cały omułek). W wyniku tego zatrucia 105 osób było hospitalizowanych, a 3 osoby zmarły. Okrzemek Pseudonitzschia jest głównym jednokomórkowcem wytwarzającym kwas domoikowy (DA) [2, 7]. Dopuszczalna zawartość DA w mięśniach małży to 20 μg/100 g mięsa. Objawy zatrucia występują po 24 godz. od spożycia przy łagodnym zatruciu i od 0,5 do 6 godz. przy ostrym zatruciu. Objawy po spożyciu są podobne do choroby Alzheimera. Następuje krótkotrwała utrata pamięci (short term memory). Po inhalacji aerozolu w postaci mgiełki z wody morskiej, podczas spaceru brzegiem morza, gdy woda kwitnie może wystąpić dodatkowo skurcz oskrzeli. Przy lekkim zatruciu i u konsumentów niemających problemów z nerkami następuje całkowite wyzdrowienie już po kilku dniach. Przy ostrym zatruciu, gdy organizm nie jest w stanie szybko usunąć toksyny (DA), może wystąpić dodatkowo poważne, trwałe uszkodzenie mózgu. Metody wykrywania ASP w owocach morza to HPLC (metoda referencyjna), MBA, Elisa, TLC, GC-MS, LC-MS czy też elektroforeza kapilarna. Test na myszach należy do metod AOAC (1990). Toksynę amnestyczną stwierdzano również we wnętrznościach krabów (do 90 ug/g), małży żyletkowych (razor clams) czy też sardynkach. Toksyny powodujące zaburzenia nerwowe NSP (Neurotic Shellfish Poisoning) Aktywną neurotoksyną jest brewetoksyna i jej izomery. Objawy zatrucia to podwójne widzenie, trudności w przełykaniu, dreszcze, mdłości, biegunka, odrętwienie, suchość w ustach czy tez uporczywy kaszel przy wdychaniu mgiełki morskiej zawierającej brewetoksynę (objawy astmopodobne). Zatrucia neurotoksyną po spożyciu mię-

22 20 Mirosław M. Michalski czaków najczęściej występują w Zatoce Meksykańskiej, Nowej Zelandii i na wschodnim wybrzeżu Florydy. W Europie nie stwierdzono zatruć po spożyciu małż skażonych brewetoksyną. Jednak w Niemczech, Francji, Grecji, Holandii, Portugalii i Hiszpanii wykryto obecność planktonu wytwarzającego tę toksynę. Za obecność NSP's odpowiadają brudnice (dinoflagellate), a szczególnie glon Gymnodinium breve (Karenia brevis) [7]. Brewetoksyna jest toksyczna również dla ryb. Jest to toksyna bezsmakowa, bezzapachowa, ciepłooporna, kwasooporna oraz rozpuszczalna w tłuszczach (lipofilna) [3]. Brewetoksynę wykrywa się testem MBA, testami biologicznymi na rybach Gambusia affinis (FBA), Elisa, TLC, LC-MS czy też metodami radioimmunologicznymi. Akty prawne dotyczące gospodarki małżami Zasady wprowadzania do handlu małż są ściśle określone prawem unijnym, szczegółowo regulującym wszystkie etapy produkcji, od środowiska hodowlanego, hodowlę, oczyszczanie aż do limitów pozostałości w tkankach małż przeznaczonych do bezpośredniego spożycia, jak i do przetwórstwa. Aktem prawnym regulującym bezpieczeństwo żywnościowe w odniesieniu do małż jest Decyzja Komisji z dnia 15 marca 2002 r. (2002/225) ustanawiająca szczegółowe zasady wykonania dyrektywy Rady 91/492/EWG w zakresie najwyższego dopuszczalnego poziomu zawartości i metod analizy niektórych morskich biotoksyn w małżach, szkarłupniach, osłonicach i ślimakach morskich. Sekcja VII w Rozporządzeniu (WE) nr 853/2004 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 29 kwietnia 2004 r. ustanawia szczególne przepisy dotyczące higieny w odniesieniu do żywności pochodzenia zwierzęcego. Decyzja Komisji z 14 listopada 2003 r. (2003/804/EC) dotyczy warunków zdrowotnych i wymagań certyfikacyjnych przy imporcie małż, ich jaj, gamet przeznaczonych do rozmnażania, hodowli, tuczenia z przeznaczeniem do spożycia przez ludzi. Decyzja Komisji z dnia 15 marca 2002 r. (2002/226) ustanawia specjalne kontrole zdrowotne dotyczące zbierania i przetwarzania określonych małż dwuskorupowych o poziomie toksyny ASP (Amnesic Shellfish Poison) przekraczającym limity określone w dyrektywie Rady 91/492/EWG (notyfikowana jako dokument nr C(2002) 1009). Decyzja Komisji z dnia 18 stycznia1996 r. (96/77/EC) ustanawia warunki zbioru i przetwórstwa pewnych małż dwuskorupkowych pochodzących z obszarów, w których poziom PSP przekracza dopuszczalne limity określone dyrektywą 91/492. Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 15 lipca 2005 r. określa szczegółowe wymagania weterynaryjne dot. umieszczania na rynku zwierząt i produktów akwakultury (Dz. U r. Nr 138 poz. 1158). Podsumowanie Coraz większą popularnością w naszym kraju cieszą się tzw. owoce morza, w tym małże blaszkoskrzelne (mięczaki). Jednak po spożyciu mogą one być przyczyną