Prof. dr hab. Joanna Trylska Rada Naukowa Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk w Warszawie

Transkrypt

1 ul. S. Banacha 2c, Warszawa TEL.: , FAX: , sekretariat@cent.uw.edu.pl Warszawa, 10 października 2017 Prof. dr hab. Joanna Trylska joanna@cent.uw.edu.pl Rada Naukowa Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk w Warszawie Recenzja rozprawy doktorskiej mgra Marcina Magnusa pt. "Opracowanie narzędzi komputerowych do przewidywania struktury trzeciorzędowej RNA" Przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska mgra Marcina Magnusa zatytułowana "Opracowanie narzędzi komputerowych do przewidywania struktury trzeciorzędowej RNA" została przedłożona Radzie Naukowej Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk. Rozprawa doktorska została wykonana w Międzynarodowym Instytucie Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie pod kierunkiem prof. dra hab. Janusza Bujnickiego. Głównym celem pracy było opracowanie strategii i protokołów przewidywania struktury przestrzennej cząsteczek RNA. Autor rozprawy zastosował do tego celu różne techniki modelowania i obliczeniowe, w szczególności stworzył narzędzia komputerowe do oceny jakości przewidzianych modeli cząsteczek RNA (mqaprna) oraz do przewidywania struktury RNA (EvoClustRNA). Przewidywanie struktury trzeciorzędowej RNA, ze względu na skomplikowaną architekturę tych cząsteczek powodującą ich dużą giętkość, jest niezwykle trudne. Metody przewidywania struktury drugorzędowej z sekwencji (czyli struktury pierwszorzędowej) są w dużej mierze opanowane i w większości przypadków się sprawdzają ale przewidywanie kontaktów trzeciorzędowych jest cały czas nierozwiązanym problemem i przedmiotem badań. Dodatkowo cząsteczki RNA nie przyjmują zwykle jednej konformacji w roztworze tylko znajdują się w wielu równowagowych stanach o podobnych energiach swobodnych co utrudnia przewidywanie ich struktury. Ponadto, równowagi te istotnie zależą od środowiska, na przykład jonów, w których najistotniejsze są jony dwuwartościowe, gdyż wykazano, że są one często niezbędne do poprawnego zwinięcia się cząsteczki RNA. Tak więc mimo tego, że problem przewidywania struktury przestrzennej RNA jest zdefiniowany podobnie jak przy określaniu struktury przestrzennej białek i wynika z podstawowych oddziaływań elektromagnetycznych to rozwiązanie tego problemu jest istotnie różne niż dla białek, które w większości przypadków są globularne i przyjmują jeden dobrze określony sposób zwinięcia struktury. W pracy można wyszczególnić dwa główne zadania i jedno poboczne. Pierwsze dotyczy sytuacji, gdy przy pomocy znanych metod i narzędzi przewidywania struktury przestrzennej cząsteczek RNA badacz otrzymuje wiele podobnych modeli spełniających określone kryteria. Pojawia się pytanie, który model jest najbliższy strukturze natywnej, a tak naprawdę strukturze pochodzącej z

2 doświadczeń magnetycznego rezonansu jądrowego lub krystalografii, bo do takich struktur możemy się obecnie porównywać. Każda z pojedynczych metod przewiduje i ocenia modele w różny sposób. Autor rozprawy stworzył narzędzie, tzw. meta-predyktor, które łączy wszystkie oceny i na podstawie uczenia maszynowego ocenia ich jakość i wybiera najlepszy model. Ponadto, jeśli użytkownik ma jakąś dodatkową wiedzę o strukturze, której wcześniejsze podstawowe programy nie miały to może ją dodać jako kolejny czynnik w wyborze najlepszego modelu. Narzędzie to zostało nazwane mqaprna, od model quality assessment program, i jest dostępne przez serwis internetowy. Drugie zadanie dotyczyło samego przewidywania struktury przestrzennej cząsteczek RNA. Autor rozprawy zastosował do cząsteczek RNA podejście, które jest z sukcesem stosowane do białek. Wykorzystał to, że sekwencje cząsteczek RNA należące do tej samej rodziny zwykle zwijają się do podobnej struktury przestrzennej (trzeciorzędowej). Przeprowadził więc niezależne przewidywania struktury sekwencji homologicznych, aby sprawdzić wzajemne ułożenie regionów helikalnych, które są przeważnie najlepiej zachowane (konserwowane). Ten wieloetapowy protokół przewidywania struktury przestrzennej RNA został także zaprogramowany jako narzędzie do używania dla innych badaczy (EvoClustRNA). Trzecim zadaniem autora było stworzenie pakietu oprogramowania do tzw. "obróbki" plików formatu PDB (Protein Data Bank). Pakiet ten to biblioteka w języku Python, która ma bardzo różnorodną funkcjonalność i między innymi ułatwia odbudowę brakujących atomów w strukturach cząsteczek RNA. Rozprawa doktorska mgra Magnusa została napisana w języku angielskim i składa się z siedmiu głównych rozdziałów oraz bibliografii. Część tytułowa zawiera także podziękowania, skróty, listę publikacji autora i finansowanie. Sama rozprawa zawiera 110 stron i około 120 odnośników literaturowych. W Rozdziale 1 (Wstęp) przedstawiony jest opis architektury RNA oraz metod służących do przewidywania struktury tych cząsteczek. Jest także krótki opis metod doświadczalnych wspomagających określanie struktury drugorzędowej RNA i są one zebrane w bardzo czytelną tabelę z opisem do czego dokładnie służą. Metody te wspomagają też komputerowe przewidywanie struktury przestrzennej RNA oraz ocenę ich jakości. Na przykład więzy odległościowe z danych doświadczalnych zostały wykorzystane przez autora rozprawy w programie do oceny jakości modeli cząsteczek RNA. Następnie autor opisuje koncepcję rodziny RNA i uliniowienia sekwencji RNA. Autor stwierdza, że w przewidywaniu struktury RNA może być wykorzystana informacja o pochodzeniu tego RNA, czyli przynależności do rodziny (mającej wspólnego przodka). Jeśli dla jakiegoś członka rodziny znana jest struktura przestrzenna to ta informacja może być z sukcesem wykorzystana dla RNA o nieznanej strukturze ale należącego do tej samej rodziny. Podobnie informacja z uliniowienia sekwencji sugeruje, że członkowie tej samej rodziny przyjmują podobne struktury przestrzenne. W ostatnim podrozdziale Wstępu opisane są założenia konkursu RNA-Puzzles, w którym autor wykorzystał jedno ze stworzonych narzędzi - EvoClustRNA. W tym konkursie, podobnym do konkursu CASP prowadzonego od wielu lat dla białek, badacze dostają informacje o sekwencji RNA i przewidują ich struktury przestrzenne. Struktury krystaliczne tych RNA nie są jeszcze opublikowane i dopiero po wysłaniu przewidywań badacze dowiadują się czy ich model był bliski strukturze, którą cząsteczka RNA przyjęła w krysztale. Autor wymienia też w tabeli sposoby porównywania jakości modelu ze strukturą krystaliczną. Pokazuje też wyniki konkursu, w którym brał udział, a także podkreśla, że nadal badacze nie potrafią dobrze przewidzieć niekanonicznych kontaktów trzeciorzędowych i jest to największy problem całej dziedziny dotyczącej przewidywania struktury trzeciorzędowej cząsteczek RNA.

3 W Rozdziale 2 autor przedstawił krótko cele rozprawy. W Rozdziale 3 zatytułowanym Materiały i Metody autor wymienia i krótko opisuje moce obliczeniowe, oprogramowanie, bazy danych i serwery internetowe, z których korzystał. Następnie opisuje zasady testowania algorytmu mqaprna. Opisuje też zestaw metod, które wybrał do przewidywania energii modeli RNA. Porównywanie struktury drugorzędowej było oparte o deskryptor INF tzw. Interaction Network Fidelity. Opisane są też metryki do porównywania funkcji oceny czy struktur, takie jak RMSD (ang. root mean square deviation) czy Enrichment Score oraz analizę statystyczną wyników. Autor opisuje też sposób tworzenia EvoClustRNA, wyszukiwanie podobnych sekwencji na podstawie bazy Rfam, czy analizę skupień dla wielu struktur. W Rozdziale 4 autor opisuje wyniki. Zaczyna od narzędzia mqaprna. To narzędzie służy do szeregowania modeli przestrzennych RNA, uzyskanych różnymi technikami i programami, pod względem ich jakości. W ten sposób można obejść wady pojedynczych metod i jednocześnie uwypuklić ich zalety. Narzędzie mqaprna opiera się więc na znanych metodach ale wyniki tych metod są szczegółowo analizowane, żeby wybrać najlepszy model RNA. Autor opisuje jak wygenerował zestaw tzw. decoys, czyli struktur podobnych do natywnych ale złych. Takie struktury typu decoys służą do uczenia oprogramowania rozróżniania podobnych struktur (niepoprawnych od poprawnych). Trenowanie programu na tych strukturach odbywało się za pomocą algorytmu uczenia maszynowego. Dla każdej ze struktur autor uzyskał ocenę programami podstawowymi i każda ze struktur miała przypisanych około 70 deskryptorów ale ostatecznie oceniano RMSD w stosunku do struktury natywnej. Tym samym autor mógł ilościowo określić zależność między deskryptorami a RMSD. Serwer mqaprna pozwala na automatyczne użycie protokołu oceny struktur. Użytkownik wczytuje dowolną ilość plików (w formacie PDB) ze strukturami RNA, inne podstawowe programy są uruchamiane przez ten serwer i jako wynik użytkownik otrzymuje ocenę liczbową każdej struktury. Można też dodać więzy, na przykład wynikające z doświadczeń typu SHAPE albo informację o strukturze drugorzędowej. W drugiej części wyników autor opisuje EvoClustRNA, czyli narzędzie do przewidywania struktury przestrzennej RNA z uwzględnieniem informacji pochodzącej z uliniowienia sekwencji RNA. Znajdowane są najpierw sekwencje homologiczne, następnie są obliczane modele dla wszystkich RNA zawierających sekwencje homologiczne (albo programem Rosetta albo simrna), następnie regiony ewolucyjnie zachowane są wycinane i podlegają analizie skupień (tzw. klastrowaniu). Model ostateczny jest tworzony na podstawie najbardziej powszechnych podstruktur występujących w homologach. Takie podejście poprawiło przewidywanie obszarów helikalnych ale nie za bardzo pomogło w przewidywaniu kontaktów trzeciorzędowych. Autor opisuje też zastosowanie EvoClustRNA dla dwóch modeli w konkursie RNA-Puzzles (ryboprzełączników) oraz dziewięciu struktur znanych z wcześniejszych doświadczeń. Wyniki EvoClustRNA porównywał z wynikami uzyskanymi metodami i programami innych grup badawczych. EvoClustRNA poprawił jedynie nieznacznie wyniki przewidywań co autor dyskutuje w dalszej części rozprawy. Najlepszy okazał się model Weinberg et al. z 2016 roku oparty na tzw. direct coupling method. W ostatniej części wyników autor opisuje też stworzoną w języku python bibliotekę funkcji czyli zestaw narzędzi rna-pdb-tools. Funkcjonalność rna-pdb-tools jest klarownie przedstawiona w tabeli na stronie 60. Należy podkreślić, że ten zestaw narzędzi zawiera obszerny podręcznik użytkownika. W Rozdziale 5 autor dyskutuje otrzymane wyniki. Dyskusja jest obszerna i ciekawa. Autor pokazuje problemy różnych metod związane z przewidywaniem struktur przestrzennych RNA. Wyjaśnia krok po kroku dlaczego większość metod przewidywania struktury RNA nie zadziałała

4 właściwie. Okazało się, że średnio metoda oparta na koewolucji tzw. direct coupling analysis (Weinreb et al., 2016) daje najlepsze wyniki. W ostatnim Rozdziale 6 znajduje się krótkie podsumowanie najważniejszych wyników badań prowadzących do powstania rozprawy doktorskiej. Na uwagę zasługuje rysunek pokazujący całościowe podejście do problemu przewidywania struktury przestrzennej RNA, gdyż jasno przedstawia proponowane przez autora rozwiązania i etapy, w których jego metody i narzędzia mogą pomóc. Rozprawa jest spójna tematycznie, ciekawie zaprezentowana, a algorytmy dobrze przemyślane. Mam do niej kilka uwag i pytań. Uwagi te stanowią jednak punkty do dyskusji i nie umniejszają wagi stworzonych narzędzi oraz protokołów postępowania. Wstęp: Autor wymienia dwa podejścia do modelowania struktury przestrzennej RNA. Jedno z zasad pierwszych (tzw. ab initio), a drugie oparte na statystyce i wiedzy o poznanych już strukturach. Ale czytając dalej ciężko się zorientować, które programy czy metody można zakwalifikować do pierwszego podejścia bo tylko wymienione są pełnoatomowe pola siłowe i technika dynamiki molekularnej, które w ogólności nie służą w zasadzie do przewidywania struktur przestrzennych RNA. Ciężko to potem także wywnioskować z Tabeli. We wstępie na stronie 2 i w kilku innych miejscach (na przykład w Conclusions) pada stwierdzenie, że ".. in order to conduct any function, RNA molecule must fold into a specific structure". Nie zawsze tak być musi, gdyż są przecież fragmenty, które muszą się rozwinąć, żeby pełnić swoją funkcję (na przykład termometry RNA). Wstęp, strona 2: czy na pewno możemy napisać, że struktura drugorzędowa RNA to "canonical interactions between the bases in an RNA chain"? Cel pracy: Według mnie celem pracy nie jest dostarczenie narzędzi (bo to jest sprawa napisania odpowiedniego oprogramowania) a stworzenie i opracowanie protokołów i algorytmów opartych na pewnych koncepcjach autora wykorzystania m. in. uczenia maszynowego czy podejść wcześniej stosowanych do białek. W celu pracy zgubił się trochę wkład intelektualny autora w koncepcje pracy... Po przeczytaniu Wstępu i Metod ogrom oprogramowania czy funkcji oceny wymienionych w rozprawie trochę przytłacza czytelnika i początkowo można odnieść wrażenie, że autor tylko żonglował oprogramowaniem innych. Dopiero w Wynikach pojawia się informacja o wkładzie merytorycznym autora w stworzenie określonego narzędzia. Chyba niepotrzebnie autor przedstawił część wyników w taki sposób, że wyglądają one jak manipulacja oprogramowaniem i narzędziami innych grup i stosowanie ich w odpowiedniej kolejności. Nie do końca rozumiem porównanie na rysunku Wydaje się oczywistym, że mqaprna powinien dawać najlepsze wyniki skoro pozostałe metody są metodami podstawowymi, a mqaprna zbiera i procesuje informacje z tych właśnie metod. Czy autor spodziewał się, że nie oceni dobrze jakości struktur i wybierze zły model?

5 Dlaczego w wynikach EvoClustRNA pokazany jest jedynie RMSD jako deskryptor porównujący modele do struktur krystalicznych skoro wcześniej autor opisywał też sieć kontaktów (INF)? Może ta miara dałaby inne porównanie EvoClustRNA z modelami uzyskanymi innymi programami? Dyskusja: Autor stwierdza, że mqaprna może być przydatne tylko gdy ma oceniać dokładne modele (strona 69, górny wiersz). Ale wtedy mqaprna przestałby być potrzebny, jeśli mielibyśmy same poprawne modele, czy nie? Dyskusja: Na stronie 71 autor wymienia istotne wyzwania w dziedzinie przewidywania struktury 3D RNA, m. in. poprawę przewidywania pętli. Ale dlaczego pętle miałyby być takie istotne skoro wiadomo, że są ruchliwe i wobec tego może wcale nie musimy ich położenia względem reszty struktury określać? Podrozdział Autor chciałby zaimplementować funkcje do Biopythona. Ciągle zmieniają się wersje samego pythona, czy to nie jest kłopotliwe dla użytkownika? Strona 80: Nie rozumiem zdania "This pseudoknot was used as an input for modeling and it was accurately modelled in all the predictions". Skoro informacja o pseudowęźle była w pliku wejściowym to chyba nic w tym dziwnego, że został on poprawnie wymodelowany? Podsumowanie: Skoro w dyskusji autor podkreśla, że metoda direct coupling analysis (coevolutionary restraints) działa najlepiej to dlaczego nie uwzględnił jej w proponowanym planie najlepszego możliwego w przyszłości algorytmu? w szczególności na rysunku 5.4.1? Mam jeszcze kilka uwag dotyczących formatowania rozprawy i stylu. Praca jest napisana poprawnie językowo ale autor nie uniknął drobnych błędów i niejasnych sformułowań. Nie obniżają one w żadnym stopniu wartości rozprawy i wyników badań ale wyszczególnienie ich wynika z mojej roli recenzenta. Na przykład: - strona XIV, powinno chyba być "List of Figures" czy "List of Tables" a nie "Table of Figures" czy "Table of Tables". Ponadto, "References" a nie "Reference". Rozumiem, że program Word robi "Table of Contents" automatycznie ale wiemy też, że często robi to źle, więc należy takie rzeczy sprawdzać albo używać innego edytora. - strona 1 zamiast "self-assembly3" powinno być "self-assembly" - strona 4 pierwszy wiersz, jest nadmiarowe "which" - strona 8, "between atoms" zamiast "between atomic atoms" - strona 9, powinno być "simulations of biomolecular systems" - strona 9, powinno być "building of structures based on fragments" - strona 15, powinny być "potential of mean force" - strona 24, powinno być "a clustering routine" a nie "routines" - strona 20, Rysunek 1.4.1, w podpisie jest informacja "marked with red arrows" a na rysunku nie zaznaczono czerwonych strzałek. - strona 21, niepasujące wtrącenie do pierwszego zdania w 1.5 "and how close" - strona 36, rysunek 4.1.2, Dlaczego rysunki B-F mają przerwę w łańcuchu głównym podczas, gdy rysunek A jej nie ma? Czy to ma wskazywać miejsca zmienione w tzw. decoys? - strona 38, powinno być "this structure" - strona 50, powinno być "structural fragments"

6 - strona 51 powinno być "hence" - strona 78 powinno być "they form" - strona 82 powinno być "to calculate" - strona 85, błędy: "A a new scoring", "pipline". Podsumowując, mgr Marcin Magnus ma już bardzo dobry dorobek publikacyjny jak na doktoranta. W momencie przedłożenia rozprawy był współautorem pięciu publikacji w bardzo dobrych czasopismach z listy filadelfijskiej. W dwóch pracach, w Nucleic Acids Research i RNA Biology, Marcin Magnus jest równorzędnym pierwszym autorem co wskazuje na wysoki udział w badaniach. Mgr Magnus był także beneficjentem dwóch programów Narodowego Centrum Nauki, Preludium i Etiuda. Należy podkreślić, że mgr Marcin Magnus podjął się bardzo trudnego zadania - przewidywania struktury trzeciorzędowej RNA oraz oceniania jakości tej struktury. Ta dziedzina jest nadal gorącym tematem badań i metody nie są tak dopracowane jak dla białek. Wykonał to zadanie bardzo dobrze. Przetestował nowe podejścia do problemu badania struktur cząsteczek RNA i na podstawie wymyślonych algorytmów stworzył też narzędzia, które ułatwią innym użytkownikom pracę nad cząsteczkami RNA. Stwierdzam, że rozprawa doktorska magistra Marcina Magnusa stanowi oryginalne rozwiązanie problemu naukowego, potwierdza ogólną wiedzę teoretyczną w dyscyplinie naukowej oraz umiejętność samodzielnego prowadzenia przez niego pracy naukowej. Tym samym rozprawa doktorska mgra Magnusa spełnia wszystkie warunki ustawy o tytule naukowym i stopniach naukowych. W związku z tym wnoszę o dopuszczenie mgra Marcina Magnusa do dalszych etapów przewodu doktorskiego.