PSZCZELNICZE ZESZYTY NAUKOWE Rok XLIll 1999

Transkrypt

1 PSZCZELNICZE ZESZYTY NAUKOWE Rok XLIll 1999 TOKSYCZNOŚĆ NAWOZÓW MINERALNYCH DLA PSZCZÓŁ W WARUNKACH LABORATORYJNYCH. CZ. III. TOKSYCZNOŚĆ SUPERFOSFATU POTRÓJNEGO I SIARCZANU MAGNEZU Barbara Tomaszewska, Paweł Chorbiński Wydział Medycyny Weterynaryjnej AR, Katedra Epizootiolegii i Klinika Chorób Zakaźnych, PI. Grunwaldzki 45, Wrocław Streszczenie W warunkach laboratoryjnych przeprowadzono badania nad toksycznością żołądkową dla pszczół superfosfatu potrójnego i siarczanu magnezu. Doświadczalnym owadom podawano jednorazowo 2 i 4% roztwory obu nawozów. Obserwacje prowadzono przez 10 dni notując procent śmiertelności oraz spożycie pokarmu cukrowego i wody. W badaniach histologicznych posłużono się metodą parafinową przy użyciu barwienia Azanem Novum. Dodatkowo wykonano badania histochemiczne na obecność fosfatazy zasadowej i kwaśnej oraz esterazy niespecyficznej alfa w komórkach nabłonkowych jelita środkowego doświadczalnych pszczół. Na podstawie przeprowadzonych badań nie wykazano istnienia różnic statystycznie istotnych w poziomie śmiertelności u pszczół pobierających w/w wymienione nawozy, w stosunku do grupy kontrolnej oraz pomiędzy grupami, zarówno dla wartości rzeczywistych jak i skorygowanych wg wzoru Abbota. Nie stwierdzono także różnic w intensywności pobierania pokarmu cukrowego i wody przez doświadczalne owady. Badania histologiczne i histoenzymatyczne wykazały pewne upośledzenie funkcjonowania jelita środkowego, zwłaszcza procesów trawiennych (zmiany w wyglądzie komórek nabłonkowych i spadek aktywności fosfatazy zasadowej). Zmiany te nie miały charakteru trwałego i ustępowały po 48 godzinach. Słowa kluczowe: pszczoła miodna, toksyczność, superfosfat potrójny. siarczan magnezu. WPROW ADZENIE W latach prowadzono badania nad toksycznością wybranych nawozów mineralnych dla pszczół. Obserwacje dotyczyły następujących nawozów: mocznika, saletry amonowej (C h o r b i ń s ki, T o m a s z e w s k a 1995), saletry wapniowej i potasowej oraz soli potasowej (T o m a s z e w s k a, C h o r b iń s ki 1997). Wstępne wyniki badań dotyczących toksyczności superfosfatu potrójnego oraz siarczanu magnezu 183

2 publikowano w materiałach X Kongresu PTNW (T o m a s z e w s k a, C h o r b i ń s k i 1996). O wyborze tych nawozów zadecydował fakt, że mogą one mieć zastosowanie jako nawozy doglebowe oraz dolistne i ta, ostatnia forma ich zastosowania, może stanowić zagrożenie dla pszczół. MA TERlAL I METODYKA Celem niniejszych badań było określenie ewentualnej toksyczności dla pszczół dwóch powszechnie stosowanych nawozów mineralnych jak superfosfat potrójny i siarczan magnezu. Nawozy te, podobnie jak wcześniej wymienione, mogą być stosowane dolistnie. Domniemywać więc można, że w tej formie stanowią pewne zagrożenie dla pszczół, zwłaszcza przy niedoborach wody w środowisku. W badaniach zastosowano metodykę, przyjętą w obu wcześniejszych pracach (Chorbiński, Tomaszewska 1995, Tomaszewska, e h o r b i ń s ki 1997). W doświadczeniu użyto 2 i 4 procentowe roztwory superfosfatu potrójnego i siarczanu magnezu w 50% syropie cukrowym, testując je na 44 grupach pszczół doświadczalnych i kontrolnych liczących po 50 sztuk owadów każda. Wymienione 2 i 4 % roztwory nawozów odpowiadają stężeniom stosowanym w rolnictwie. Pokarm z dodatkiem nawozów w w/w stężeniach podawano pszczołom jednorazowo i usuwano go po 24 godzinach. Obserwacje prowadzono przez następne 10 dni doświadczenia, codziennie notując procent śmiertelności w grupach doświadczalnych i kontrolnych oraz określając spożycie pokarmu cukrowego i wody. W badaniach histologicznych posłużono się metoda parafinową przy użyciu barwienia Azanem Novum. Dodatkowo wykonano badania histochemiczne na obecność fosfatazy zasadowej i kwaśnej oraz esterazy niespecyficznej alfa w komórkach nabłonkowych jelita środkowego. Celem tych badań było porównanie aktywności tych enzymów u pszczół doświadczalnych, otrzymujących dodatek nawozów i u pszczół kontrolnych. Mrożone skrawki grubości 8 mikrometrów uzyskiwano za pomocą mikrotomu w kriostacie. Do oznaczenia aktywności badanego enzymu wykorzystywano co najmniej 10 skrawków z każdej próby. Do oznaczenia aktywności fosfatazy zasadowej posłużono się metodą Pearse' a (FZ- Ee ). Do oznaczenia aktywności fosfatazy kwaśnej wykorzystano metodę Pearse'a i Gomoriego (FK-EC ). Aktywność esterazy niespecyficznej alfa (EN-Ee ) oznaczono wg metody Pearse'a. We wszystkich tych metodach wykorzystano techniki podawane przez Pearse'a (1957)i Zawistowskiego (1986)w modyfikacji własnej,w której zrezygnowano z podbarwiania kontrastowego. Oceny stopnia 184

3 aktywności badanych enzymów w komórkach nabłonkowych jelita środkowego pszczół doświadczalnych i kontrolnych dokonano przy użyciu 3-punktowej skali wyrażonej w plusach (+, ++, +++). Badania histologiczne i histochemiczne wykonano w terminach: 24, 48 i 96h od momentu usunięcia pokarmu z dodatkiem w/w stężeń badanych nawozów. W tych samych terminach wykonywano badania u pszczół kontrolnych. Do badań tych przygotowano dodatkowo 12 grup doświadczalnych i 3 kontrolne. Spożycie nawozów przeliczono według spożycia fosforu i magnezu na jedną pszczołę, na podstawie ilości pobranego pokarmu z dodatkiem w/w stężeń nawozów w każdej badanej grupie pszczół. Zestawiono w ten sposób grupy do analizy statystycznej wg wielkości spożycia, a nie podawanego w pokarmie stężenia badanego nawozu. Wyodrębniono w ten sposób dla każdego nawozu następujące grupy doświadczalnych pszczół: superfosfat potrójny: Tgrupa mg P (+/ ), TTgrupa mg p (+/ ); siarczan magnezu: TTTgrupa mg Mg (+/ ), TVgrupa mg Mg (+/ ), pszczoły kontrolne - V grupa Do badań histologicznych i histochemicznych przygotowano następujące grupy pszczół: superfosfat potrójny: 2% - grupa VI, 4% - grupa VII; siarczan magnezu: 2% - grupa VIII, 4% - grupa IX, kontrola: grupa X Wyniki badań opracowano statystycznie. Średni procent śmiertelności pszczół odpowiadający spożyciu nawozów w wymienionych grupach (przeliczonych wg spożycia w mg P i Mg) skorygowano do obliczeń wg wzoru Abbota (L i P a i Ś I i ży ń s k i 1973). Analizę wariancji (a. = 0.05) na wartościach skorygowanych i rzeczywistych przeprowadzono za okres 10 dni doświadczenia. WYNIKI BADAŃ I DYSKUSJA Spożycie przez pszczoły pokarmu zawierającego dodatek 2 i 4% superfosfatu potrójnego i siarczanu magnezu nie wpłynęło w sposób widoczny na wzrost śmiertelności doświadczalnych pszczół. Śmiertelność ta wahała się od 1.5% (grupa II mg P) do 14% (grupa III mg Mg). Nie wykazano istnienia różnic statystycznie istotnych w poziomie śmiertelności pomiędzy grupami i w stosunku do grupy kontrolnej, zarówno dla wartości rzeczywistych jak i skorygowanych wg wzoru Abbota (tabela I.) Nie stwierdzono także takich różnic w intensywności pobierania pokarmu cukrowego i wody przez doświadczalne pszczoły, aczkolwiek wyraźny był wzrost spożycia pokarmu w l dniu po usunięciu pokarmu z dodatkiem 185

4 nawozów. Skażony nawozami pokarm był pobierany bardzo niechętnie przez pszczoły, stąd kompensujący wzrost spożycia w l dniu i jego spadek w 2 dniu doświadczenia. Zaobserwowano również podwyższone zużycie wody w grupach otrzymujących jednorazowo siarczan magnezu - li (0.029 mg Mg) i TV (0.041 mg Mg) w 3 dniu doświadczenia (tabela 2.). Tabela Ogólna śmiertelność pszczół po jednorazowym podaniu superfosfatu potrójnego i siarczanu magnezu w syropie cukrowym (%) Percent mortality ofbees after single application of triple superphosphate and magnesium sulphate in sugar syrup grupy groups dni doświadczenia - days ol experimenł I (mg Pl O II (mg Pl III (mg Mgl IV (mg Mg) V Kontrola Control O O Objaśnienia: Notes: s - syrop syrup, w - woda water Tabela grupy zestawione wg spożycia superfosfatu potrójnego w przeliczeniu na mgip/pszczołę i siarczanu magnezu \V mg!mglpszczołę. Table groups according to consumption oftńple superphpsphate in mgiplbee and magnesium sulphate mg!mglbee. Tabela 2 Spożycie pokarmu i wody przez pszczoły po jednorazowym podaniu superfosfatu potrójnego i siarczanu magnezu w syropie cukrowym (w ul/pszczołę) Consumption of sugar syrup and water by bees after single application oftriple superphosphate and magnesium sulphate (in ul/bee) grupy groups dni doświadczenia - days ol experimenł I (mg Pl II III (mg Pl (mg Mgl IV O.041(mg Mg) s w s w s w s w V Kontrola Contrai s w Objaśnienia: patrz tab, l. Notes see tab, l. 186

5 Badania histolo~iczne Badaniem histologicznym nabłonka jelita środkowego doświadczalnych pszczół wykazano, że po podaniu superfosfatu potrójnego (2 i 4%) nastąpiło po 24h wzmożenie produkcji błon perytroficznych, wzrost działalności krypt regeneracyjnych oraz słabo zaznaczone ślady wakuol izacj i cytoplazmy. Po 48h objawy te były słabiej wyrażone, ale nastąpiło wzmożone złuszczanie apikalnych części nabłonka jelitowego przy obu stężeniach badanego nawozu. Po 96 godzinach obserwacji, podobnie jak we wcześniejszych doświadczeniach (C h o r b i ń s ki, T o m a s z e w s k a 1995, T o m a s z e w s k a, C h o r b i ń s k i 1997), nie stwierdzono znaczących różnic w obrazie histologicznym jelita środkowego doświadczalnych pszczół w porównaniu do pszczół kontrolnych. Po jednorazowym podaniu siarczanu magnezu (w obu dawkach) zanotowano w 24 godzinie badań lekko zaznaczoną wakuolizację cytoplazmy i nieznaczne obrzmienie jąder komórek nabłonkowych jelita. W kolejnych terminach badań (48 i 96h) obraz histologiczny pszczół doświadczalnych nie różnił się od obrazu jelita pszczół kontrolnych. Badanie hjstoenzymatyczne Tabela 3 Aktywność esterazy niespecyficznej, fosfatazy kwaśnej i zasadowej po jednorazowym podaniu superfosfatu potrójnego i siarczanu magnezu Activity of the nonspecific esterase, and the basie and acidic phosphatase after single application of the triple superphosphate and magnesium sulphate enzym - enzyme EN - EC FK - EC FZ - EC czas (h) - lime (h) grupy - groups VI ++t ++t ++t ++t t t t + + VII t ++t t Ht t t t + t VIII ttt + ++t t IX ttt X ++t +++ t ++t +++ t + + t Objaśnienia: Notes: Grupy: VI i VII - pszczoły otrzymujące 2% i 4% roztwór superfosfatu potrójnego Vlll i IX - pszczoły otrzymujące 2% i 4% roztwór siarczanu magnezu X - Kontrola Groups: VI i VII - bees fed with 2% and 4% solution oftriple superphosphate in sugar syrup Vlll iix - bees fed with 2% and 4% solution of magnesium sulphate in sugar syrup X - ControJ 187

6 Jednorazowe podanie pszczołom w/w nawozów w obu dawkach spowodowało wahania aktywności badanych enzymów. Superfosfat potrójny w stężeniu 2% wywołał spadek aktywności fosfatazy zasadowej w 24 i 48 godzinie obserwacji, spadek aktywności fosfatazy kwaśnej 48 i 96 godz. Jednocześnie obserwowano wzrost aktywności esterazy niespecyficznej w 96 godzinie eksperymentu. Obniżenie aktywności esterazy niespecyficznej w 24 godzinie i fosfatazy kwaśnej w 48 godzinie badań notowano po podaniu 4% roztworu tego nawozu. Spożycie 2% roztworu siarczanu magnezu wywołało spadek aktywności fosfatazy zasadowej w 24 i 48 godzinie oraz aktywności fosfatazy kwaśnej w 48 godzinie obserwacji. Zanotowano jednak wzrost aktywności esterazy niespecyficznej w 96 godzinie. W stężeniu 4% nawóz ten obniżał aktywność esterazy niespecyficznej i fosfatazy kwaśnej, w 24 godzinie badań. Obserwowana aktywność fosfatazy zasadowej zmniejszyła się w 24 a wzrosła w 96 godzinie eksperymentu (tabela 3.). Jednorazowe spożycie przez pszczoły pokarmu z dodatkiem 2 i 4% roztworów superfosfatu potrójnego i siarczanu magnezu wskazuje w świetle badań histologicznych i histoenzymatycznych na pewne upośledzenie funkcjonowania jelita środkowego, zwłaszcza procesów trawiennych (zmiany w wyglądzie komórek nabłonkowych i spadek aktywności fosfatazy zasadowej). Zaburzenia te nie mają charakteru trwałego i ustępują po 48 godzinach. WNIOSKI l. Spożycie przez pszczoły pokarmu z dodatkiem 2 i 4% superfosfatu potrójnego oraz siarczanu magnezu nie powoduje ich zatrucia. 2. Zmiany w obrazie histologicznym jelita środkowego pszczół spożywających 2 i 4% roztwory obu nawozów mają charakter przejściowy i ustępują po 96 godzinach. 3. Wahania w aktywności enzymatycznej jelita środkowego doświadczalnych pszczół, po pobraniu testowanych nawozów w obu stężeniach, wskazują na przemijające upośledzenie jego procesów trawiennych. LITERATURA Chorbiński P., Tomaszewska B. (1995)- Toksyczność nawozów mineralnych dla pszczół w warunkach laboratoryjnych. Cz. 1. Toksyczność mocznika i saletry amonowej. Pszczelno Zesz. Nauk. 39: p e a r s e A. G. E. (l 95 7 ) - Histochemia teoretyczna i stosowana. PZWL, Warszawa. 188

7 Tomaszewska B., Chorhiński P. (1996)- Toksyczność wybranych nawozów mineralnych dla pszczół. Mat. X Kongresu P1NW, Wrocław, 443. T o m a s z e w s k a B., C h o r b i ń s k i P. (I 997 ) - Toksyczność nawozów mineralnych dla pszczół w warunkach laboratoryjnych. Cz.II Toksyczność saletry wapniowej i potasowej oraz soli potasowej. Pszczelno Zesz. Nauk. 41: Z a w i s t o w s k i S t. (I 986) - Technika histologiczna, histologia oraz podstawy histopatologii. PZWL, Warszawa. TOXICIY OF MINERAL FERTILIZERS TO HONEY BEES UNDER LABORATORY CONDITIONS PART III. THE TOXICITY OF OF TRIPLE SUPERPHOSPHATE AND MAGNESIUM SULPHATE B. Tomaszewska, P. Chorbiński Summary The stomachic toxicity of of triple superphosphate and magnesium sulphate lo bees was studied under laboratory conditions. There were 44 experirnental and control groups, 50 insects.each. 2% and 4% solutions of both of the fertilizers were given to bees at one occasion.the observations were carried out during next 10 days and the percent mortality, and sugar syrup and water consumptions was recorded. The histological examination was performed, and a param n method and Novum azane staining were applied. The presence of basie and acidic phosphatase and nonspecific esterase in epithelial cells of the midgut was checked histochemically. There were no statistically significant differences in percent mortality of bees that got single doses of experimental solutions as compared to control bees, and among experimentał groups. It was true for real as well as corrected (Abbot's formula) data. Likewise, there were no differences in the intensity of sugar syrup and water consumption by the experirnental bees. The histological and histochemical examination showed some disturbances in functioning of the midgut, especially in digestion processes (chan ges in the appearance of epithelial cells, excessive peeling, and decrease in basie phosphatase activity, These changes, however, were not permament, and ceased after 48 hours. Keywords: honey bee, toxicity, triple superphosphate, magnesium sulphate. 189