Wykład 7 Biotechnologie otrzymywania aminokwasów, witamin i polisacharydów

Transkrypt

1 Aminokwasy Ideogram kombu Bakterie Corynebacterium glutamicum Początki biotechnologii wytwarzania aminokwasów Japonia, 1957 wyizolowanie biotyno-zależnej bakterii C. glutamicum produkującej L-glutaminian

2 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA Aminokwasy Aminokwasy białkowe

3 Aminokwasy Aminokwasy endo- i egzogenne dla człowieka i świnki morskiej Endogenne Warunkowo egzogenne* Egzogenne Alanina Asparagina Asparaginian Glutaminian Seryna Arginina Cysteina Glutamina Glicyna Prolina Tyrozyna Histydyna Izoleucyna Leucyna Metionina Fenyloalanina Treonina *w okresie niemowlęcym i w niektórych stanach chorobowych Tryptofan Walina

4 Aminokwasy Rynkowy obrót aminokwasami Zależność między wielkością produkcji a ceną aminokwasów

5 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Aminokwasy Produkcja i zastosowanie najważniejszych aminokwasów TECHNOLOGIA CHEMICZNA Skala produkcji (tony/rok) Aminokwas Metoda wytwarzania Główne zastosowanie Kwas L glutaminowy L lizyna D,L metionina L treonina Glicyna Kwas L asparaginowy L fenyloalanina L cysteina L cystyna L arginina L alanina L tryptofan L leucyna L walina L izoleucyna Fermentacja Fermentacja Synteza chemiczna Fermentacja Synteza chemiczna Kataliza enzymatyczna Fermentacja Redukcja cystyny, fermentacja Ekstrakcja, fermentacja Fermentacja, ekstrakcja Fermentacja, ekstrakcja Fermentacja Fermentacja, ekstrakcja Fermentacja, ekstrakcja Fermentacja, ekstrakcja Polepszacz smaku Dodatek do pasz Dodatek do pasz* Dodatek do pasz Dodatek do żywności, słodzik Aspartam, polimery Aspartam Dodatek do żywności, farmaceutyki Cysteina, farmaceutyki Farmaceutyki Słodzik, element budulcowy Pasze, farmaceutyki Farmaceutyki Pestycydy, farmaceutyki Farmaceutyki *pasze sojowe są ubogie w niektóre egzogenne aminokwasy, w tym L-Met i L-Lys

6 Aminokwasy Szczepy bakteryjne produkujące aminokwasy są genetycznie zmodyfikowane Nadprodukcję aminokwasów można osiągnąć dzięki: -zwiększeniu przepuszczalności błony cytoplazmatycznej - zmianom preferencji metabolicznych (zmiana kierunku syntezy w punktach rozgałęzienia szlaków - dodatek prekursorów -zmianę aktywności enzymów w obrębie szlaku biosyntezy - zastosowanie mutantów auksotroficznych i regulatorowych - konstrukcję szczepów metodami inżynierii genetycznej

7 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA Aminokwasy Kwas L-glutaminowy Producenci: Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum Cechy producentów: duża aktywność dehydrogenazy glutaminianowej wydajne reakcje anaplerotyczne mutanty o zwiększonej przepuszczalności błony Procedury indukujące wydzielanie L-glutaminianu: a) Hodowla w warunkach ograniczenia biotyny b) Dodatek penicyliny c) Dodatek lizozymu d) Dodatek środków powierzchniowo-czynnych e) Zastosowanie mutantów auksotroficznych wobec kwasu oleinowego i/lub glicerolu Schemat sposobu działania technik indukujących wydzielanie L-glutaminianu

8 Aminokwasy Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA Kwas L-glutaminowy Produkt fermentacji - sól amonowa L-glutaminianu Wyodrębnianie: - oddzielenie komórek bakteryjnych - przepuszczenie roztworu przez kolumnę anionitową (uwolniony amoniak jest oddzielany przez destylację i zawracany do fermentacji) - wymywanie z żywicy jonowymiennej roztworem NaOH. Produkt w postaci glutaminianu monosodowego (MSG) Schemat przepływu materiałów w zakładzie produkującym L- glutaminian Japońskie zakłady Kyowa Hakko wytwarzające aminokwasy. Z prawej strony 7 fermentorów (240 m 3 każdy) do produkcji kwasu L-glutaminowego

9 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA Producent: Corynebacterium glutamicum Aminokwasy L-lizyna Szlak biosyntezy L-lizyny jest wieloetapowy. Dwa pierwsze etapy wspólne dla biosyntezy L-lizyny, L-treoniny, L-metioniny i L-izoleucyny. Szczepy producenckie mutanty ze zminimalizowaną biosyntezą konkurencyjną, posiadające białko eksportujące L-lizynę. Wydajność ponad 170 g L-lizyny z dm 3 pożywki. Skład pożywki: źródło węgla melasa, sacharoza lub hydrolizat skrobiowy; źródło azotu siarczan amonu lub amoniak; czynniki wzrostowe z roślinnych hydrolizatów białkowych Produkt fermentacji siarczan L-lizyny Wyodrębnianie produktu: - 98,5% chlorowodorek L-lizyny po zastosowaniu chromatografii jonowymiennej, zatężenia i krystalizacji - 50% roztwór alkaliczny L-lizyny po oddzieleniu biomasy, alkalizacji, filtracji i zatężeniu -granulowany preparat zawierający 50% siarczanu L-lizyny po suszeniu rozpyłowym brzeczki fermentacyjnej i granulacji

10 Aminokwasy L-tryptofan Możliwa metoda fermentacyjna, ale szerzej stosowana biokonwersja z użyciem mutanta E. coli o dużej aktywności syntazy tryptofanowej NH (CHOH) 2 CH 2 OP + O HOH 2 C COO - NH 3 + syntaza tryptofanowa COO - NH NH 3 +

11 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA Aminokwasy L-tryptofan Schemat przepływowy biosyntezy L-tryptofanu metodą biotransformacji z użyciem L-seryny otrzymywanej z melasy oraz indolu

12 Aminokwasy Kwas L-asparaginowy Wytwarzany metodą enzymatyczną z użyciem L-aspartazy przez japońską firmę Tanabe Seiyaku Co Ltd. H COOH NH 3 + C C HOOC H kwas fumarowy aspartaza COOH L H 2 N H CH 2 COOH kwas L-asparaginowy W procesie przemysłowym stosuje się komórki E. coli zawierające aktywną aspartazę, immobilizowane na usieciowanym κ-karagenie. Reakcja jest egzotermiczna, więc prowadzi się ją w kolumnach chłodzonych przeciwprądowo. Substrat roztwór fumaranu amonu. Produkt końcowy jest oczyszczany przez krystalizację. Przekrój bioreaktora kolumnowego stosowanego do produkcji kwasu L-asparaginowego

13 Witaminy

14 Witaminy Biosynteza i metabolizm witaminy D 3 Cholekalciferol reguluje metabolizm Ca(II) w nerkach, jelitach i kościach Niedobór witaminy D 3 u dzieci objawia się krzywicą

15 Witaminy Witamina A 1, jej prekursor i pochodne

16 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA Witaminy Wiele witamin otrzymywanych jest na drodze syntezy mikrobiologicznej Witamina A otrzymywane są prekursory: α-, β- iγ-karoten. Drożdże Rhodotorula gracilis, grzyby Blakeslea trispora, glony Chlorophyceae. Witamina D 2 kalciferol. Otrzymywana jest prowitamina ergosterol z drożdży piekarskich Saccharomyces cerevisiae. Witamina B 2 70% z biosyntezy. Producenci: Eremothecium ashbyii, Ashbya gossypii Witamina B 12 wyłącznie biosynteza. Bakterie fermentacji propionowej. Ideowy schemat produkcji witaminy B 2

17 Polisacharydy mikrobiologiczne Egzopolisacharydy produkowane jako metabolity wtórne i wydzielane pozakomórkowo) Obojętne: dekstran, skleroglukan, kurdlan, pululan Kwasowe: ksantan, gellan, alginian (głównie glony) Kolonie szczepu Pseudomonas mendocina produkujące alginian

18 Polisacharydy mikrobiologiczne Bakteryjne polisacharydy pozakomórkowe Ksantan wytwarzany przez Xanthomonas campestris Kudrlan wytwarzany przez Agrobacterium, Rhisobium Skleroglukan wytwarzany przez Sclerotium glucanium

19 Polisacharydy mikrobiologiczne Ksantan Wytwarzany przez Xantomonas campestris. Stosowany jako dodatek do żywności: żelujący, stabilizujący, nadający lepkość. Składnik farb wodorozcieńczalnych, środek smarujący i stabilizujący zawiesiny płuczek wiertniczych w przemyśle naftowym. Główny producent Kelco (USA) Dekstran glukan z wiązaniami głównie α(1 6). Wytwarzany przez enzym pozakomórkowy z Leuconostoc mesenteroides. Substrat sacharoza. Producent Pharmacia. Zastosowanie preparaty krwiozastępcze, adsorbent w opatrunkach, złoża chromatograficzne (m.in. Sephadex). Skleroglukan wytwarzany przez grzyby nitkowate Sclerotium. Rozpuszczalny w wodzie. Zastosowanie podobne jak ksantanu. Kurdlan - wytwarzany przez bakterie Alcaligenes faecalis var. myxogenes. Nierozpuszczalny w wodzie. Tworzy żele po podgrzaniu zawiesiny do 55 C. Środek żelujacy. Pululan glukan produkowany przez grzyb strzępkowy Aureobasideum pullulans. Do wyrobu folii biodegradowalnych

20 Polisacharydy mikrobiologiczne Produkcja polisacharydów hodowle okresowe, napowietrzane. Problemem jest wzrost lepkości zawiesiny podczas produkcji egzopolisacharydu. Schemat blokowy produkcji ksantanu

21 Oleje mikrobiologiczne Lipidy zapasowe mają strukturę triacylogliceroli

22 Oleje mikrobiologiczne Mikroorganizmy olejodajne wytwarzają i akumulują triacyloglicerole w ilościach przekraczających 20% suchej masy. Struktury różne, w tym z łańcuchami kwasów tłuszczowych nasyconych, nienasyconych, wielonienasyconych. Szczególnie cenne: γ-linolowy 18:3n-6 arachidonowy (ARA) 20:4n-6 dokozaheksaenowy (DHA) 22:6n-6 Mieszanka ARA i DHA w odżywkach dla niemowląt ARA i DHA nie występują w olejach roślinnych. Występują w olejach rybich, ale w towarzystwie kwasu eikozapentaenowego (EPA 20:5n-3), niekorzystnego dla niemowląt Wytwarzane przez drobnoustroje. Technologia izolacji musi zapewniać jak minimallizację procesów utleniania i rozkładu.

23 Oleje mikrobiologiczne Komórki drożdży Apiatrichium curvatum wytwarzające i magazynujące duże ilości lipidów

24 Oleje mikrobiologiczne

25 Oleje mikrobiologiczne Producenci olejów mikrobiologicznych bogatych w ARA głównie grzyby strzępkowe, w tym Mortierella alpina. Trzy firmy: Suntory Co. Ltd w Japonii, Wuhan Alking Bioengineering w Chinach oraz DSM Food Specialities we Włoszech (95% światowej produkcji). Producenci olejów mikrobiologicznych bogatych w DHA glony Crypthecodinium cohnii Oraz Schizochytrium (ten drugi zawiera też DPA 20:5n-6). Firmy: Martek Biosciences i Omega Tech Inc. z USA. Wykorzystywane szczepy mogące rosnąć w pożywce o niskim zasoleniu.

26 Oleje mikrobiologiczne Proces akumulacji olejów w mikroorganizmach olejodajnych w hodowli okresowej

27 Oleje mikrobiologiczne Schemat przedstawiający etapy procesu fermentacyjnego stosowanego do produkcji olejów mikrobiologicznych. Komórki po usunięciu ich z fermentora produkcyjnego są zbierane, suszone i na końcu ekstrahowane heksanem w celu oddzielenia oleju. Heksan usuwany przez destylację z parą wodną. Dalsza obróbka: RBD (rafinacja-odbarwianie-odwanianie) Minimalizacja degradacji szybkie przetwarzania, przechowywanie oleju i biomasy w niskiej temperaturze i atmosferze azotu. Końcowy produkt olej żółty (obecność karotenoidów) o przyjemnym smaku i zapachu. Dodatek antyoksydantów n(p. witamina E).