PRACA DOKTORSKA. Aktywność transferazowa obojętnej alfa-glukozydazy i jej zmiany sezonowe w surowicy krwi karpi (Cyprinus carpio L.

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "PRACA DOKTORSKA. Aktywność transferazowa obojętnej alfa-glukozydazy i jej zmiany sezonowe w surowicy krwi karpi (Cyprinus carpio L."

Michalina Komorowska
8 lat temu
Przeglądów:

1 UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU WYDZIAŁ MEDYCYNY WETERYNARYJNEJ mgr inż. Julia Kotońska-Feiga PRACA DOKTORSKA Aktywność transferazowa obojętnej alfa-glukozydazy i jej zmiany sezonowe w surowicy krwi karpi (Cyprinus carpio L.) Promotorzy: Dr hab.inż. Wojciech Dobicki prof. nadzw. Instytut Biologii, Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt Prof. dr hab. Wojciech Nowacki Katedra Immunologii, Patofizjologii i Prewencji Weterynaryjnej, Wydział Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu WROCŁAW, 2011

karpi (Cyprinus carpio L.) Promotorzy: Dr hab.inż. Wojciech Dobicki prof. nadzw.

2 Praca doktorska została wykonana w Zakładzie Biochemii oraz Zakładzie Hydrobiologii i Akwakultury Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu

3 Wyrazy wdzięczności niech zechcą przyjąć Wszyscy Ci, którzy przyczynili się do powstania niniejszej rozprawy doktorskiej. D ziękuję: M oim P rom otorom dr hab. W ojciechow i D obickiem u prof. nadzw. oraz prof. dr hab. W ojciechow i N ow ackiem u za opiekę oraz cenne w skazów ki podczas w ykonyw ania tej pracy. K oleżankom i K olegom z Z akładu H ydrobiologii i A kw akultury za życzliw ość i m iłą atm osferę w pracy. P anu Profesorow i M aciejow i U gorskiem u oraz W szystkim P racow nikom K atedry B iochem ii, F arm akologii i Toksykologii W ydz. M edycyny W eterynaryjnej za um ożliw ienie w ykonyw ania niniejszej pracy w Ich K atedrze. M ojej M am ie i M ężow i za cierpliw ość i w yrozum iałość. Szczególnie dziękuję M ojem u T acie za inspirację i w sparcie naukow ym dośw iadczeniem.

K oleżankom i K olegom z Z akładu H ydrobiologii i A kw akultury za życzliw ość i m iłą atm osferę w pracy.

4 Spis treści SPIS TREŚCI... 1 WYKAZ STOSOWANYCH SKRÓTÓW WSTĘP KLASYFIKACJA HYDROLAZ O-GLIKOZYDÓW Klasyfikacja opierająca się głównie o specyficzność substratową Klasyfikacja na podstawie miejsca działania Klasyfikacja na podstawie dwóch podstawowych mechanizmów działania Klasyfikacja na podstawie strukturalnych cech enzymów (UniProt, Swiss-Prot) MECHANIZM DZIAŁANIA ALFA-GLUKOZYDAZ CHARAKTERYSTYKA I WYSTĘPOWANIE ALFA-GLUKOZYDAZ Alfa-glukozydazy mikroorganizmów i roślin Alfa-glukozydazy zwierzęce Kwaśne alfa-glukozydazy Obojętne alfa-glukozydazy (NAG) Mikrosomalne alfa-glukozydazy I i II Kompleksy alfa-glukozydazy w mikrokosmkach jelit CEL PRACY MATERIAŁ I METODY MATERIAŁY Odczynniki chemiczne Bufory, roztwory, żele Zwierzęta doświadczalne METODY Grupy doświadczalne zwierząt Odłowy i transport Badania podstawowe Mierzenie i ważenie ryb Pobieranie krwi Oddzielenie surowicy Oznaczanie glukozy w surowicy krwi karpia Oznaczanie cholesterolu całkowitego w surowicy krwi karpia Oznaczanie triacylogriceroli (triglicerydów) w surowicy krwi karpia Oznaczanie białka całkowitego w surowicy metodą Lowry ego i wsp. (1951)

Klasyfikacja na podstawie strukturalnych cech enzymów (UniProt, Swiss-Prot)... 10 1.2. MECHANIZM DZIAŁANIA ALFA-GLUKOZYDAZ... 13 1.3. CHARAKTERYSTYKA I WYSTĘPOWANIE ALFA-GLUKOZYDAZ... 15 1.3.1. Alfa-glukozydazy mikroorganizmów i roślin.

5 Oznaczanie aktywności hydrolitycznej obojętnej alfa-glukozydazy w surowicy krwi karpia Oznaczanie aktywności transferazowej alfa-glukozydazy w surowicy karpia Rozdział produktów reakcji transferazowej i identyfikacja poszczególnych produktów - Wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Elektroforeza białek surowicy i frakcji białkowych zawierających oczyszczany enzym Badania kinetyczne Częściowe oczyszczanie enzymu Wyznaczanie optimum ph dla aktywności alfa-glukozydazowej i dla aktywności hydrolitycznej i transferazowej Wyznaczanie optymalnego czasu inkubacji dla reakcji transferazowej Wyznaczanie progresji aktywności transferazowej enzymu w surowicy i preparacie enzymatycznym w zależności od temperatury Wyznaczanie oporności temperaturowej alfa-glukozydazy w preparacie enzymatycznym Badanie powinowactwa substratowego dla reakcji transferazowej, wyznaczenie szybkości początkowej V 0 i stałej Michaelisa-Menten Własności akceptorowe przenoszonej reszty glukozy w reakcji transferazowej katalizowanej przez obojętną alfa-glukozydazę z surowicy krwi karpia Obliczenia statystyczne WYNIKI BADAŃ WYNIKI BADAŃ PODSTAWOWYCH Długość i masa ryb Zawartość glukozy w surowicy krwi karpia Zawartość cholesterolu całkowitego w surowicy krwi karpia Zawartość triacylogliceroli w surowicy krwi karpia Zawartość białka całkowitego w surowicy krwi karpia Zmiany sezonowe aktywności hydrolitycznej obojętnej alfa-glukozydazy Zmiany sezonowe aktywności transferazowej obojętnej alfa-glukozydazy ANALIZA STATYSTYCZNA I JEJ OMÓWIENIE Podgrupy doświadczalne Rok badań Pora roku Wielkość ryb ROZDZIAŁ PRODUKTÓW REAKCJI TRANSFERAZOWEJ Rozdział produktów reakcji transferazowej i identyfikacja poszczególnych produktów. Wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC Częściowe oczyszcznie obojętnej alfa-glukozydazy Częściowe oczyszcznie obojętnej alfa-glukozydazy metodą chromatografii jonowymiennej USTALENIE OPTYMALNYCH WARUNKÓW DLA OZNACZENIA AKTYWNOŚCI TRANSFERAZOWEJ NAG

Elektroforeza białek surowicy i frakcji białkowych zawierających oczyszczany enzym... 37 3.2.

6 Wyznaczenie optymalnego ph reakcji hydrolitycznej (maltazowej) i transferazowej (transglikozylacji) NAG Wyznaczanie optymalnego czasu inkubacji Wpływ stężenia substratu na nasilenie równolegle przebiegających procesów hydrolizy i transglikozylacji pnglc Wyznaczanie progresji aktywności transferazowej enzymu w surowicy i preparacie enzymatycznym w zależności od temperatury Wyznaczanie oporności temperaturowej alfa-glukozydazy w preparacie enzymu POWINOWACTWO SUBSTRATOWE NAG DLA REAKCJI TRANSFERAZOWEJ Wyznaczenie szybkości początkowej V 0 dla różnych stężeń substratu Wyznaczanie stałych Michaelisa-Menten będących miarą powinowactwa substratowego Badanie powinowactwa akceptorowego różnych p-nitrofenylo-n-glikozydów monosacharydów dla przenoszonej przez NAG glukozy DYSKUSJA WNIOSKI STRESZCZENIE ABSTRACT LITERATURA ŹRÓDŁA INTERNETOWE SPIS RYCIN SPIS TABEL

.. 62 4.3.5. Wyznaczanie oporności temperaturowej alfa-glukozydazy w preparacie enzymu.... 63 4.5. POWINOWACTWO SUBSTRATOWE NAG DLA REAKCJI TRANSFERAZOWEJ... 65 4.5.1.

7 7. STRESZCZENIE Celem pracy było wykazanie zmian sezonowych aktywności transferazowej obojętnej alfa-glukozydazy w rocznym cyklu hodowlanym karpi oraz poznanie właściwości enzymu i kinetyki katalizowanej przez niego reakcji transferazowej. Badania prowadzono na rybach pochodzących z gospodarstwa rybackiego Milicz, w województwie dolnośląskim. Materiał do badań stanowiła surowica krwi, która została pobrana in vivo z serca w miesiącach: kwiecień, wrzesień i grudzień, w latach 2007 i W przeprowadzonych badaniach określono zmiany sezonowe aktywności hydrolitycznej i transferazowej a także podstawowych parametrów biochemicznych krwi. Określono również optymalne ph dla aktywności enzymu, czas inkubacji, a także oporność temperaturową NAG. Zbadano powinowactwo substratowe dla oligosacharydów i powinowactwo akceptorowe dla różnych monosacharydów. Z przeprowadzonych badań wynika, że aktywność hydrolityczna i transferazowa obojętnej alfa-glukozydazy a także wyniki podstawowych parametrów biochemicznych są najwyższe w okresie letnim, kiedy to ryby intensywnie żerują i pobierają pokarm. Najniższe wartości zanotowano na wiosnę, kiedy to karpie po okresie zimowania posiadają najniższą przemianę materii. Optymalne ph dla aktywności maltazowej wynosi 6,8 a dla aktywności transferazowej 7,0. Optymalny czas inkubacji dla pomiaru reakcji transferazowej mieści się w granicach 20 minut. Enzym jest termostabilny do temperatury 50 C w czasie do 60 minut a w obecności substratu jest aktywny do temperatury 60 C. Powinowactwo substratowe dla maltooligosacharydów ma zbliżone Km około 12 mm. Zbadano różne pochodne heksoz i pentoz określając ich powinowactwo akceptorowe, z którego wynika, że istotne dla reakcji transferazowej jest położenie ekwatorialne grupy OH na C-4 w cukrze, natomiast różnice w konfiguracji pozostałych węgli obniżają, ale nie hamują własności akceptorowych

Materiał do badań stanowiła surowica krwi, która została pobrana in vivo z serca w miesiącach: kwiecień, wrzesień i grudzień, w latach 2007 i 2008.

8 8.ABSTRACT The major aim of this work was to find out if changes in the transferase activity of neutral α-glucosidase (EC ) in the blood of carp (Cyprinus carpio L.), have seasonal character, along with its yearly physiological metabolic cycle. Also kinetics of transferase activity of this hydrolytic enzyme was a point of interest. Experiments were performed on animals from the Milicz Fish Farm in Lower Silesia, Poland. A material for experiments was the serum of blood, taken in vivo directly from animals hearts, on April, September and December of 2007 and The α-glucosidase hydrolytic and transferase activities, and other basic biochemical parameters were assayed. Optimal ph, incubation time, and temperature resistance, were determined before the standarized activity measurements. Enzyme s affinity for several oligosaccharide donors and different monosacharide acceptors, were also determined. Results of experiments show the highest of both, the hydrolytic as well as transferase activities of neutral α-glucosidase, are in the summer samples; when all other basic biochemical parameters also rich their maximal values. It reflects the natural, most intensive seasonal mobility of animals. The lowest results were found in spring samples (April), when carps have the slowest metabolism after the winter time. Optimal ph for the maltase (hydrolytic) activity is 6,8, and for the transferase activity ph 7,0. The best incubation time is up to 20 minutes. The enzyme is resistant up to the temperature of 50 C when incubated for 60 minutes, and up to 60 C at the presence of substrate. Km for a series of oligosaccharides is approximately 12 mm. Acceptor affinity values for different hexoses and pentoses show, that equatorial OH position at carbon 4 is essential for the transferase activity. Differences in other carbon configurations decrease, but do not eliminate the sugar acceptor abilities

Experiments were performed on animals from the Milicz Fish Farm in Lower Silesia, Poland.

Podobne dokumenty

Przemiana materii i energii - Biologia.net.pl

Przemiana materii i energii - Biologia.net.pl Ogół przemian biochemicznych, które zachodzą w komórce składają się na jej metabolizm. Wyróżnia się dwa antagonistyczne procesy metabolizmu: anabolizm i katabolizm. Szlak metaboliczny w komórce, to szereg