UNIWERSYTET MARII CURIE-SKŁODOWSKIEJ

Transkrypt

1 UNIWERSYTET MARII CURIE-SKŁODOWSKIEJ INSTYTUT MIKROBIOLOGII I BIOTECHNOLOGII Zakład Wirusologii i Immunologii Akademicka 19, Lublin, fax: (4881) ; tel: (4881) Prof. dr hab. Agnieszka Szuster-Ciesielska Lublin Zakład Wirusologii i Immunologii Instytut Mikrobiologii i Biotechnologii UMCS Recenzja rozprawy doktorskiej Pana mgr Pawła Czubaka pt.: Ocena fenotypu i funkcji ludzkich komórek macierzystych linii human Bone Marrow Stromal Cells (MSCs) w trakcie różnicowania w kierunku komórek wysp trzustkowych Przedstawiona mi do recenzji praca doktorska została wykonana pod kierownictwem naukowym Pana Profesora dr hab. n. med. Lechosława Putowskiego w Katedrze i Klinice Ginekologii i Endokrynologii Ginekologicznej, Wydziału Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Medycznego w Lublinie. Cukrzyca typu 1 rozwija się na podłożu niedoboru insuliny spowodowanego zniszczeniem komórek β wysp trzustkowych. Bardzo często przyczyną tego są reakcje autoimmunologiczne. Oprócz tradycyjnego leczenia polegającego na podawaniu insuliny (lub jej analogów) można u takich chorych dokonać przeszczepu trzustki lub wysp trzustkowych. Zabiegi te są jednak rzadko wykonywane z uwagi na zbyt małą liczbę narządów dostępnych do transplantacji. Tak więc wciąż poszukuje się nowych, skuteczniejszych strategii leczenia tej choroby. Jednym z najnowszych kierunków badań jest tzw. sztuczna trzustka, implant mający za zadanie kontrolowane uwalnianie insuliny (Taylor J., De Montfort University, Leicester) czy szczepionka przeciw cukrzycy typu 1, dzięki której można byłoby wyłączyć część odpowiedzi immunologicznej odpowiedzialnej za niszczenie komórek β (Steinman L., Stanford University). Nie ustały też badania nad możliwością wykorzystania komórek własnych pacjenta, które po zróżnicowaniu in vitro i powrocie do organizmu (przeszczep autologiczny) mogłyby podjąć produkcję insuliny. I chociaż za najlepsze źródło tych komórek uważa się mezenchymalne komórki macierzyste szpiku, to dotychczas nie udało się opracować takiej 1

2 procedury ich różnicowania, która zapewniłaby wydajną produkcję i wydzielanie insuliny. Części tego zagadnienia poświęcona jest przedstawiona rozprawa doktorska. Ocena poprawności struktury rozprawy Rozprawa doktorska Pana mgr Pawła Czubaka ma typowy układ dla pracy eksperymentalnej i mieści się na 98 stronach zawierających: Wstęp (poprzedzony wykazem skrótów), Cel pracy, opis Materiałów i Metod, Wyniki, Dyskusję, Wnioski, Streszczenia w języku polskim i angielskim oraz Piśmiennictwo. Zachowane zostały odpowiednie proporcje między poszczególnymi rozdziałami pracy. Ocena merytoryczna rozprawy Blisko dwudziestostronicowy Wstęp zawiera wszystkie informacje niezbędne do wprowadzenia czytelnika w problematykę pracy. Autor dokładnie charakteryzuje komórki macierzyste i źródła ich pozyskiwania, zwracając także uwagę na aspekty etyczne. W literaturze funkcjonują dwa terminy: mesenchymal stem cells (MSCs) oraz mesenchymal stromal cells (MSCs). Chociaż obie nazwy często używane są równolegle, to badacze wciąż spierają się, czy jest to właściwe [Lindner et al. Transfusion Medicine and Hemotherapy, 2010]. Problem ten zauważa także Pan mgr Paweł Czubak. Pewną niedogodnością w badaniach z użyciem tych komórek jest ich fenotypowe zróżnicowanie w zależności od miejsca i sposobu izolacji MSCs, a przede wszystkim warunków hodowli in vitro. Dlatego w swojej pracy Doktorant posłużył się komercyjnie dostępną linią ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych MSC-001F (Bone Marrow Stromal Cells). Co zadecydowało o wyborze tej właśnie linii? Dostępna jest również inna linia - PCS (ATCC, Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells). W dalszej części Wstępu Pan mgr Paweł Czubak zwięźle opisuje sposoby leczenia cukrzycy typu 1, uwzględniając także możliwości pozyskiwania funkcjonalnych komórek β in vitro lub prób pobudzenia mało aktywnych komórek trzustki in vivo. Najszerzej opisana jest droga otrzymywania trzustkowych komórek β z mezenchymalnych komórek macierzystych poddanych właściwemu różnicowaniu in vitro. Problemem jest jednak pozyskanie takich komórek, które produkowałyby i wydzielały insulinę w stopniu porównywalnym do zdrowej trzustki. Na końcu Doktorant podkreśla, iż pomimo oczywistych zalet, istotne są także zagrożenia wynikające z wykorzystania w terapii komórek macierzystych. W treści Wstępu nie znalazłam odniesienia do Ryciny 1. Przedstawiony w formie opisowej Cel pracy zawiera uzasadnienie podjętych badań oraz jasno wyznaczone zadania do wykonania. Rozdział Materiały i Metody został opracowany starannie i zredagowany w sposób umożliwiający powtórzenie każdego doświadczenia. Mam jednak dwie drobne uwagi: a) warto podać model mikroskopu, którego użyto do wykonania zdjęć, b) przy oznaczaniu poziomu peptydu C metodą ELISA brakuje informacji o czułości testu (minimalne wykrywane stężenie). Ogólnie nie mam większych zastrzeżeń co do wyboru rodzajów testów 2

3 statystycznych do analizy wyników stosowną uwagę umieściłam przy okazji oceny rozdziału Wyniki. Pan mgr Paweł Czubak dokumentuje w tym miejscu znajomość wielu technik; umiejętność pracy z hodowlami komórkowymi, metod immunoenzymatycznych, cytometrycznych, molekularnych oraz mikroskopii. Zaplanowanie badań oraz ich metodyczne zróżnicowanie wskazuje na rzetelność naukową Doktoranta. Wyniki przedstawione zostały w logicznym porządku; opis morfologicznych zmian mezenchymalnych komórek macierzystych poddanych różnicowaniu oraz badanie efektów tego różnicowania w postaci określenia zdolności komórek do produkcji i wydzielania insuliny. Do różnicowania komórek Pan mgr Paweł Czubak wykorzystał protokół Sun i wsp. (2007) z modyfikacją własną polegającą na zmianie stężeń czynników wzrostu. Zmiany morfologiczne komórek poddanych działaniu różnych stężeń czynników wzrostu zostały udokumentowane za pomocą zdjęć (w opisie rycin brakuje wskazania powiększenia zdjęcia). Następnie sprawdzono, czy tak zróżnicowane komórki zdolne są do wytwarzania insuliny. W tym celu Doktorant posłużył się trzema metodami; mikroskopową (barwienie Ditizonem), cytometryczną (wewnątrzkomórkowe oznaczanie poziomu insuliny) oraz qrt-pcr (ocena poziomu ekspresji mrna dla insuliny) wszystkie potwierdziły tę właściwość zróżnicowanych komórek MSC. Ze względu na to, iż założonym celem i kluczowym efektem różnicowania komórek macierzystych było wytwarzanie przez nie insuliny, bardzo pochwalam zastosowanie przez Doktoranta trzech niezależnych metod świadczy to o Jego rzetelnym podejściu do badań naukowych. Ostatnim etapem było sprawdzenie, czy wytworzona insulina jest wydzielana do środowiska komórek. Jednak zamiast badania poziomu insuliny Pan mgr Paweł Czubak zdecydował o pomiarze peptydu C, białka uwalnianego w procesie wytwarzania insuliny, ale znacznie dłużej od niej pozostającego w krążeniu. Uzyskane wyniki nie potwierdziły zdolności zróżnicowanych komórek macierzystych do wydzielania tego białka, a co za tym idzie insuliny. Jednak jak zauważa Autor w Dyskusji, taki wynik nie był zaskoczeniem. Wyniki eksperymentów zostały przedstawione w postaci tabel oraz wykresów, w tym bezpośrednio implementowanych z programu statystycznego STATISTICA. Zastosowanie różnych programów do obliczeń statystycznych, jak również do graficznej prezentacji wyników także uważam za duży plus tej pracy. Mam jednak pewne wątpliwości co do słuszności zastosowania testu t studenta w celu wykazania różnic statystycznie istotnych podczas porównania wielu grup niezależnych. Istotność testu jednorodności wariancji Browna-Forsythe a słusznie sugerowała użycie nieparametrycznego testu Kruskala-Wallisa (pomimo normalnego rozkładu danych test W Shapiro-Wilka). Istotny statystycznie wynik testu Kruskala-Wallisa informuje o istnieniu różnic pomiędzy grupami, zaś w celu sprawdzenia pomiędzy którymi grupami, należy przeprowadzić jeszcze porównania wielokrotne, ale nie na zasadzie każdy z każdym lecz z wykorzystaniem tzw. testów post-hoc. W tym przypadku należałoby raczej użyć testu post- 3

4 hoc Dunn a. Ponadto, liczebność grup może decydować o zastosowaniu odpowiedniej poprawki. Dyskusję rozpoczyna rozważanie dotyczące różnych metod różnicowania komórek macierzystych w komórki wysp trzustkowych. Przedstawiane w piśmiennictwie rezultaty Autor konfrontuje z wynikami własnymi. Okazuje się, iż o wydajności metody różnicowania (czyli uzyskania odpowiednio wysokiego odsetka komórek produkujących insulinę) decyduje źródło pozyskiwania komórek MSC oraz warunki hodowli, w tym rodzaj i stężenie suplementów. Po początkowych próbach adaptowania protokołu Sun i wsp. Doktorant zdecydował o jego modyfikacji. Efektem było poprawienie wydajności różnicowania komórek MSC. Jednak jak dyskutuje Pan mgr Paweł Czubak, ta wydajność wciąż jest niezadowalająca, gdyż nie zapewnia ilości komórek wystarczających do transplantacji, a co za tym idzie podjęcia w organizmie pacjenta produkcji insuliny na oczekiwanym poziomie. Studiując literaturę można zauważyć, iż problem ten podkreślają także inni eksperci. Muszę podkreślić, iż Autor bardzo logicznie łączy ze sobą wyniki analiz i rozważa je na tle piśmiennictwa. Jednocześnie nie jest przy tym wolny od uwag krytycznych, co dobrze rokuje na Jego naukową przyszłość. Jasno sformułowane Wnioski odpowiadają na wyznaczone cele pracy. Za najbardziej interesujące uważam optymalizację warunków różnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych zdolnych do wytwarzania insuliny. Mogę jedynie czuć lekki niedosyt, iż nie udało się skłonić komórek również do jej wydzielania, ale z drugiej strony, może być to kolejne wyzwanie dla Autora przedstawionej rozprawy. Bibliografia obejmuje 107 pozycji, w przeważającej części prac anglojęzycznych z okresu Najnowsze piśmiennictwo ( ) stanowi ok. 35% przedstawionych pozycji. Ocena strony edytorskiej rozprawy Cała rozprawa została napisana poprawnym językiem polskim, chociaż Doktorant nie ustrzegł się przed kilkoma drobnymi błędami typograficznymi. Klarowny podział na rozdziały i podrozdziały oraz nie nadużywanie terminologii naukowej powoduje, iż praca może być dobrze odebrana przez szersze grono odbiorców. Podsumowanie recenzji Przedstawiona mi do recenzji praca stanowi oryginalne opracowanie dotyczące niezmiernie ważnego problemu pozyskiwania komórek zdolnych do wytwarzania insuliny, a w dalszej perspektywie możliwości wykorzystania tej wiedzy do opracowania protokołu leczenia pacjentów z cukrzycą typu 1 (przeszczep autogeniczny). W swojej pracy Doktorant zaprezentował zróżnicowany warsztat metodyczny, co podnosi wiarygodność uzyskanych wyników. Pragnę zauważyć, iż prezentowane wyniki zostały już częściowo opublikowanie w Journal of Diabetes Research (2014, IF 2.164). 4

5 5