Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

Transkrypt

1 UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII Pracownia studencka Katedry Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 1 IZOLACJA WIELOPIERŚCIENIOWYCH WĘGLOWODORÓW AROMATYCZNYCH (WWA) Z GLEBY Zastosowanie chromatografii cieczowej w chemii i ochronie środowiska Gdańsk, 2019

2 1. Wstęp Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) to obszerna grupa związków chemicznych o budowie pierścieniowej, charakteryzujących się zbliżonymi własnościami fizykochemicznymi. Chociaż znanych jest ponad 100 różnych WWA najczęściej w środowisku występuje około 17 z nich. WWA nie występują w środowisku w postaci pojedynczych związków zawsze tworzą mieszaniny wieloskładnikowe. Skład ilościowy i jakościowy tych mieszanin zależy od rodzaju materiału spalanego oraz warunków, w jakich zachodzi proces spalania i jest dowodem na źródło emisji. Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne należą do grupy najpowszechniej występujących, trwałych zanieczyszczeń organicznych. Głównymi źródłami WWA są: produkty niepełnego spalania paliw kopalnych, lotne pyły i popioły powstające ze spalania paliw lub utylizacji odpadów oraz przemysł ciężki związany z przetwarzaniem węgla i ropy naftowej (koksownie, rafinerie, huty żelaza, aluminium i miedzi, produkcja i wykorzystanie smoły i kreozotu). Szacuje się, iż szczególnie w okresie zimowym, poważnym źródłem WWA w środowisku jest tzw. niska emisja, pochodząca z indywidualnych źródeł ciepła. Jednak najpoważniejszy udział w emisji WWA na terenach zurbanizowanych ma transport samochodowy. Wśród źródeł naturalnych wymienia się pożary lasów i wybuchy wulkanów oraz procesy przemiany materii bakterii, glonów i roślin wyższych. Biosynteza WWA prowadzi do tworzenia tych najbardziej groźnych dla zdrowia człowieka ale w aspekcie ogólnego skażenia, ilości WWA pochodzące ze źródeł naturalnych i stanowiące "naturalne tło" są niewielkie w porównaniu z ilościami będącymi wynikiem działalności człowieka. WWA pochodzące ze źródeł antropogenicznych nie występują w środowisku w postaci pojedynczych związków zawsze tworzą mieszaniny wieloskładnikowe. Skład ilościowy i jakościowy tych mieszanin zależy od rodzaju materiału spalanego oraz warunków, w jakich zachodzi proces spalania. Najistotniejszym ze zdrowotnego punktu widzenia skutkiem oddziaływania WWA na organizm jest zdolność niektórych z nich do wywoływania zmian nowotworowych. Z tego względu WWA podzielono na nieaktywne, mniej aktywne i bardzo aktywne. Liczne badania dostarczyły dostatecznej ilości danych, by WWA o ilości pierścieni powyżej 3 uznać za rakotwórcze i mutagenne. Do tych związków należą m.in.: benzo(a)piren, dibenzo(a,h)antracen, benzo(a)antracen, benzo(b)fluoranten, czy dibenzo(a,e)piren (Rysunek 1). WWA są metabolizowane przez mikrosomalne enzymy cytochromu P 450 do związków mogących tworzyć trwałe połączenia z DNA (np. epoksydy), co w konsekwencji może prowadzić do wysoce prawdopodobnego procesu nowotworzenia. W celu systematycznej oceny toksyczności wszystkich

3 rakotwórczych WWA, wprowadzono tzw. względny współczynnik rakotwórczości (k), odnoszący się do rakotwórczości benzo(a)pirenu (BaP), dla którego przyjęto wartość równą 1. Obecnie jako miarę narażenia na wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne przyjmuje się wskaźnik będący sumą iloczynów stężeń 9 WWA i ich względnych współczynników rakotwórczości. WWA emitowane z różnych źródeł ulegają stopniowej dystrybucji w środowisku, gdzie ostatecznie deponowane są w glebach (90%) oraz, ze względu na bardzo słabą rozpuszczalność w wodzie, w osadach dennych (9%). Oprócz mokrej i suchej depozycji WWA, związki te trafiają do gleby razem z wodami spływnymi. Wody spływne wymywają np. nawierzchnię dróg, na których znajdują się duże ilości WWA pochodzące: ze spalin samochodowych, ze ścierania opon gumowych przy hamowaniu i z samego asfaltu bogatego we frakcje węglowodorów aromatycznych. Dodatkowym źródłem są także niekontrolowane zrzuty ścieków przemysłowych i bytowo-gospodarczych, a także odcieki ze składowisk odpadów. Przykładowe struktury WWA przedstawia Rysunek 1. Benzo(a)piren Dibenzo(a,h)antracen Benzo(a)antracen Benzo(b)fluoranten Chryzen Perylen Piren Antracen Naftalen Rysunek 1. Przykładowe struktury WWA

4 2. Wydzielanie WWA z próbek gleby We współczesnej analizie śladowej mamy do czynienia z wykrywaniem substancji na poziomie ppm i ppb. Aby oznaczyć tak małe ilości substancji chemicznych w skomplikowanej matrycy, jaką są próbki środowiskowe, niezbędne jest przygotowanie procedury składającej się z kilku etapów: pobieranie próbki, przechowywanie, wstępne przygotowanie obejmujące wyodrębnienie z matrycy, zatężanie czy przekształcanie analitu w postać bardziej trwałą lub dogodną dla końcowego oznaczania, analiza właściwa, obróbka danych Chromatografia Chromatografia to technika analityczna lub preparatywna służąca do rozdzielania, identyfikacji i oznaczania substancji, czyli badania składu mieszanin związków chemicznych. Podstawy techniki chromatograficznej powstały na początku XX wieku w Warszawie w wyniku badań rosyjskiego chemika i biologa Michaiła Cwieta. Zajmował się on badaniem barwników roślinnych. Podczas przepuszczania roztworu zielonych barwników roślinnych przez kolumnę (rurkę szklaną) wypełnioną kredą (węglan wapnia), Cwiet uzyskał rozdział barwników w postaci szeregu poziomych barwnych pasm o barwie zielonej i żółtej. Ponieważ Cwiet rozpoznał i prawidłowo zinterpretował proces rozdziału, jest on powszechnie uważany za wynalazcę tej techniki. Terminu chromatografia użył dla określenia barwnych stref obserwowanych na kolumnie kredowej podczas rozdziałów (gr. chromatos = barwa + grapho = pisze). Układ chromatograficzny składa się z trzech zasadniczych elementów: fazy stacjonarnej nieruchoma warstwa substancji o rozwiniętej powierzchni, fazy ruchomej zwanej eluentem przepływający przez fazę stacjonarną strumień rozpuszczalników lub gazu, substancji rozdzielanej. Podstawą rozdziału chromatograficznego, niezależnie od techniki chromatograficznej jest proces podziału składników rozdzielanej mieszaniny, pomiędzy dwie nie mieszające się ze sobą fazy: stacjonarną i ruchomą. Rozdział substancji następuje w wyniku przepuszczenia roztworu badanej mieszaniny przez specjalnie spreparowaną fazę rozdzielczą (złoże), zwaną też fazą stacjonarną. Fazą rozdzielczą są substancje wykazujące właściwości sorpcyjne w stosunku do substancji przepływających. Jednocześnie podczas przepływu fazy ruchomej eluentu, przez fazę rozdzielczą

5 następuje proces wymywania zaadsorbowanych (lub związanych) składników badanej substancji (rozdzielanej). Intensywność tego procesu jest różna dla poszczególnych składników mieszaniny. Jedne składniki są więc zatrzymywane w fazie dłużej, a inne krócej, dzięki czemu może następować ich rozdział. Czas przebywania danego składnika w kolumnie określany jest mianem czasu retencji T r i jest podstawowym parametrem umożliwiającym identyfikację (analizę jakościową) Chromatografia adsorpcyjna Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne wydziela się z gleby najczęściej poprzez ekstrakcję niepolarnym rozpuszczalnikiem organicznym. Proces ten nie jest selektywny. W ekstrakcie, poza węglowodorami, znajdują się inne grupy związków, poza tym węglowodorów alifatycznych jest zdecydowanie więcej niż aromatycznych, co w zdecydowanej większości przypadków, uniemożliwia wykorzystanie ekstraktu do analizy właściwej. Skuteczną i często stosowaną na skalę preparatywną metodą rozdzielania mieszanin związków organicznych jest cieczowa chromatografia adsorpcyjna. Rozdział następuje w wyniku wielokrotnych, selektywnych procesów adsorpcji zachodzących na aktywnych powierzchniach sorbentów. Szczególnie cenne usługi oddaje kolumnowa chromatografia adsorpcyjna w przypadku złożonych mieszanin stosunkowo niewielkich ilości substancji, których rozdzielenie za pomocą krystalizacji czy destylacji jest praktycznie nieosiągalne, zwłaszcza gdy chodzi o związki wysokowrzące i wrażliwe na działanie temperatury. Z tych samych powodów metodę kolumnowej chromatografii adsorpcyjna stosuje się do rozdzielania szczególnie złożonych mieszanin związków pochodzących ze źródeł naturalnych. W chromatografii cieczowej występują konkurencyjne oddziaływania między próbką (analit i matryca) a fazą stacjonarną (adsorbent), między próbką a fazą ruchomą (rozpuszczalnik wymywający próbkę z adsorbentu) i między fazą ruchomą a stacjonarną. Mechanizm adsorpcyjny polega na zatrzymywaniu cząsteczek substancji na powierzchni adsorbentu (zwykle porowatego). W procesie tym biorą udział następujące oddziaływania międzycząsteczkowe: siły wynikające z oddziaływań między cząsteczkami mającymi trwały moment dipolowy (oddziaływania dipol-dipol), siły wynikające z oddziaływań między cząsteczkami mającymi dipol i cząsteczkami, w których dipol jest indukowany przez sąsiadujące cząsteczki (oddziaływanie dipol-dipol indukowany), oddziaływania związane z tworzeniem wiązań wodorowych, specjalny rodzaj oddziaływania dipol-dipol między wodorem a atomem elektroujemnym, np. O, N, F.

6 Oddziaływania międzycząsteczkowe powodują, że rozdzielane substancje w niejednakowym stopniu zatrzymują się na adsorbencie. Im większe powinowactwo analitu do fazy stacjonarnej tym analit jest silniej przez nią zatrzymywany. Analit z adsorbentu wymywany jest fazą ruchomą. Im silniej zatrzymywany analit, tym później opuszcza kolumnę (większa retencja czyli opóźnienie w stosunku do przepływu fazy ruchomej). Objętość fazy ruchomej potrzebna do jego wymycia nazywa się objętością retencji, a czas, w jakim analit zostaje wymyty z kolumny - czasem retencji. Objętość retencji i czas retencji określa się precyzyjnie, licząc od momentu naniesienia na kolumnę do momentu opuszczenia kolumny (maksimum stężenia analitu) przez analit o najwyższej wartości stężenia. Na Rysunku 2 przedstawiono schemat oddziaływań między cząsteczkami analitów Z i X, a powierzchnią adsorbentu żelu krzemionkowego. Linią przerywaną oznaczono siły wynikające z różnego rodzaju oddziaływań występujących w chromatografii adsorpcyjnej i powodujących retencję. Przedstawiona substancja Z silniej oddziałuje z powierzchnią adsorbentu niż substancja X. W stanie równowagi, stosunek stężenia Z w fazie stacjonarnej (3 x Z) do stężenia Z w fazie ruchomej (1 x Z) jest większy {(3 x Z)/(1 x Z) = 3} niż analogiczny stosunek dla X {(3 x X)/(2 x X)=1,5}. Skoro substancji X jest relatywnie więcej w fazie ruchomej niż substancji Z, pierwsza opuści kolumnę substancja X (objętość retencji X, czas retencji X mniejsze niż objętość retencji Z, czas retencji Z). Z X X X Z X Z S Z X H H H H H H H O O O O O O O Ż E L K R Z E M I O N K O W Y Rysunek 2. Schemat mechanizmu adsorpcji na żelu krzemionkowym. Strzałką oznaczono przepływ fazy ruchomej S, kwadracikami substancje rozdzielane Z (k=3) i X (k=1,5), k=n s /n m, n s -liczba moli substancji rozdzielanej w fazie stacjonarnej, n m liczba moli substancji rozdzielanej w fazie ruchomej, k - współczynnik retencji 2.3. Adsorbenty W chromatografii cieczowej używa się adsorbentów porowatych o powierzchniach od setek do tysiąca m 2 /g. Adsorbenty dzieli się na polarne i niepolarne:

7 niepolarne węgiel aktywny, węglowodory nasycone, polimery; polarne żel krzemionkowy, krzemian magnezu, tlenek glinu. Żel krzemionkowy o ogólnym wzorze SiO. 2 nh 2 O jest najczęściej stosowanym adsorbentem. O jego szerokim zastosowaniu decyduje łatwość otrzymywania przez polikondensację kwasu krzemowego, jak również możliwość łatwej modyfikacji jego właściwości powierzchniowych, takich jak struktura geometryczna porów czy modyfikacja chemiczna. Na powierzchni żelu krzemionkowego występują grupy -OH (silanolowe) o różnych właściwościach, w zależności od wzajemnej odległości i przestrzennego rozmieszczenia oraz grupy siloksanowe (Rysunek 3). ( a ) ( b ) Rysunek 3. Grupy silanolowe aktywne, bliźniacze, swobodne i związane (a) i siloksanowa (b), występujące na powierzchni żelu krzemionkowego Grupy silanolowe swobodne oraz aktywne stanowią centra silnie protonodonorowe, grupy silanolowe bliźniacze są centrami o słabych właściwościach protonodonorowych, a grupy związane, połączone ze sobą wiązaniem wodorowym mają właściwości protonoakceptorowe. Uważa się, że największą rolę w procesie adsorpcji odgrywają grupy swobodne i aktywne. Udział poszczególnych

8 form występowania grup wodorotlenowych na powierzchni żelu krzemionkowego zależy od struktury geometrycznej porów. Żele szerokoporowate zawierają więcej swobodnych grup -OH, natomiast na powierzchni wąskoporowatych żeli więcej jest aktywnych i związanych grup -OH. Aktywność żelu krzemionkowego jak i innych adsorbentów nieorganicznych zwiększa się przez ogrzewanie w temperaturze ºC, aby częściowo usunąć zaadsorbowaną wodę. Wyższa temperatura w przypadku żelu krzemionkowego może powodować usuwanie grup wodorotlenowych z jego powierzchni. Siła adsorpcji związków organicznych na żelu krzemionkowym jest większa im większa jest ich polarność i rośnie w szeregu: węglowodory < halogenki alkilowe, arylowe < etery (ROR) < aldehydy (RCHO) < ketony (R 2 CO) < estry (RCOOR) < alkohole (ROH) < fenole (ArOH) < zasady azotowe (np. C 5 H 5 N, C 6 H 5 NH 2 ) < aminy III-rz. (R 3 N) < aminy II-rz. i amidy < kwasy karboksylowe Fazy ruchome w chromatografii adsorpcyjnej Zdolność rozpuszczalnika do wymywania substancji z adsorbentu zależy od jego siły oddziaływania z powierzchnią adsorbentu i zwana jest mocą elucyjną rozpuszczalnika (eluentu). Mechanizm tego oddziaływania jest taki sam jak przedstawiony wyżej dla substancji i adsorbentu. Silniejsza adsorpcja rozpuszczalnika na fazie stacjonarnej zmniejsza adsorpcję analitu. Rozpuszczalniki klasyfikuje się zgodnie ze wzrastającą zdolnością wymywania zaadsorbowanych substancji z adsorbentu (czyli zgodnie ze wzrastającą ich mocą elucyjną) zestawiając je w tzw. szereg eluotropowy. W chromatografii z fazą stacjonarną polarną (np. z żelem krzemionkowym) o sile elucji decyduje polarność i polaryzowalność eluentu, więc szereg eluotropowy rozpuszczalników dla tej chromatografii adsorpcyjnej jest jednocześnie szeregiem o wzrastającej ich polarności. Wybór odpowiedniego rozpuszczalnika do rozdziału wybranej mieszaniny związków nie jest łatwy. Zwykle stosuje się najpierw rozpuszczalnik o średniej mocy elucyjnej, następnie dla uzyskania właściwego rozdziału zmienia się rozpuszczalnik na taki, który ma większą lub mniejszą moc elucyjną. Można mieszać dwa lub więcej rozpuszczalników dla uzyskania odpowiedniej siły elucji i selektywności rozdziału. Szereg eluotropowy rozpuszczalników wg wzrastającej mocy elucyjnej, dla adsorbentów polarnych przedstawiono w Tabeli 1.

9 Tabela 1. Rozpuszczalniki uszeregowane zgodnie ze wzrastającą mocą elucyjną w chromatografii adsorpcyjnej na żelu krzemionkowym L.p. Rozpuszczalnik L.p. Rozpuszczalnik L.p. Rozpuszczalnik 1. n-pentan 7. Eter dietylowy 13. Acetonitryl 2. Eter naftowy 8. Chloroform 14. Pirydyna 3. n-heksan 9. Dichlorometan 15. Etanol 4. Cykloheksan 10. Tetrahydrofuran 16. Metanol 5. Tetrachlorek węgla 11. Aceton 17. Woda (b. duża siła elucji) 6. Toluen 12. Octan etylu 18. Kwas octowy (b. duża siła elucji) Rozpuszczalniki stosowane w chromatografii cieczowej oprócz odpowiednich właściwości chemicznych muszą spełniać kilka wymogów: powinny być dostępne w handlu, niedrogie, czyste, bezpieczne w użyciu, mało reaktywne (nie niszczyć próbki, wypełnienia kolumny i przyrządu), umożliwiać detekcję próbki i być o odpowiedniej lepkości i lotności. Rozpuszczalniki niżej wrzące mają tendencję do tworzenia baniek, mogą odparowywać w czasie rozdziału i zmieniać niekontrolowanie skład fazy ruchomej. Rozpuszczalniki wyżej wrzące mają zwykle dużą lepkość i wymagają stosowania wysokich ciśnień dla uzyskania odpowiedniej szybkości przepływu, a po rozdziale, przy odparowywaniu eluatu, mogą powodować straty analitu Rozdział metodą kolumnowej chromatografii adsorpcyjnej W adsorpcyjnej chromatografii kolumnowej analizowane substancje w postaci roztworu nanosimy na adsorbent wypełniający kolumnę. Wybór rozpuszczalnika zależy przede wszystkim od rozpuszczalności substancji chromatografowanych. Związek organiczny jest zawsze silniej adsorbowany z rozpuszczalnika niepolarnego niż polarnego. Natomiast już zaadsorbowany będzie tym silniej wypierany im bardziej polarny jest dany rozpuszczalnik. Następnie przemywając złoże (adsorbent w kolumnie) rozpuszczalnikiem rozwijamy chromatogram, czyli dzielimy mieszaninę na grupy związków lub poszczególne związki chemiczne i wymywamy je (eluujemy) z kolumny zbierając kolejne frakcje eluatu (rozpuszczalnika z eluującymi się związkami). Wymywanie można

10 prowadzić jednym rozpuszczalnikiem (elucja izokratyczna) lub kilkoma kolejno, albo mieszaniną rozpuszczalników o wzrastającej polarności (elucja gradientowa). Spływające z kolumny frakcje zbiera się oddzielnie. W ten sposób uzyskuje się rozdział badanej mieszaniny na składniki nieadsorbowane i adsorbowane coraz silniej przez adsorbent. Poszczególne frakcje odparowuje się i bada innymi metodami. Rozdzielając mieszaniny związków organicznych, a szczególnie substancji pochodzenia naturalnego, mimo wielu wskazówek, jakie można znaleźć w literaturze, zawsze wskazane jest wykonanie próby na wzorcach oznaczanych substancji, a następnie próby z małą ilością materiału. Poza tym, jak w przypadku innych metod empirycznych, potrzebna jest zawsze pewna doza inwencji eksperymentatora. Niejednokrotnie selektywny rozdział składników mieszaniny udaje się bardzo dobrze dopiero po uzyskaniu pewnego doświadczenia. Zasadniczą częścią każdego zestawu do chromatografii kolumnowej jest kolumna ze szkła obojętnego, której wymiary są dostosowane do skali przeprowadzanego rozdziału. Najczęściej mieszczą one od 10 do 100 g adsorbentu, co wystarcza do adsorpcji od 0,1 do kilku gramów substancji. Dla przyspieszenia elucji stosuje się słabe ssanie (pompka wodna) lub słabe tłoczenie. Napełnianie kolumny adsorbentem można przeprowadzać na sucho i na mokro. W metodzie na sucho adsorbent wsypuje się małymi porcjami do kolumny i ubija bagietką szklaną. Następnie przemywa się adsorbent rozpuszczalnikiem, w którym nanosi się badaną mieszaninę. Metoda na mokro polega na wprowadzaniu do kolumny zawiesiny adsorbentu w rozpuszczalniku użytym do rozpuszczania substancji. W obu metodach napełnianie należy wykonać tak, by złoże adsorbentu było jednorodne, pozbawione pęcherzyków powietrza i tak ułożone, by nie zmieniało objętości w czasie rozdziału. Powierzchnia adsorbentu powinna być stale pokryta płynem od chwili nalania pierwszych porcji rozpuszczalnika do zakończenia procesu. W przeciwnym razie złoże na kolumnie może łatwo wyschnąć, co uniemożliwi prowadzenie prawidłowej adsorpcji i może spowodować utlenianie się niektórych substancji. Na Rysunku 4 przedstawiono zestaw do chromatografii kolumnowej z zastosowaniem tłoczenia.

11 Rysunek 4. Zestaw do chromatografii kolumnowej z zastosowaniem tłoczenia 2.6. Cienkowarstwowa chromatografia adsorpcyjna (TLC) Chromatografia cieczowa, polegająca na rozdziale mieszaniny substancji na fazie stacjonarnej w postaci płaszczyzny, nazywa się chromatografią planarną. Fazą stacjonarną może być bibuła (chromatografia bibułowa) lub cienka, równomierna warstwa adsorbentu umieszczona na podłożu szklanym, metalowym czy z tworzywa sztucznego zwana płytką chromatograficzną (chromatografia cienkowarstwowa). Po zanurzeniu brzegu bibuły czy płytki chromatograficznej w fazie ruchomej, następuje przepływ fazy ruchomej wymuszony przez siły kapilarne. Substancje naniesione na płytkę będą przesuwały się wraz z fazą ruchomą (rozwijanie chromatogramu) lub pozostaną na miejscu naniesienia, jeśli moc elucyjna zastosowanej fazy ruchomej będzie niewystarczająca. Prędkość, z jaką substancje będą przesuwały się z fazą ruchomą, zależy od ich wzajemnego oddziaływania z fazą stacjonarną i fazą ruchomą oraz oddziaływania fazy ruchomej z fazą stacjonarną. Jeśli różnice w prędkości poruszania się poszczególnych substancji będą wystarczające, po pewnym czasie każda z substancji znajdzie się w innym miejscu płytki chromatograficznej nastąpi rozdział. Miejsce położenia substancji na płytce chromatograficznej określa współczynnik opóźnienia oznaczany symbolem R f, a wyrażający stosunek drogi przebytej przez substancję do drogi przebytej przez fazę ruchomą. Współczynnik R f jest wielkością charakterystyczną dla danej substancji i układu chromatograficznego: fazy stacjonarnej i fazy ruchomej. Na Rysunku 5 przedstawiono komorę chromatograficzną z fazą ruchomą oraz prawidłowy sposób zanurzania w niej płytki z naniesionymi próbkami. Obok przedstawiono rozwinięty i wywołany chromatogram próbek x, y oraz z.

12 Rysunek 5. Komora chromatograficzna z zanurzoną płytką i chromatogram TLC uzyskany dla próbek x, y oraz z (interpretacja poniżej) Współczynniki R f dla poszczególnych substancji wynoszą: dla substancji 1: R f = a/f, dla substancji 2: R f = b/f, dla substancji 3: R f = c/f, dla substancji 4: R f = d/f, dla substancji 5: R f = e/f. Dla substancji bezbarwnych istnieje szereg metod wizualizacji ich miejsca położenia na płytce chromatograficznej (wywoływanie chromatogramu). Metody te zależą od właściwości chemicznych i fizycznych badanych substancji. Bardzo często wywoływanie chromatogramu polega na przeprowadzeniu reakcji barwnych. Inną metodą jest zwęglanie substancji, absorpcja par jodu czy wizualizacja pod lampą UV. Substancje barwne nie wymagają wywoływania. Na chromatogramie TLC próbek x, y oraz z (Rysunek 5) należy zauważyć, że: plamy od 1 do 5 odpowiadają prawdopodobnie pojedynczym substancjom 1-5, substancja 1 znajduje się w próbce x, substancja 2 i 4 znajduje się w próbce z, substancja 3 znajduje się w próbce x i z (ta sama wartość R f ), substancja 5 znajduje się w próbce x i y (ta sama wartość R f ), pozostałe plamy odpowiadają nierozdzielonym substancjom, identyfikacja nie jest możliwa, plamy na starcie pochodzą od substancji nieoddziaływających z fazą ruchomą, za to silnie adsorbowanych przez fazę stacjonarną, pojedyncza plama nie musi odpowiadać jednej substancji, dopiero gdy plama jest pojedyncza na chromatogramach TLC uzyskanych w rożnych układach chromatograficznych, możemy założyć, że odpowiada jednej substancji.

13 3. Wykonanie ćwiczenia 3.1. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest ekstrakcja wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) w próbkach gleby. Przygotowanie próbki do analizy obejmuje: ekstrakcję węglowodorów z gleby, wydzielenie z ekstraktu frakcji węglowodorów alifatycznych i frakcji wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) za pomocą adsorpcyjnej chromatografii cieczowej, ocenę rozdziału za pomocą chromatografii cienkowarstwowej Pobór próbek gleby Glebę pobrano metalową łopatką i umieszczono w szklanych pojemnikach. Po przyniesieniu do laboratorium próbki rozłożono cienką warstwą na folii aluminiowej, usuwając duże cząstki roślinne i kamienie, i pozostawiono do wysuszenia. Tak wysuszona gleba nazywa się glebą powietrznie suchą Ekstrakcja gleby i przygotowanie ekstraktu do rozdziału Powietrznie suchą glebę rozetrzeć w moździerzu. Odważyć próbkę o masie 30 g. Naważkę gleby umieścić w kolbie stożkowej o pojemności 100 ml, dodać 50 ml mieszaniny eteru naftowego i dichlorometanu (3:2, v:v). Kolbę umieścić w łaźni ultradźwiękowej na 15 min. Następnie osad zdekantować, ekstrakt przesączyć przez bezwodny siarczan sodu umieszczony na sączku z bibuły filtracyjnej do kolbki gruszkowej o pojemności 100 ml. Do gleby dodać świeżą porcję 25 ml mieszaniny eteru naftowego i dichlorometanu i ekstrahować w łaźni ultradźwiękowej 10 min, następnie przesączyć przez ten sam sączek. Do połączonych ekstraktów dodać 0,2 ml toluenu i odparować na wyparce obrotowej, przy temperaturze łaźni wodnej nie przekraczającej 30ºC, do objętości poniżej 0,5 ml (warstwa oleju na ściankach kolbki). Do ekstraktu dodać 1 ml eteru naftowego. W razie trudności w rozpuszczeniu ekstraktu można dodać 1-2 krople toluenu i lekko podgrzać zawartość kolbki w łaźni wodnej, w ostateczności próbkę można nanieść na kolumnę w postaci zawiesiny Przygotowanie kolumny do rozdziału W kolbce stożkowej o pojemności 25 do 50 ml umieścić 4 do 6 g żelu krzemionkowego (żelu nie należy ważyć, proszę czekać na wskazówki prowadzącego), zalać go taką ilością eteru naftowego,

14 aby słup cieczy nad zawiesiną wynosił ok. 1 cm. Zawartość kolbki mieszać ruchem łagodnym, tak by usunąć pęcherzyki powietrza z zawiesiny. W kolumnie chromatograficznej umieścić na przegrodzie ze szkła 1 krążek bibuły filtracyjnej. Następnie przygotować naczynie na rozpuszczalnik z przemywania kolumny. Zawiesinę żelu krzemionkowego lekko wymieszać i wlać przez lejek do kolumny unikając zbędnego napowietrzania. Wlać tyle zawiesiny, aby złoże adsorbentu po ułożeniu się w kolumnie miało wysokość 6 do 8 cm. Po napełnieniu i ułożeniu adsorbentu w kolumnie na wierzch złoża nałożyć krążek bibuły, następnie przemyć zawartość kolumny 6 ml eteru naftowego (lub więcej aż do osiągnięcia stałej wysokości złoża w kolumnie) i zamknąć wypływ z kolumny. Należy pamiętać, by warstwa adsorbentu była stale pokryta rozpuszczalnikiem! 3.5. Nanoszenie ekstraktu na kolumnę Jeśli ekstrakt był podgrzewany należy go schłodzić do temperatury pokojowej. Wypuścić z kolumny nadmiar eteru naftowego, tak by wysokość cieczy nad złożem wynosiła 1-2 mm. Nanieść roztwór analizowany na czoło kolumny, wlewając go powoli pipetą lub strzykawką najlepiej po ściance kolumny tuż nad powierzchnią żelu. Od momentu naniesienia ekstraktu na kolumnę rozpoczyna się zbieranie frakcji. Gdy roztwór znajdzie się w złożu a wysokość cieczy nad złożem wyniesie ok. 1-2 mm, wlać ostrożnie po ściance kolumny 1 ml eteru naftowego i odczekać jak poprzednio (można przyspieszyć przepływ fazy ruchomej stosując lekkie nadciśnienie). Czynność tę powtórzyć jeszcze raz, używając następną, 1 ml porcję eteru naftowego. Gdy składniki ekstraktu są zaadsorbowane na złożu, można dodać pozostałą objętość eteru naftowego, wynikającą z rozmiarów złoża i warunków rozdziału podanych poniżej i prowadzić wymywanie frakcji węglowodorów alifatycznych i WWA Warunki rozdziału Adsorbent - żel krzemionkowy MN-Kieselgel 60 o wielkości ziarna poniżej 0,08 mm Wymiary złoża adsorbentu - 1 cm x 6 cm; Elucja: I frakcja - 12 ml eteru naftowego, zawiera węglowodory alifatyczne II frakcja - 25 ml mieszaniny eteru naftowego i toluenu (9:1, v:v), zawiera WWA. Wartości podane są dla złoża o wysokości 6 cm. Jeśli wysokość złoża jest inna objętości frakcji należy proporcjonalnie zmienić.

15 3.7. Ocena jakości rozdziału za pomocą chromatografii cienkowarstwowej Jeśli stężenie WWA i węglowodorów alifatycznych w glebie jest małe, frakcje można zatężyć na odparowywaczu obrotowym. Warunki analizy TLC: płytki z żelem krzemionkowym 60 na foli aluminiowej (TLC Silica gel 60 firmy Merck), faza ruchoma cykloheksan : toluen (67:33,v:v), wizualizacja pod lampą UV. Wykonanie analizy TLC: dopasować rozmiary płytki do komory chromatograficznej, narysować delikatnie ołówkiem linię startu w odległości ok.1 cm od brzegu płytki i zaznaczyć na niej punkty nanoszenia roztworów (punkty opisać delikatnie ołówkiem), nanieść na płytkę po kilka mikrolitrów roztworu wzorców WWA, frakcji WWA i frakcji węglowodorów alifatycznych, uważając, by plamka nie miała średnicy większej niż 5 mm; im mniejsza średnica, tym mniejsze rozmycie plamki w czasie rozwijania chromatogramu, odparować rozpuszczalnik za pomocą ręcznej suszarki, wlać do komory chromatograficznej taką objętość fazy ruchomej, by po wstawieniu płytki, plamki naniesionych substancji nie dotykały lustra cieczy, delikatnie, przy pomocy pincety, wstawić płytkę chromatograficzną z naniesionymi substancjami do komory chromatograficznej; boki płytki nie mogą dotykać ścian komory, komorę zamknąć i rozwijać chromatogram, płytkę wyjąć z komory, gdy czoło rozpuszczalnika będzie w odległości mniejszej niż 1 cm od brzegu, zaznaczyć ołówkiem czoło fazy ruchomej i odparować fazę ruchomą (do zaniku zapachu toluenu), przy pomocy pincety umieścić płytkę pod lampą UV i ołówkiem obrysować widoczne plamki, wyznaczyć współczynnik R f, dla wszystkich plamek, wyznaczyć zakres współczynników R f, dla frakcji II, na podstawie chromatogramu TLC ocenić jakość rozdziału WWA od węglowodorów alifatycznych na kolumnie z żelem krzemionkowym Sporządzenie sprawozdania W sprawozdaniu powinno się znajdować:

16 zwięzły opis technik zastosowanych do izolacji WWA i węglowodorów alifatycznych z gleby, opis próbki, warunki ekstrakcji, warunki rozdziału na kolumnie, warunki rozdziału na płytkach TLC, schemat blokowy, ideowy wykonania oznaczenia, ocena jakości rozdziału i dyskusja wyników. 4. Odczynniki żel krzemionkowy żel krzemionkowy MN-Kieselgel 60 o wielkości ziarna poniżej 0,08 mm, odmyty od plastyfikatorów i aktywowany w temp. 150 C przez 10 godzin, roztwory wzorcowych WWA, eter naftowy destylowany, toluen destylowany, cykloheksan destylowany, dichlorometan destylowany, bezwodny siarczan(vi) sodu cz.d.a., rozpuszczalniki do mycia. 5. Sprzęt i szkło laboratoryjne kolumna szklana z kranikiem, przedłużacz do kolumny, kolba stożkowa o poj. 50 ml 2 szt, kolba stożkowa o poj. 100 ml 1 szt, cylindry miarowe o poj. 10 ml - 1 szt., 25 ml - 1 szt., 50 ml - 1 szt, pipeta z tłoczkiem lub strzykawka szklana o poj. 2 ml - 2 szt, lejek szklany - 2 szt, kolbki okrągłodenne lub gruszkowe poj. 50 ml - 3 szt, kolbki gruszkowe poj. 100 ml - 1 szt, zestaw do tłoczenia przez kolumnę - 1 szt, łyżka metalowa - 2 szt, moździerz porcelanowy - 1 szt,

17 sączki z bibuły filtracyjnej, naczynie szklane na próbkę gleby, komora chromatograficzna 2 szt., płytki TLC, strzykawka o poj. 10 µl z płasko zakończoną igłą, pinceta, odparowywacz obrotowy, lampa UV, ołówek, linijka, suszarka ręczna, rękawice ochronne, lateksowe. Literatura 1. Behnke M., Szymański J. Problemy Ocen Środowiskowych, Nr 3(26), 2004, EKO - KONSULT, Gdańsk-Oliwa. 2. Szczepaniak W., Metody instrumentalne w analizie chemicznej. W-wa, PWN, Minczewski J., Marczenko Z., Chemia analityczna. W-wa, PWN, 1985, tom Kocjan R. Chemia analityczna, podręcznik dla studentów, W-wa, PZWL, 2000, tom Staszewski R. Kontrola chemicznych zanieczyszczeń środowiska, Podstawy teoretyczne z ćwiczeniami laboratoryjnymi, Politechnika Gdańska, Gdańsk, Jerzmanowska, Z., Preparatyka organicznych związków chemicznych, PZWL,W-wa, Namieśnik J. Metody instrumentalne w kontroli zanieczyszczeń środowiska. J., Politechnika Gdańska, Gdańsk,1992.