Wp³yw surowic zawieraj¹cych przeciwcia³a przeciw cytoplazmie granulocytów obojêtnoch³onnych (ANCA) na czynnoœæ granulocytów in vitro

Transkrypt

1 Alergia Astma Immunologia, 1999, 4(4), Wp³yw surowic zawieraj¹cych przeciwcia³a przeciw cytoplazmie granulocytów obojêtnoch³onnych (ANCA) na czynnoœæ granulocytów in vitro MARIUSZ PUSZCZEWICZ, IRENA ZIMMERMANN-GÓRSKA, GRA YNA BIA KOWSKA-PUSZCZEWICZ Klinika Reumatologiczno-Rehabilitacyjna Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, ul. Przybyszewskiego 49, Poznañ Patogeneza zmian zapalnych w naczyniach w przebiegu chorób zwi¹zanych z autoimmunizacj¹ nie jest w pe³ni poznana. Istotn¹ rolê w powstaniu tych zmian odgrywaj¹ granulocyty obojêtnoch³onne. Równoczeœnie u czêœci chorych mo na wykazaæ obecnoœæ przeciwcia³ przeciw cytoplazmie granulocytów obojêtnoch³onnych (ANCA). Celem pracy by³a próba oceny udzia³u ANCA w patogenezie zmian zapalnych w naczyniach poprzez ich wp³yw na czynnoœæ granulocytów. Materia³ stanowi³o 3 surowic zawieraj¹cych ANCA od chorych na guzkowe zapalenie têtnic, ziarniniak Wegenera, podostre k³êbuszkowe zapalenie nerek, reumatoidalne zapalenie stawów z towarzysz¹cymi zmianami o charakterze zapalenia naczyñ. Granulocyty obojêtnoch³onne izolowano od zdrowych dawców krwi na Gradisolu G. Typ ANCA oceniano metod¹ immunoenzymatyczn¹ ELISA i metod¹ poœredniej immunofluorescencji wg A.Wiik a. Badania czynnoœci granulocytów wykonywano po ich inkubacji z surowicami zawieraj¹cymi ANCA lub z surowicami autologicznymi. Obejmowa³y one: 1. swobodn¹ migracjê i chemotaksjê w komorach Boyden a, 2. fagocytozê i zabijanie wewn¹trzkomórkowe metod¹ fluorochromow¹ wg Pantazisa i Knikera. Przeprowadzone badania wykaza³y wy sze wartoœci zdolnoœci fagocytarnej granulocytów inkubowanych z surowicami zawieraj¹cymi ANCA (9.14±.64) w porównaniu z grup¹ kontroln¹ (4.76±.82). Wartoœci zabijania wewn¹trzkomórkowego, swobodnej migracji oraz chemotaksji nie ró ni³y siê w porównaniu z grup¹ kontroln¹. Wyniki te wskazuj¹ na wzrost zdolnoœci fagocytarnej pod wp³ywem surowic zawieraj¹cych ANCA. Pobudzone granulocyty mog¹ uszkadzaæ œródb³onek naczyñ poprzez wolne rodniki oraz enzymy ziarnistoœci wewn¹trzkomórkowych, uwalniane podczas aktywacji. W konsekwencji mo e dochodziæ do zapocz¹tkowania lub nasilenia tocz¹cego siê procesu zapalnego w obrêbie naczynia krwionoœnego. S³owa kluczowe: ANCA; granulocyty; guzkowe zapalenie têtnic; ziarniniak Wegenera; podostre k³êbuszkowe zapalenie nerek; reumatoidalne zapalenie stawów Spoœród komórek bior¹cych udzia³ w procesie zapalnym, granulocyty obojêtnoch³onne jako pierwsze migruj¹ do miejsca urazu. Wykazuj¹ one zdolnoœæ do migracji, chemotaksji, adhezji, fagocytozy i zabijania wewn¹trzkomórkowego (tworzenie wolnych rodników tlenowych i uwalnianie enzymów z ziarnistoœci pierwotnych i wtórnych). Granulocyty obojêtnoch³onne posiadaj¹ trzy typy ziarnistoœci, tj. azurofilne (pierwotne), specyficzne (wtórne) i trzeciorzêdowe. Ziarnistoœci azurofilne zawieraj¹ kwaœne hydrolazy, mieloperksydazê, proteinazy serynowe (elastaza, katepsyna G) oraz defensyny. Lizozym jest obecny zarówno w ziarnistoœciach azurofilnych jak i w ziarnistoœciach specyficznych. Innymi enzymami ziarnistoœci wtórnych s¹: laktoferryna, kolagenaza oraz bia³ka wi¹ ¹ce witaminê B 12. Ziarnistoœci trzeciorzêdowe zawieraj¹ jedynie elatynazê. Sk³adowe b³ony komórkowej, cytoplazmy i j¹dra komórkowego, a tak e enzymy zawarte w ziarnistoœciach granulocytów obojêtnoch³onnych mog¹ staæ siê autoantygenami dla przeciwcia³ wytwarzanych w ró nych jednostkach chorobowych. W roku 1985 Van der Woude i wsp. [1] wykazali w surowicy chorych z ziarniniakiem Wegenera obecnoœæ przeciwcia³ reaguj¹cych z cytoplazm¹ granulocytów obojêtnoch³onnych zdrowych dawców krwi i nazwali je Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA). Wdalszych badaniach okaza³o siê, e ANCA pojawiaj¹ siê tak e w innych zespo³ach zwi¹zanych z zapaleniem naczyñ. Obecnie rozró nia siê dwa typy ANCA okreœlone na podstawie badañ immunofluorescencji poœredniej z zastosowaniem granulocytów obojêtnoch³onnych utrwalonych w alkoholu etylowym: C-ANCA (cytoplasmic typ cytoplazmatyczny) oraz P-ANCA (perinuclear typ oko³oj¹drowy). C-ANCA wi¹ ¹ siê g³ównie z proteinaz¹ 3 (29KD proteinaz¹ serynow¹) znajduj¹c¹ siê w ziarnistoœciach azurofilnych (PR-3 ANCA), natomiast P-ANCA reaguj¹ g³ównie z natywn¹ mieloperoksydaz¹ zawart¹ równie w ziarnistoœciach azurofilnych granulocytów [2]. Przeciwcia³a przeciw cytoplazmie granulocytów obojêtnoch³onnych towarzysz¹ niektórym chorobom tkanki ³¹cznej ze wspó³istniej¹cymi zmianami w naczyniach. Dla

2 26 Alergia Astma Immunologia, 1999, 4(4), ziarniniaka Wegenera charakterystyczne s¹ C-ANCA [1]. Pojawienie siê ANCA w surowicy poprzedza objawy kliniczne ziarniniaka Wegenera [1,3]. W przebiegu guzkowego zapalenia têtnic (postaæ z zajêciem ma³ych naczyñ) obserwuje siê obecnoœæ P-ANCA skierowane przeciw mieloperoksydazie u oko³o 8% chorych [4,5]. Tê sam¹ swoistoœæ ANCA wykazuj¹ w przebiegu gwa³townie postêpuj¹cego k³êbuszkowego zapalenia nerek oraz zespo³u Churg-Strauss. Obecnoœæ przeciwcia³ P-ANCA wykazano równie w surowicy 11% chorych na wrzodziej¹ce zapalenie jelita grubego. Reagowa³y one swoiœcie z katepsyn¹ G i laktoferryn¹ [6]. U chorych na toczeñ uk³adowy wystêpuj¹ w 2% przypadków P-ANCA. Ich swoistoœæ jest zwi¹zana z elastaz¹ i laktoferryn¹, a tak e lizozymem i mieloperoksydaz¹ [7]. W przebiegu reumatoidalnego zapalenia stawów, szczególnie wówczas, gdy obecne s¹ objawy zapalenia naczyñ (vasculitis rheumatoidea), mo na w oko³o 2% przypadków wykryæ w surowicy P-ANCA skierowane przeciwko katepsynie G i lizozymowi. Mulder i wsp. [8] u chorych na reumatoidalne zapalenie stawów wykazali obecnoœæ P-ANCA o swoistoœci zwi¹zanej z laktoferryn¹. Zale noœæ powstania zmian zapalnych w naczyniach i obecnoœci przeciwcia³ przeciw cytoplazmie granulocytów obojêtnoch³onnych nie zosta³a dotychczas poznana. Badania prowadzone in vitro przemawiaj¹ za mo liwoœci¹ udzia³u tych przeciwcia³ w procesie zapalnym wywo³anym przez wp³yw na granulocyty obojêtnoch³onne. Mechanizm omawianego zjawiska i jego powi¹zanie z mediatorami reakcji zapalnej i innymi czynnikami w ustroju pozostaje do wyjaœnienia. Celem pracy by³o wykazanie, czy surowice zawieraj¹ce ANCA wywieraj¹ wp³yw na czynnoœæ granulocytów obojêtnoch³onnych. Aktywacja granulocytów przez te surowice mog³aby wskazywaæ na udzia³ ANCA w indukcji procesu zapalnego w naczyniach w przebiegu chorób naczyñ. MATERIA I METODY Materia³ Granulocyty obojêtnoch³onne: Do badañ wykorzystano granulocyty obojêtnoch³onne, 3 zdrowych dawców krwi obwodowej, izolowane na Gradisolu G wg Zemana i wsp. [27]. Surowice: Do badañ wykorzystano 3 surowic zawieraj¹cych przeciwcia³a przeciw cytoplazmie granulocytów obojêtnoch³onnych. Surowice pochodzi³y od 15 chorych z ziarniniakiem Wegenera (ZW), 6 chorych na reumatoidalne zapalenie stawów (RZS), ze wspó³istniej¹cymi zmianami o charakterze zapalenia naczyñ, 6 chorych na guzkowe zapalenie têtnic (PAN) i 3 chorych na podostre k³êbkowe zapalenie nerek (PKZN). Jako kontrolê wykorzystano surowicê pochodz¹c¹ od 3 zdrowych dawców krwi. Ocena typu przeciwcia³ przeciw cytoplazmie granulocytów obojêtnoch³onnych Oceny typu ANCA dokonywano za pomoc¹ metody immunofluorescencji poœredniej oraz immunoenzymatycznej metody ELISA. Metoda immunofluorescencji poœredniej Granulocyty obojêtnoch³onne od zdrowych dawców krwi izolowano wed³ug metody Hoier-Madsen M. i wsp. [9]. Nastêpnie wykonywano z nich rozmazy i utrwalano 96% alkoholem etylowym w temperaturze 4 o C przez 5 minut oraz aldehydem mrówkowym. Na preparaty granulocytów obojêtnoch³onnych nak³adano badane surowice rozcieñczone w stosunku geometrycznym. Po 3 minutach preparaty przep³ukiwano i inkubowano z królicz¹ immunoglobulin¹ znakowan¹ izotiocyjanianem fluoresceiny skierowan¹ przeciw ludzkiej IgG, IgM. Ponownie przep³ukiwano je po 3 minutach inkubacji. Tak przygotowane preparaty oceniano w mikroskopie fluorescencyjnym (JenaMed, Niemcy) w obiektywie immersyjnym 1. Metoda immunoenzymatyczna ELISA wg A.Wiika [1] Antygen u yty w metodzie ELISA izolowano wg N.Borregaard a [11]. Mikrop³ytkê op³aszczano 1 µl antygenu na studzienkê rozpuszczonego w buforze op³aszczaj¹cym. Zawartoœæ bia³ka w przypadku proteinazy-3 wynosi³a 56 µg/ml, a mieloperoksydazy 1 mg/ml. Optymalne rozcieñczenie dla mieloperoksydazy wynosi³o 1:5, a dla proteinazy 3 1:15. P³ytkê inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Nastêpnie przep³ukiwano buforem p³ucz¹cym i pozostawiano do wyschniêcia. Surowice kontrolne, standardowe oraz surowice badane rozcieñczano w buforze do inkubacji i nak³adano na mikrop³ytkê. Ca³oœæ pozostawiano na 6 min., ponownie przep³ukiwano i nak³adano królicz¹ immunoglobulinê znakowan¹ fosfataz¹ zasadow¹ skierowan¹ przeciw ludzkiej IgG, IgM. Po 6 minutach inkubacji preparatem, trzykrotnie przep³ukiwano i nak³adano mieszankê substratow¹ zawieraj¹c¹ PNP (fosforan p.-nitrofenolowy). Ponownie inkubowano przez 6 min. i odczytywano absorbancjê przy d³ugoœci fali 45 nm przy u yciu czytnika ELISA (Titrek Uniscan). Za wynik dodatni uznawano trzykrotnie wy sze wartoœci absorbancji w porównaniu z wykazan¹ dla kontroli ujemnej. Wartoœæ absorbancji ujemnej by³a ni sza od.2 zaœ dla dodatniej wartoœci te by³y wy sze od.4. Ocena czynnoœci granulocytów obojêtnoch³onnych Granulocyty obojêtnoch³onne izolowano z krwi obwodowej zdrowych dawców. Nastêpnie oznaczano liczbê komórek w komorze Bürkera oraz ich ywotnoœæ

3 Puszczewicz M. i wsp. Wp³yw surowic zawieraj¹cych przeciwcia³a przeciw cytoplazmie... przy u yciu b³êkitu trypanu. Wydajnoœæ izolacji wynosi³a 97%, a odsetek martwych komórek nie przekracza³ 8%. Zawiesinê granulocytów obojêtnoch³onnych w iloœci 1x1 6 komórek/ml inkubowano przez 2 minut z surowicami zawieraj¹cymi ANCA, w stosunku objêtoœciowym 1:2. Wykorzystywano wy³¹cznie surowice, w których miano ANCA wynosi³o 1:16. Jako kontroli u ywano zawiesiny granulocytów w iloœci komórek/ml inkubowanych z surowicami autologicznymi tak e w stosunku 1:2. Badania czynnoœci granulocytów wykonywano przed up³ywem 2 godzin od momentu ukoñczenia izolacji. Ka de badanie przeprowadzano trzykrotnie, a uzyskane wyniki stanowi³y œredni¹ z trzech pomiarów. Badania zdolnoœci fagocytarnej i bakteriobójczej granulocytów Wykorzystano mikrometodê fluorochromow¹ wg Pantazisa i Knikera [12] we w³asnej modyfikacji. Zawiesinê granulocytów ( kom.) nak³adano na szkie³ko nakrywkowe i inkubowano przez 3 min. w komorze wilgotnej. Po inkubacji nieprzywieraj¹ce komórki sp³ukiwano p³ynem Hanksa. Na tak przygotowane preparaty nak³adano zawiesinê bakterii (Staphylococcus aureus szczep ATTC 25923) i ponownie inkubowano. Po 9 min. sp³ukiwano niesfagocytowane bakterie i barwiono.1% roztworem oran u akrydyny. Nastêpnie szkie³ko nakrywkowe umieszczano na szkie³ku podstawowym. Preparat oceniano w mikroskopie fluorescencyjnym pod obiektywem 1. W œwietle mikroskopu fluorescencyjnego, granulocyty wykazywa³y obecnoœæ sfagocytowanych bakterii zabarwionych na kolor zielony ( ywe) lub czerwony (martwe). WskaŸnik fagocytozy okreœlano zliczaj¹c sumê czerwonych i zielonych bakterii na 1 granulocytów obojêtnoch³onnych. Zdolnoœæ bakteriobójcz¹ zaœ jako stosunek liczby martwych bakterii do liczby martwych i ywych bakterii. 261 mikrometrycznej. By³y to komórki, które przesz³y przez filtr. Oceniano 1 kolejnych pól, a wynik podawano jako œredni¹ liczbê granulocytów przypadaj¹c¹ na 1 mm 2. Obliczenia statystyczne Uzyskane w czêœci doœwiadczalnej wyniki poddano analizie statystycznej. Analizê rozk³adu uzyskanych danych przeprowadzono za pomoc¹ testu Ko³mogorowa-Smiernowa. Poniewa w przypadku chemiluminescencji oraz zdolnoœci bakteriobójczej granulocytów stwierdzono brak normalnoœci rozk³adu, nie zastosowano testu t-studenta dla zmiennych niepowi¹zanych. Ocenê ró nic miêdzy wynikami w poszczególnych grupach przeprowadzono za pomoc¹ testu nieparametrycznego Manna-Whitney a. WYNIKI Typ przeciwcia³ przeciw cytoplazmie granulocytów obojêtnoch³onnych Metod¹ immunofluorescencji poœredniej w surowicach 15 chorych z ziarniniakiem Wegenera wykazano obecnoœæ C-ANCA. U pozosta³ych 15 chorych, tj. u 6 z guzkowym zapaleniem têtnic, 6 na reumatoidalne zapalenie stawów i 3 na podostre k³êbuszkowe zapalenie nerek, wykazano przeciwcia³a P-ANCA (tab. 1). Metod¹ immunoenzymatyczn¹ ELISA stwierdzono, e wszystkie badane surowice reagowa³y z antygenem uzyskanym w wyniku izolacji α-ziarnistoœci. Dalsza ocena wykaza³a, e u 15 chorych z ziarniniakiem Wegenera, ANCA reagowa³y z proteinaz¹-3, zaœ 9 chorych z PAN i PKZN z mieloperoksydaz¹. Pozosta³e przeciwcia³a (chorych z RZS) reagowa³y z innymi antygenami (tab. 1). Wartoœci absorbancji badanych Tabela I. Ocena obecnoœci ANCA metod¹ immunofluorescencji poœredniej i ELISA Swobodna migracja i chemotaksja granulocytów oceniana w komorach Boyden a Przedzia³y komór podzielono filtrem nitrocellulozowym o œrednicy porów 5 µm (Sartorius GmbH, Niemcy). Dolny przedzia³ nape³niano buforowanym roztworem soli fizjologicznej dla oceny swobodnej migracji i 1% zawiesin¹ op³aszczonego zymosanu dla oceny chemotaksji. W górnym przedziale umieszczano zawiesinê granulocytów (1 1 6 komórek) preinkubowanych z odpowiednimi surowicami. Po 6 min. inkubacji usuwano filtry dok³adnie przep³ukiwano i barwiono.1% roztworem oran u akrydyny. Nastêpnie filtry umieszczano na szkie³ku podstawowym i oceniano przy u yciu mikroskopu fluorescencyjnego pod obiektywem 5. Liczbê komórek okreœlano na powierzchni 1 mm 2 przy u yciu skali ANCA Z.W. PAN RZS PKZN n=15 n=6 n=6 n=3 Typ ANCA C-ANCA P-ANCA Antygen alfa-ziarnist MPO PR Inne ZW - ziarniniak Wegenera PAN - guzkowe zapalenie têtnic RZS - reumatoidalne zapalenie stawów PKZN - podostre k³êbkowe zapalenie nerek MPO - mieloperoksydaza PR-3 - proteinaza-3

4 262 Alergia Astma Immunologia, 1999, 4(4), surowic analizowane przy d³ugoœci fali 45 nm by³y wy sze ni.4, uzyskany zakres wartoœci dla badanych surowic wynosi³ od.648 do Rycina 1 przedstawia rozk³ad wartoœci absorbancji dla poszczególnych antygenów, z którymi reagowa³y ANCA. 1 8 p<.1 absorbancja 45 nm MPO PR-3 inne zdrowi dawcy Ryc. 1. Rozk³ad wartoœci absorbancji dla poszczególnych antygenów reaguj¹cych z ANCA Zdolnoœæ fagocytarna i bakteriobójcza granulocytów obojêtnoch³onnych Œrednia wartoœæ wskaÿnika fagocytozy gronkowca z³ocistego przez granulocyty inkubowane z surowicami zawieraj¹cymi ANCA wynosi³a 9.14±.64, a inkubowane z surowicami autologicznymi 4.8±.77 (ryc. 2). WskaŸnik fagocytozy dla granulocytów inkubowanych z surowicami zawieraj¹cymi ANCA by³ statystycznie znamiennie wy szy w porównaniu z grup¹ kontroln¹ (p<.1). Œrednia wartoœæ wskaÿnika fagocytozy dla granulocytów inkubowanych z surowicami zawieraj¹cymi MPO-ANCA wynosi³a 9.5±.81, z PR-3 ANCA wynosi³a 9.19±.63, a z surowicami chorych na RZS 9.13±.42. Nie wykazano ró nic statystycznie znamiennych pomiêdzy wartoœciami wskaÿnika fagocytozy dla granulocytów inkubowanych z poszczególnymi typami ANCA. Zdolnoœæ bakteriobójcza granulocytów inkubowanych z surowicami zawieraj¹cymi ANCA wynosi³a œrednio 96.7±1.95 a z surowicami autologicznymi 95.66±2.51 (ryc. 3). Uzyskane wyniki nie wykazywa³y ró nic statystycznie znamiennych. Zdolnoœæ bakteriobójcza granulocytów inkubowanych z surowicami zawieraj¹cymi MPO-ANCA wynosi³a 97.22±1.39, z PR-3 ANCA 96.26±2.31 a inkubowanych z surowicami zawieraj¹cymi ANCA reaguj¹cymi z innymi antygenami wynosi³a 97.±1.67. Nie wykazano tak e ró nic statystycznie znamiennych pomiêdzy wartoœciami zabijania wewn¹trzkomórkowego przez granulocyty inkubowane z poszczególnymi typami ANCA. wskaÿnik fagocytozy kontrola grupa badana (bez ANCA) (z ANCA) (4.76 ±.82) (9.14 ±.64) Ryc. 2. Œrednie wartoœci wskaÿnika fagocytozy granulocytów obojêtnoch³onnych inkubowanych z surowicami autologicznymi i surowicami zawieraj¹cymi ANCA zdolnoœæ bakteriobójcza (%) kontrola grupa badana (bez ANCA) (z ANCA) (95.66 ± 2.51) (96.7 ± 1.95) Ryc. 3. Œrednie wartoœci zdolnoœci bakteriobójczej granulocytów obojêtnoch³onnych inkubowanych z surowicami autologicznymi i surowicami zawieraj¹cymi ANCA Swobodna migracja i chemotaksja Œrednia wartoœæ swobodnej migracji granulocytów inkubowanych z surowicami zawieraj¹cymi ANCA wynosi³a 2.32±.52 kom/mm 2, a inkubowanych z surowicami autologicznymi 2.13±.43 kom/mm 2 (ryc. 4). Uzyskane wyniki nie wykazywa³y ró nic statystycznie znamiennych. Swobodna migracja granulocytów inkubo-wanych z surowicami zawieraj¹cymi MPO-ANCA wynosi³a œrednio 2.67±.4 kom/mm 2, z zawieraj¹cymi PR-3 ANCA

5 swobodna migracja (kom./mm 2 ) Puszczewicz M. i wsp. Wp³yw surowic zawieraj¹cych przeciwcia³a przeciw cytoplazmie... kontrola grupa badana (bez ANCA) (z ANCA) (2.13 ±.43) (2.32 ±.52) Ryc. 4. Œrednie wartoœci swobodnej migracji granulocytów obojêtnoch³onnych inkubowanych z surowicami autologicznymi i surowicami zawieraj¹cymi ANCA 2.17±.52 kom/mm 2, a inkubowanych z surowicami od chorych na RZS 2.15±.5 kom/mm 2. Tak e w tym przypadku wyniki nie wykazywa³y ró nic statystycznie znamiennych. Œrednia wartoœæ chemotaksji granulocytów inkubowanych z surowicami zawieraj¹cymi ANCA wynosi³a 12.29±1.8 kom/mm 2, a z surowicami autologicznymi 12.4±1.54 kom/mm 2 (ryc. 5). Wartoœci chemotaksji nie ró ni³y siê w sposób statystycznie chemotaksja (kom//mm 2 ) kontrola grupa badana (bez ANCA) (z ANCA) (12.4 ± 1.54) (12.29 ± 1.8) Ryc. 5. Œrednie wartoœci chemotaksji granulocytów obojêtnoch³onnych inkubowanych z surowicami autologicznymi i surowicami zawieraj¹cymi ANCA 263 znamienny. Natomiast œrednia wartoœæ chemotaksji granulocytów inkubowanych z surowicami zawieraj¹cymi MPO-ANCA wynosi³a 13.3±1.31 kom/mm 2, z surowicami zawieraj¹cymi PR-3 ANCA 12.9±.71 kom/mm 2, zaœ inkubowanych z surowicami chorych na RZS wynosi³a 9.23±1.35 kom/mm 2. Wartoœci chemotaksji granulocytów inkubowanych z surowicami chorych na RZS, by³a statystycznie znamiennie ni sza (p<.1) w porównaniu do wartoœci uzyskanych dla MPO-ANCA i PR-3ANCA. DYSKUSJA Próbê odpowiedzi na pytanie czy wp³yw ANCA na granulocyty ma znaczenie w indukcji zapalenia naczyñ i jakie inne czynniki mog³yby braæ udzia³ w tym procesie podejmowa³o ostatnio wielu badaczy. Stwierdzono, e miano ANCA w surowicy chorych wykazuje korelacjê z aktywnoœci¹ procesu chorobowego w przebiegu ziarniniaka Wegenera, guzkowego zapalenia têtnic, podostrego k³êbkowego zapalenia nerek. Falk i wsp. [13] w badaniach in vitro wykazali, e frakcja IgG-ANCA i fragmenty Fab ANCA po uprzedniej aktywacji przez TNF-α wywo³uj¹ wzrost metabolizmu tlenowego granulocytów zdrowych dawców. Keogen i wsp. [14] przedstawili wyniki wskazuj¹ce na wzrost odpowiedzi chemiluminescencyjnej, niepobudzonych granulocytów pod wp³ywem fragmentów Fab ANCA. Pos³uguj¹c siê metod¹ chemiluminescencji zale nej od luminolu, we wczeœniejszych badaniach wykazaliœmy wy sze wartoœci natê enia chemiluminescencji granulocytów inkubowanych z surowicami zawieraj¹cymi ANCA w porównaniu do inkubowanych z surowicami autologicznymi. Podobne wyniki uzyskaliœmy oceniaj¹c metabolizm tlenowy testem redukcji b³êkitu nitrotetrazoliowego [15]. Charles i wsp. [16] wykazali, e przeciwcia³a skierowane przeciw sk³adowym ziarnistoœci wewn¹trzkomórkowych powoduj¹ tak e aktywacjê monocytów. Potwierdza to wczeœniejsze przypuszczenia, dotycz¹ce udzia³u monocytów w patogenezie zapaleñ naczyñ. Tak wiêc zarówno aktywowane granulocyty obojêtnoch³onne, jak i monocyty, mog¹ uszkadzaæ œcianê naczynia krwionoœnego, poprzez dzia³anie wolnych rodników oraz enzymów proteolitycznych uwalnianych podczas fagocytozy. Z aktywacj¹ granulocytów obojêtnoch³onnych wi¹ e siê tak e ich degranulacja i zdolnoœæ do fagocytozy. Enzymy zawarte w ziarnistoœciach pierwotnych i wtórnych wykazuj¹ dzia³anie bakteriobójcze. Falk i wsp. [13] przedstawili wyniki badañ wskazuj¹cych, e w supernatancie zawiesiny granulocytów inkubowanych z surowicami zawieraj¹cymi ANCA zwiêkszona jest aktywnoœæ β-glukuronidazy i N-acetylo-β-glukozamidazy. Stymulacja granulocytów do degranulacji przez MPO-ANCA by³a zale na od preaktywacji TNF-α.

6 264 Alergia Astma Immunologia, 1999, 4(4), Keogen i wsp. [14] potwierdzili te obserwacje. Z przytoczonych danych wynika, e pobudzone przez ANCA granulocyty obojêtnoch³onne uwalniaj¹ enzymy ziarnistoœci wewn¹trzkomórkowych, przyczyniaj¹c siê do uszkodzenia komórek œródb³onka naczyñ krwionoœnych. W procesie tym bior¹ równie udzia³ cytokiny; TNF-α nasila uwalnianie zawartoœci ziarnistoœci swoistych, a tak e degranulacjê jako odpowiedÿ na LTB4 i PAF. Natomiast Interleukina 8 (IL-8) produkowana przez monocyty oraz œródb³onek naczyñ wp³ywa na pobudzenie selektywnej degranulacji ziarnistoœci swoistych, szczególnie laktoferryny, przez co hamuje tworzenie rodnika hydroksylowego. Fagocytoza obcych dla ustroju cz¹steczek jest mo liwa dziêki istnieniu swoistych receptorów dla fragmentu Fc immunoglobulin i dla sk³adowych dope³niacza. Zdolnoœæ fagocytarna jest jedn¹ z najwa niejszych czynnoœci tych komórek. Zastosowana metoda fluorochromowa wg Pantazisa i Knikera dla oceny zdolnoœci fagocytarnej i bakteriobójczej granulocytów obojêtnoch³onnych zosta³a powszechnie zaakceptowana. W obecnych badaniach wykazano, e granulocyty inkubowane z surowicami zawieraj¹cymi ANCA mia³y wiêksz¹ zdolnoœæ do fagocytozy w porównaniu z inkubowanymi z surowicami autologicznymi. Przedstawione wczeœniej pobudzenie natê enia chemiluminescencji zale nej od luminolu, stymulowanej zymosanem jest poœrednim dowodem aktywacji fagocytozy. Keogen i wsp. [14] nie wykazali jednak wp³ywu fragmentów Fab ANCA na zdolnoœæ fagocytarn¹ granulocytów zdrowych dawców krwi. Natomiast we wczeœniejszych w³asnych badaniach [17] wykazano zwiêkszenie zdolnoœci granulocytów, pochodz¹cych od chorych na ziarniniaka Wegenera, do fagocytozy. Nale y przypuszczaæ, e aktywacja fagocytozy uzale niona jest tak e od innych czynników, do których nale ¹ przede wszystkim CRP [18], IL-1 [19], TNF-α [2]. Nastêpnym etapem w przebiegu fagocytozy jest po³¹czenie fagosomu z ziarnistoœciami wewn¹trzkomórkowymi w efekcie powstaje fagolizosom, w którym odbywa siê trawienie poch³oniêtego materia³u. Od tego procesu zale ne jest dzia³anie bakteriobójcze. Wobecnej pracy nie wykazano ró nic w zabijaniu wewn¹trzkomórkowym gronkowca z³ocistego przez granulocyty inkubowane z surowicami zawieraj¹cymi ANCA i surowicami autologicznymi. Wyniki te s¹ trudne do wyjaœnienia, gdy pobudzenie metabolizmu tlenowego powinno wi¹zaæ siê z aktywacj¹ zabijania wewn¹trzkomórkowego. Uczestniczy w nim g³ównie system zale ny od tlenu; powstaj¹ce produkty redukcji cz¹steczki tlenu, tj. rodnik hydroksylowy i kwas podchlorowy, wykazuj¹ silne w³aœciwoœci bakteriobójcze. Nale y przypuszczaæ, e istnieje czynnik hamuj¹cy zabijanie wewn¹trzkomórkowe przez granulocyty obojêtnoch³onne na drodze tlenowej i/lub beztlenowej. Mo liwe jest tak e, e ANCA poprzez wi¹zanie siê z enzymami ziarnistoœci wewn¹trzkomórkowych (MPO, PR-3, katepsyna G) hamuj¹ ich udzia³ w procesie likwidacji obcego czynnika. Ponadto ANCA lub inne czynniki zawarte w surowicy mog³yby wywieraæ wp³yw na lizozym, azurocydynê lub defensyny. W piœmiennictwie jednak brak jest danych na ten temat. Fagocytoza i zabijanie wewn¹trzkomórkowe przez granulocyty jest poprzedzone chemotaksj¹. Obejmuje ona szereg zjawisk, wœród których najbardziej istotne to wi¹zanie czynnika chemotaktycznego z receptorami na b³onie komórkowej, przekazywanie sygna³u i ukierunkowany ruch. Badania wp³ywu surowic zawieraj¹cych ANCA na chemotaksjê granulocytów, nie wykaza³y ró nic w porównaniu z grup¹ kontroln¹, gdy jako czynnika chemotaktycznego u yto opsonizowanego zymosanu. Keogan i wsp. [14] stwierdzili wy sze wartoœci chemotaksji komórek inkubowanych z Fab ANCA przy zastosowaniu nfmlp (n-formylo-metionylo-leucylofenyloalanina) jako chemoatraktanta. Natomiast nie stwierdzono ró nic, gdy u ywano opsonizowanego zymosanu. Niinaka i wsp. [21] badaj¹c granulocyty krwi obwodowej chorych na ziarniniaka Wegenera wykazali zaburzenia chemotaksji. Granulocyty tych chorych wykazywa³y mniejsz¹ zdolnoœæ do chemotaksji w porównaniu z komórkami izolowanymi od zdrowych dawców. Obecne badania wykaza³y jedynie zmniejszenie chemotaksji granulocytów inkubowanych z surowicami od chorych na reumatoidalne zapalenie stawów. Alastair i wsp. [22] badaj¹c chemotaksjê granulocytów zdrowych dawców inkubowanych z surowicami chorych na RZS wykazali równie os³abienie ukierunkowanego ruchu. Autorzy s¹dz¹, e przyczyn¹ tego zjawiska jest obecnoœæ czynnika reumatoidalnego oraz kompleksów immunologicznych, które s¹ fagocytowane w trakcie inkubacji, a wykorzystana podczas fagocytozy energia nie mo e byæ zu yta na chemotaksjê. W obecnych badaniach nie zaobserwowano tak e ró nic w swobodnej migracji zale nej od inkubacji z surowicami zawieraj¹cymi ANCA i surowicami autologicznymi. Wartoœci migracji granulocytów inkubowanych z surowicami zawieraj¹cymi ANCA nie ró ni³y siê od kontroli. Wyniki te zgodne s¹ z uzyskanymi przez Keogena i wsp. [14] w badaniach wp³ywu fragmentów Fab ANCA na migracjê komórek. Wykazanie, e surowice zawieraj¹ce ANCA pobudzaj¹ metabolizm tlenowy i fagocytozê granulocytów obojêtnoch³onnych jest dostatecznym wyt³umaczeniem udzia³u tych komórek w patogenezie zapaleñ naczyñ krwionoœnych. Istotnym tak e jest mechanizm oddzia³ywania surowic zawieraj¹cych ANCA na granulocyty obojêtnoch³onne. Falk i wsp. [13] uwa aj¹, e w trakcie aktywacji granulocytów dochodzi do ekspresji antygenów z ziarnistoœci azurofilnych, szczególnie mieloperoksydazy i proteinazy-3 na b³onê komórkow¹. Obecne w surowicy przeciwcia³a przeciw cytoplazmie granulocytów

7 Puszczewicz M. i wsp. Wp³yw surowic zawieraj¹cych przeciwcia³a przeciw cytoplazmie obojêtnoch³onnych mia³yby ³¹czyæ siê z tymi antygenami co prowadzi³oby do aktywacji granulocytów, a nastêpnie do uszkodzenia komórek œródb³onka naczyñ krwionoœnych. Natomiast Ewert i wsp. [23] wykazali, e mieloperoksydaza i proteinaza-3 s¹ obecne na powierzchni komórek œródb³onka. W wyniku tego œródb³onek naczyñ mo e bezpoœrednio staæ siê obiektem cytotoksycznego efektu przeciwcia³ przeciw cytoplazmie granulocytów obojêtnoch³onnych [24] oraz przeciwcia³ przeciw komórkom œródb³onka naczyñ. Nie mo na pomin¹æ tak e znaczenia limfocytów obecnych w ognisku zapalnym. Van der Woude i wsp. [25] wykazali, e pod wp³ywem ziarnistoœci azurofilnych granulocytów dochodzi do proliferacji limfocytów. Te zaœ s¹ zdolne do dalszego uwalniania cytokin o dzia³aniu prozapalnym oraz produkcji przeciwcia³. Natomiast Tomer Y. i wsp. [26] stwierdzili, e ANCA bezpoœrednio pobudzaj¹ limfocyty do przylegania do komórek œródb³onka naczyñ i w ten sposób do ich uszkodzenia. Dok³adne poznanie mechanizmu zapalenia naczyñ zale nego od dzia³ania ANCA wymaga dalszych wnikliwych badañ. Wyniki uzyskane w obecnej pracy wykazujê mo liwoœæ dzia³ania tych przeciwcia³ przy wspó³udziale innych czynników na czynnoœæ granulocytów uczestnicz¹cych w procesie zapalnym. Podsumowuj¹c nasz¹ pracê wykazaliœmy, e surowice zawieraj¹ce ANCA pobudzaj¹ zdolnoœæ fagocytarn¹ granulocytów obojêtnoch³onnych zdrowych dawców. Surowice zawieraj¹ce ANCA nie wykazuj¹ wp³ywu na zdolnoœæ bakteriobójcz¹ oraz migracjê i chemotaksjê granulocytów zdrowych dawców. Granulocyty aktywowane przez surowice zawieraj¹ce ANCA mog¹ uczestniczyæ w uszkodzeniu komórek œródb³onka naczyñ i zapocz¹tkowaniu lub nasileniu procesu zapalnego w ich obrêbie. Piœmiennictwo 1. Van der Woude F.J., Lobatto S., Van der Giessen M., Rasmussen N., Wiik A., Van Es L.A., Van der Hem G.K.: Autoantibodies against neutrophils and monocytes: Tool for diagnosis and marker of disease activity in Wegener s granulomatosis. Lancet 1985; 1: Jennette J.C., Falk R.J.: Antineutrophil cytoplasmic autoantibodies and associated diseases: a review. Am. J. Kidney Dis. 199; 6: Wiik A.: Antineutrophil cytoplasmic antibodies in Wegener s granulomatosis. Clin. Exp. Rheum. 1993; 11: Gross W.L., Hauschild S., Mistry N.: The clinical relevance of ANCA in vasculitis. Clin. Exp. Immunol. 1993; 93: Lockwood C.M., Jones S.J., Jayne D.R., Lai K.N.: ANCA and systemic vasculitis. Neth J. Med. 199; 36: Rump J.A., Scholmeirich J., Gross W., Roth M., Helfesrieder R., Rautmann A., Ludemann J., Grosss W.L., Peter H.H.: A new type perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibody (p-anca) in active ulcerative colitis but not in Crohn s disease. Immunobiol. 199; 181: Nassberger L., Sjoholm A.G., Jonsson H., Sturfelt G., Akesson A.: Autoantibodies against neutrophil cytoplasm components in systemic lupus erythematosus and in hydralazine induced lupus. Clin. Exp. Immunol. 199; 81: Mulder A.H., Horst G., van Leeuwen M.A., Limburg P.C., Kallenberg C.G.: Antineutrophil cytoplasmic antibodies in rheumatoid arthritis. Characterisation and clinical correlation. Arthritis Rheum. 1993; 36: Hoier-Madsen M., Rasmussen N., Wiik A.: Routine determination of anti-neutrophil cytoplasm antibodies (ANCA) by indirect immunofluorescence. APMIS 1989; 97 suppl.: Wiik A., Rasmussen N., Wislander J.: Methods to detect autoantibodies to neutrophilic granulocytes. W: Manual of biological markers of disease. A9: Kluwer Academic Publishers. 11. Borregaard N., Heiple J.M., Simons E.R., Clark R.A.: Subcellular localization of the b-cytochrome component of the human neutrophil microbicidal oxidase: Translocation during activation. J. Cell. Biol. 1983; 97: Pantazis C.G., Kniker W.T.: Assessement of blood leukocyte microbial killing by using a new fluorochrome microassay. J. Reticuloendothel Soc. 1979; 26: Falk R.J., Terrell R.S., Charles L.A., Jennette J.C.: Anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies induce neutrophils degranulate and produce oxygen radicals in vitro. Proc. Natl. Acad. Sc. USA 199; 87: Keogen M.T., Esnault V.L.M., Green A.J., Lockwood C.M., Brown D.L.: Anti- neutrophil cytoplasm antibody (ANCA) stimulates unprimed neutrophils. Am. J. Kidney Dis. 1991; 7: Puszczewicz M., Zimmermann-Górska I.: Wp³yw surowic zawieraj¹cych przeciwcia³a przeciw cytoplazmie granulocytów obojêtnoch³onnych (ANCA) na metabolizm tlenowy granulocytów in vitro. Reumatologia 1999; 37: Charles L.A, Falk R.J., Terrell R., Jenette J.C.: Antibodies against granule proteins activate neutrophils and monocyte in vitro. Am. J. Kidney Dis. 1991; 18: Puszczewicz M., Zimmermann-Górska I., Bia³kowska G.: An influence of ANCA sera on PMN s function of healthy donors in comparison with PMN s from patients with Wegener s granulomatosis (WG). Clin. Exp. Immunol. 1993; 25: Buchta R., Friakin M., Pontet M., Contessi E., Scagiante B., Romeo D.: Modulation of human neutrophil function by C-reactive protein. Eur. J. Biochem. 1987; 163: Smith R.J., Bowman B., Speziale S.C.: Interleukin-1 stimulates granule exocytosis from human neutrophils. Int. J. Immunopharmacol. 1986; 8: Ogele J.D., Noel J.G., Sramkowski R.M.: Effects of combination of tumor necrosis factor-alfa and chemotactic peptide F-met-leuphe on phagocytosis of opsonized microspheres by human neutrophils. Inflammation 1992; 16: 57.

8 266 Alergia Astma Immunologia, 1999, 4(4), Niinaka T., Okochi T., Watanabe Y., Takahashi Y., Yamamura Y.: Chemotactic defect in Wegener s granulomatosis. J. Med. 1997; 8: Alastair G., Baum M., Baum J.: Chemotaxis of polymorphonuclear leukocytes from patients with rheumatoid arthritis. J. Clin. Invest. 1971; 5: Ewert B., Falk R.J., Jennette J.C.: Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies stimulate neutrophils to injury endothelial monolayers in vitro. Am. J. Kidney Dis. 1991; 18: Ewert B.H., Jennette J.C., Falk R.J.: Anti-mieloperoxidase antibodies stimulate neutrophils to damage human endothelial cells. Kidney Int. 1992; 41: Van der Woude F.J., van Es L.A., Daha M.R.: The role od C-ANCA antigen in pathogenesis of Wegener s granulomatosis. A hypothesis based on both humoral and cellular mechanisms. Neth. J. Med. 199; 36: Tomer Y., Lider O., Gilburd B., Hershkoviz R., Meroni P.L., Wiik A., Shoenfield V.: Anti-neutrophil cytoplasmic antibody enriched IgG induces adhesion of human T lymphocytes to extracellular matrix protein. Clin-immunol. Immunopathol. 1997; 83: Zeman K., Tchórzewski H., Majewska E., Pokoca L., Piñkowska R.: Prosta i szybka metoda równoczesnej izolacji z krwi obwodowej wysoce oczyszczonych limfocytów i granulocytów obojêtnoch³onnych. Immunol. Pol. 1988; 13: The influence of ANCA sera on neutrophils (PMNs) function of healthy donors in vitro MARIUSZ PUSZCZEWICZ, IRENA ZIMMERMANN-GÓRSKA, GRA YNA BIA KOWSKA-PUSZCZEWICZ Summary Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies have been shown to be a marker of Wegener s granulomatosis and vasculitis. The pathogenic role of ANCA sera is suggested. The function of neutrophils incubated with ANCA sera in comparison with autologous sera was investigated. ANCA sera were obtained from 15 patients with Wegener s granulomatosis, 6 with rheumatoid arthritis, 6 cases of polyarteritis nodosa and 3 with crescentic glomerulonephritis. ANCA serology was determinated by using a standard ELISA and indirect immunofluorescence microscopy. Phagocytosis and bactericidal capacity of neutrophils were evaluated by using fluorochrome microassay acc. to Pantazis and Kniker. The migration and chemotactic response was measured acc. to Boyden s method. The PMNs from donors incubated with ANCA sera showed higher values of phagocytosis index than the control. No significant differences were yielded between percentage of killed staphylococci by PMNs incubated with ANCA sera, migration and chemotactic response in comparison with control ones. These data demonstrated that ANCA sera stimulates phagocytosis of healthy donor s neutrophils. These actions may contribute to tissue damage in systemic vasculitis. Key words: ANCA; neutrophils; rheumatoid arthritis; Wegener s granulomatosis; polyarteritis nodosa; crescentic glomerulonephritis