ANNA KANCELISTA BIODEGRADACJA ODPADÓW LIGNINOCELULOZOWYCH Z UDZIAŁEM GRZYBÓW STRZĘPKOWYCH PROF. DR HAB. DANUTY WITKOWSKIEJ

Transkrypt

1 UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU WYDZIAŁ NAUK O ŻYWNOŚCI KATEDRA BIOTECHNOLOGII I MIKROBIOLOGII ŻYWNOŚCI ANNA KANCELISTA BIODEGRADACJA ODPADÓW LIGNINOCELULOZOWYCH Z UDZIAŁEM GRZYBÓW STRZĘPKOWYCH PRACA DOKTORSKA WYKONANA POD KIERUNKIEM PROF. DR HAB. DANUTY WITKOWSKIEJ WROCŁAW 2012

2 Serdeczne podziękowania składam Pani promotor prof. dr hab. Danucie Witkowskiej za okazaną życzliwość i cierpliwość oraz inspirujące konsultacje w trakcie realizacji niniejszej pracy

3 Najpiękniejszą formą podziękowania za ofiarowaną nam pomoc jest późniejsze przekazywanie jej innym Seneka Dziękuję Mamie za wiarę we mnie i nieocenione wsparcie Tacie za to, że jest obok mnie Przyjaciołom za nieskończenie wiele radosnych chwil

4 Praca współfinansowana w ramach projektu Drugi program stypendialny dla doktorantów Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu Projekt współfinansowany przez Unię Europejską z Europejskiego Funduszu Społecznego oraz budżet państwa w ramach Zintegrowanego Programu Operacyjnego Rozwoju Regionalnego. Środki Europejskiego Funduszu Społecznego stanowią 75% wartości projektu, natomiast środki budżetu państwa wynoszą 25%.

5 Spis treści 1. Streszczenie 8 2. Przegląd literatury Wprowadzenie Budowa materiałów ligninocelulozowych Enzymy biorące udział w degradacji ligninocelulozy Intensyfikacja procesów biodegradacji odpadowych materiałów ligninocelulozowych Cel pracy Materiały i metody Materiały badawcze Drobnoustroje Otrzymywanie nowych szczepów na drodze mutagenizacji promieniami UV grzybów strzępkowych T. hamatum C Odpady ligninocelulozowe Modyfikacja odpadowych materiałów ligninocelulozowych Podłoża hodowlane Hodowle drobnoustrojów Przygotowanie zagęszczonych preparatów enzymatycznych Enzymatyczna hydroliza odpadowych materiałów ligninocelulozowych Metody badawcze Metody analityczne Inne metody Omówienie wyników Biosynteza celulaz i ksylanaz przez grzyby strzępkowe Trichoderma sp. i Aspergillus sp. w hodowlach wstrząsanych Biosynteza celulaz i ksylanaz przez grzyby strzępkowe Trichoderma sp. i Aspergillus sp. w hodowlach w podłożu stałym Próba zwiększenia aktywności enzymów degradujących ligninocelulozę na drodze mutagenizacji promieniami UV szczepu T. hamatum C Biosynteza lakaz w hodowlach wstrząsanych Otrzymywanie zagęszczonych preparatów enzymatycznych 94

6 Spis treści 5.6. Próby zastosowania zagęszczonych preparatów w enzymatycznej degradacji odpadów ligninocelulozowych Dyskusja wyników Wnioski Bibliografia Spis rysunków, tabel i fotografii 145

7 Słownik skrótów Wykaz skrótów stosowanych w pracy OKK OMP CGF zchomp ztomp zokk zcgf CMC CMCazy odpadowe kaczany kukurydziane odpadowy materiał pofiltracyjny poekstrakcyjny odpad kukurydziany (corn gluten feed) zmodyfikowany chemicznie odpadowy materiał pofiltracyjny zmodyfikowany termicznie odpadowy materiał pofiltracyjny zmodyfikowane metodą ekstruzji odpadowe kaczany kukurydziane zmodyfikowany metodą ekstruzji poekstrakcyjny odpad kukurydziany karboksymetyloceluloza enzymy wykazujące aktywność wobec karboksymetylocelulozy FPazy enzymy wykazujące aktywność wobec bibuły filtracyjnej Whatmann No. 1 DNS MS ZMS LT LH ZS ZSr PDA MEA AVWYSŁ C1 OKK XP OMP XP CGF XP OKK 1012 kwas 3,5-dinitrosalicylowy podłoże mineralne Mandels-Sternburg zmodyfikowane podłoże mineralne Mandels-Sternburg podłoże mineralne stosowane w kierunku biosyntezy lakaz przez grzyby strzępkowe Trichoderma podłoże mineralne Lindeberg Holm stosowane w kierunku biosyntezy lakaz przez grzyby białej zgnilizny zmodyfikowane podłoże Saundersa zmodyfikowane podłoże Saundersa z różem bengalskim ang. Potato Dextrose Agar ang. Malt Extract Agar preparat enzymatyczny uzyskany w wyniku zagęszczenia płynu po hodowli szczepu C1 w podłożu z celulozą Avicel (2%), wysłodkami buraczanymi (1%) i glukozą (0,25%) preparat enzymatyczny uzyskany w wyniku zagęszczenia płynu po hodowli szczepu XP w podłożu z odpadowymi kaczanami kukurydzianymi (4%) i glukozą (0,25%) preparat enzymatyczny uzyskany w wyniku zagęszczenia płynu po hodowli szczepu XP w podłożu z odpadowym materiałem pofiltracyjnym (3%) preparat enzymatyczny uzyskany w wyniku zagęszczenia płynu po hodowli szczepu XP w podłożu z poekstrakcyjnym odpadem kukurydzianym (4%) i glukozą (0,25%) preparat enzymatyczny uzyskany w wyniku zagęszczenia płynu po hodowli szczepu UVmutanta M1012 w podłożu z odpadowymi kaczanami kukurydzianymi (4%) i glukozą (0,25%)

8 Streszczenie 1. Streszczenie Przedmiotem niniejszej pracy był proces biodegradacji trzech odpadowych materiałów ligninocelulozowych pochodzących z przemysłu spożywczego z udziałem grzybów strzępkowych z rodzaju Trichoderma i Aspergillus. W pierwszym etapie pracy przeprowadzono hodowle wstrząsane trzech szczepów grzybów strzępkowych (T. hamatum C1, T. harzianum T33 i A. niger XP) w kierunku biosyntezy celulaz i ksylanaz w podłożu, gdzie główne źródło węgla i energii oraz induktor badanych enzymów stanowiły odpadowe kaczany kukurydziane (OKK) lub odpadowy materiał pofiltracyjny (OMP) albo poekstrakcyjny odpad kukurydziany (CGF) w ilości 2%. Określono profil biosyntezy badanych enzymów w podłożach z dodatkiem wzrastającego stężenia glukozy (0%, 0,25%, 0,50%, 0,75%) jako dodatkowego źródła węgla i energii inicjującego wzrost drobnoustrojów. Do kolejnego etapu badań wybrano sześć wariantów hodowli, podczas których określono wpływ różnych ilości (2%, 3%, 4%) odpadowej biomasy ligninocelulozowej (OMP, OKK, CGF) na poziom biosyntezy CMCaz, FPaz, ß-glukozydaz i ksylanaz przez dwa najefektywniejsze szczepy grzybów strzępkowych - T. hamatum C1 i A. niger XP. Jednocześnie przeprowadzono porównawczo hodowle wgłębne badanych grzybów w podłożu z dodatkiem źródeł węgla często stosowanych jako induktor badanych hydrolaz, tj. celulozą Avicel (2%), wysłodkami (1%) i glukozą (0,25%). Przeprowadzono także hodowle w podłożu stałym na odpadowej biomasie ligninocelulozowej. Podjęto także próbę zwiększenia efektywności biosyntezy celulaz i ksylanaz na drodze mutagenizacji promieniami UV na przykładzie szczepu T. hamatum C1. Otrzymano 16 mutantów, których zdolność do produkcji badanych enzymów określono podczas hodowli wgłębnej w podłożu, gdzie główne źródło węgla oraz induktor enzymów stanowiły odpadowe kaczany kukurydziane w stężeniu 4% (0,25% glukozy). Większość, bo aż jedenaście z szesnastu otrzymanych mutantów, produkowała FPazy na wyższym poziomie od szczepu rodzicielskiego, natomiast trzy nowe drobnoustroje syntetyzowały ß-glukozydazy efektywniej od T. hamatum C1. Do dalszych badań włączono najefektywniejszego mutanta, tj. M

9 Streszczenie Na podstawie analizy otrzymanych wyników wybrano pięć wariantów hodowli, w wyniku których otrzymano po zagęszczeniu płynów pohodowlanych pięć preparatów enzymatycznych (AVWYSŁ C1, OKK XP, OMP XP, CGF XP, OKK 1012) charakteryzujących się różnymi wartościami aktywności badanych enzymów. W ostatnim etapie niniejszej pracy podjęto próby zastosowania zagęszczonych preparatów własnych oraz porównawczo komercyjnych preparatów Celluclast 1,5 i Novozyme 188 w biodegradacji trzech odpadowych materiałów ligninocelulozowych. Stwierdzono, że sposób modyfikacji odpadów metodami obróbki wstępnej, ilość zastosowanego preparatu oraz czas trwania procesu miały istotne znaczenie w efektywnej degradacji odpadowej biomasy. Zaobserwowano wyższe wydajności prowadzonych procesów hydrolizy enzymatycznej w przypadkach, gdy stosowano własne zagęszczone preparaty otrzymane w wyniku indukcji odpowiednimi substratami w porównaniu do komercyjnych preparatów. Największą wydajność (48,62%) osiągnięto w procesie enzymatycznej hydrolizy modyfikowanych metodą ekstruzji odpadowych kaczanów kukurydzianych, po 72 godzinach procesu z substratu uwolnionych zostało 642,28 mg/g sm związków redukujących ogółem, w tym 512,27 mg/g sm glukozy oraz 121,42 mg/g sm pentoz. Produkty uwolnione z odpadowych materiałów ligninocelulozowych w wyniku ich enzymatycznej hydrolizy stanowią wartościowe związki znajdujące wykorzystanie w dalszych procesach biotechnologicznych. 9

10 Przegląd literatury 2. Przegląd literatury 2.1. Wprowadzenie Obserwowany w ostatnich latach intensywny rozwój rolnictwa oraz poszczególnych branż przemysłu spożywczego spowodował wzrost zagrożenia dla ochrony środowiska. Problem ten należy rozpatrywać bardzo szeroko, ponieważ degradacja środowiska naturalnego jest częściowo efektem działalności opartej na wytwarzaniu i spożywaniu żywności, gdzie pierwsze ogniwo łańcucha stanowi produkcja rolnicza, a ostatnie konsument. Istotne zagrożenia, jakie niesie ze sobą rozwój przemysłu rolno-spożywczego obserwuje się w zakresie gospodarki wodno-ściekowej, ochrony powietrza i gleby przed zanieczyszczeniami, ale najwięcej problemów generuje wzrastająca ilość powstających odpadów, w tym także odpadów organicznych. W zależności od branży w trakcie procesu produkcyjnego powstają odpady o różnym pochodzeniu, które przedstawiono na Rysunku 1. Produkcja rolnicza Pozostałości po zbiorze (słoma, liście, korzenie, nadmiar biomasy) Przemysł rolno-spożywczy Pulpy i osady, pozostałości po ekstrakcji i filtracji, wywary Hodowla zwierząt Ubojnie i przetwórstwo mięsne Odchody zwierzęce (gnojowica), pozostałości paszowe, materiał ściółkowy Treść żołądkowa, tłuszcz, krew, sierść, kości itp. Rys. 1. Pochodzenie odpadów rolniczych i z przemysłu rolno-spożywczego (Ledakowicz i Krzystek 2005). 10

11 Przegląd literatury Dyrektywa Rady 99/31/WE zobowiązuje do zmniejszania ilości składowanych odpadów w stosunku do masy wytwarzanej w 1995 roku o 25% do roku 2010, o 50% do roku 2013 i o 65% do roku Według Raportu o stanie środowiska województwa dolnośląskiego w 2010 roku wytworzono ,4 tys. ton odpadów pochodzenia przemysłowego. Największy odsetek wytworzonych odpadów (54%) poddano odzyskowi, 44% skierowano do składowania oraz unieszkodliwienia poza składowaniem, a 2% czasowo zmagazynowano [Raport o stanie środowiska w województwie dolnośląskim w 2010 roku]. Wstąpienie Polski do Unii Europejskiej doprowadziło do obowiązkowego dostosowania przepisów krajowych dotyczących ochrony środowiska (w tym gospodarki odpadami) do przepisów obowiązujących w krajach akcesyjnych. Obowiązujące przepisy prawne mają na celu zapewnienie jak najmniejszego zanieczyszczenia środowiska naturalnego, a w Krajowym planie gospodarki odpadami 2010 zawarto główne tezy, jakie będą przydatne w osiągnięciu zamierzonych celów. Jednym z zadań ujętych w powyższym dokumencie jest wspieranie wdrażania efektywnych ekonomicznie i ekologicznie technologii odzysku i unieszkodliwiania odpadów, a w tym technologii pozwalających na odzyskiwanie energii zawartej w odpadach w procesach termicznego i biochemicznego ich przekształcania. Roczna światowa produkcja biomasy roślinnej sięga 170x10 9 ton, z czego ponad połowę stanowią produkty uboczne. Biorąc pod uwagę określone zadanie należałoby zwrócić uwagę na jedną z grup odpadów generowanych w dużych ilościach przez rolnictwo oraz przemysł spożywczy odpady ligninocelulozowe. Odpadowa biomasa ligninocelulozowa stanowi produkt uboczny głównie w przemyśle owocowo-warzywnym, gorzelniczym, skrobiowym, a także w cukrowniach i zakładach gastronomicznych. Do odpadów ligninocelulozowych zalicza się również odpady z przetwórstwa drewna (np. trociny), produkcji papieru i tektury oraz domowe odpadki żywnościowe i ścieki ligninocelulozowe (Mtui 2009, Howard i inni 2003). W celu uniknięcia nagromadzenia się dużych ilości odpadów organicznych są one przetwarzane metodami biologicznymi lub termicznymi. Pierwsze z nich trwają dłużej, przebiegają w temperaturach niższych niż 80 C i w odróżnieniu do metod termicznych są bezpieczniejsze dla środowiska ponieważ nie prowadzą do powstawania substancji niebezpiecznych ani do emitowania do atmosfery gazów. Rozkład substancji organicznych w odpadach następuje w warunkach tlenowych (kompostowanie) lub w środowisku bez tlenu (fermentacja metanowa) (Kozak i inni 2005, Ledakowicz i Krzystek 2005). Alternatywną metodą zapobiegającą nadmiernemu zaleganiu odpadowej biomasy ligninocelulozowej jest ich biokonwersja w kierunku wartościowych produktów, między innymi takich jak bioetanol, 11

12 Przegląd literatury pasze, nawozy, biopestycydy, furfural, kwasy organiczne, ksylitol czy też wykorzystywane są w produkcji białka mikrobiologicznego (Mtui 2009, Bujak i Targoński 1990). Biopaliwa dotychczas wytwarzane było głównie z surowców skrobiowych i sacharozy. Nowo opracowane technologie pozwalają na wykorzystanie w tym kierunku biomasy celulozowej. Etanol celulozowy jest wytwarzany z drewna, traw lub niejadalnych części roślin (słoma zbóż, łodygi kukurydzy itp.) dwoma metodami biotechnologiczną i chemiczną. Pierwsza z tych metod składa się z czterech etapów: obróbki wstępnej materiału, hydrolizy enzymatycznej biomasy, oddzielenia cukrów oraz ich fermentacji z udziałem mikroorganizmów (Kłosowski i inni 2010, Badger 2002). Biopaliwa produkować można z ligninocelulozowych surowców organicznych niespożywczych, a skład oraz ogromne ilości biomasy ligninocelulozowej obecnej na całym świecie, jej odnawialność oraz niekonsumpcyjny charakter są głównymi argumentami popierającymi zasadność opracowania i wykorzystywania ekologicznych oraz ekonomicznych metod biodegradacji odpadowych materiałów ligninocelulozowych w kierunku pożądanych produktów Budowa materiałów ligninocelulozowych Biomasa roślinna powstaje w procesie fotosyntezy poprzez asymilację CO 2 z powietrza po wpływem promieniowania słonecznego, a jej ilość na początku XX wieku przewyższała 10-krotnie globalne zużycie energii (Pielecki i Targoński 2001), co świadczy o dużym, niewykorzystanym potencjale składników, z których jest zbudowana. Węgiel, zgromadzony w powstających związkach chemicznych, może ponownie trafić do obiegu poprzez ich enzymatyczny rozkład (Russel i inni 2005). Materiały ligninocelulozowe składają się z trzech głównych komponentów występujących wobec siebie w przybliżonym stosunku 4:3:3 i są to odpowiednio: celuloza, hemicelulozy i lignina (Abdel-Sater i El-Said 2001). Celuloza i hemicelulozy są biopolimerami zbudowanymi z cukrów, z kolei lignina stanowi polimer składający się z pochodnych aromatycznych alkoholi fenolowych. Na Rysunku 2 przedstawiono schematycznie rozmieszczenie poszczególnych frakcji ligninocelulozy w tkance roślinnej. Udział poszczególnych frakcji ligninocelulozy jest bardzo zróżnicowany i w dużym stopniu zależy od wieku, rodzaju i części rośliny, w której występują. Przykładowo można tutaj 12

13 Przegląd literatury wymienić udział procentowy celulozy, hemiceluloz oraz ligniny w powszechnie odzyskiwanych odpadach ligninocelulozowych: kolby kukurydziane (celuloza 45%, hemicelulozy 45%, lignina 15%), słoma ryżowa (celuloza 32%, hemicelulozy 24%, lignina 18%), słoma jęczmienna (celuloza 31-34%, hemicelulozy 24-29%, lignina 14-15%), pulpa trzciny cukrowej (celuloza 32-44%, hemicelulozy 27-32%, lignina 19-24%), pulpa kawowa (celuloza 35%, hemicelulozy 46,3%, lignina 18,8%), łupiny orzechów (celuloza 25-30%, hemicelulozy 25-30%, lignina 30-40%), papier gazetowy (celuloza 40-55%, hemicelulozy 25-40%, lignina 18-30%) (Sanchez 2009). S3 S2 S1 Ściana pierwotna Blaszka środkowa Celuloza Hemicelulozy Kompleks hemiceluloz i ligniny Rys. 2. Struktura tkanki roślinnej (a kompleks komórek roślinnych, b warstwy ściany komórkowej, c rozmieszczenie frakcji ligninocelulozy, S1 S2 S3 warstwy ściany wtórnej) (Perez i inni 2002) Celuloza Celuloza jest najpowszechniej występującym polimerem na kuli ziemskiej. Jej cząsteczka zbudowana jest z reszt β-d-glukozy połączonych wiązaniami β-1,4-glikozydowymi, przy czym podstawową jednostką celulozy jest dwucukier celobioza 13

14 Przegląd literatury (Rys. 3). Poszczególne łańcuchy celulozy połączone są między sobą wiązaniami wodorowymi i stabilizowane siłami Van der Waalsa, tworząc makrofibrylę (Russel i inni 2005). celobioza Rys. 3. Fragment łańcucha celulozy. Makrofibryla zbudowana jest z około 400 mikrofibryli, gdzie każda z nich stanowi 36 łańcuchów celulozy. Cząsteczka celulozy ma budowę liniową i występują w niej dwa charakterystyczne regiony krystaliczny (uporządkowany) i amorficzny (nieuporządkowany) odgrywające istotną rolę w podatności celulozy na rozkład enzymatyczny (van Wyk i Mohulatsi 2003) (Rys. 4). Obszary krystaliczne, który stanowią około 2/3 całości całego polimeru (do 100% u glonów Valonie masarophysa), charakteryzują się regularnym i równoległym ułożeniem łańcuchów, co powoduje ich wysoką trwałość oraz odporność na degradację, ponieważ enzymy nie mają możliwości wniknięcia do ich zwartej struktury. Z kolei obszary amorficzne (stopień krystaliczności 0%) to strefy, w których ułożenie poszczególnych łańcuchów jest nieregularne, występuje tu mniej wiązań wodorowych i obszar jest słabiej stabilizowany, co wpływa na zwiększenie podatności na hydrolizę enzymatyczną (Taherzadeh i Karimi 2008). Stopień polimeryzacji łańcuchów celulozy waha się w granicach od 500 do 2500 (Malherbe i Cloete 2002). 14

15 Przegląd literatury Rys. 4. Struktura fibryli celulozowych ( Hemicelulozy Hemicelulozy są heteropolisacharydami zbudowanymi z cukrów i ich pochodnych kwasów uronowych i stanowią drugą co do wielkości, po celulozie, materię obecną w naturze. Wśród węglowodanów, jakie wchodzą w skład hemiceluloz wyróżniamy pentozy (D-ksylan, D-arabinozę) oraz heksozy (D-glukozę, D-mannozę, D-galaktozę), poza tym ich składnikami budulcowymi są również kwasy heksauronowe - glukuronowy, galakturonowy, α-d-4-o metyloglukuronowy (Kumar i inni 2008, Polizeli i inni 2005). Główną frakcją wchodzącą w skład hemiceluloz są ksylany zbudowane z reszt ksylopiranozowych połączonych wiązaniami glikozydowymi w pozycji β-1,4. W zależności od pochodzenia ich łańcuch może być podstawiony różnymi grupami bocznymi: L-arabinofuranozowymi, acetylowymi lub 4-O-metyloglukuronowymi oraz kwasem ferulowym lub p-kumarowym (Rys. 5). Charakterystyczną formą składającą się tylko z reszt ksylozy jest homoksylan występujący bardzo sporadycznie i spotykany w tytoniu, trawie ostnicy i w glonach (Collins i inni 2005). Ksylany występują w drewnie miękkim (drzewa iglaste), drewnie twardym (drzewa liściaste) oraz trawach i nasionach. Głównym składnikiem drewna twardego jest glukuronoksylan (O-acetylo-4-O-metyloglukurono-β-D-ksylan), zaś charakterystycznymi jednostkami drewna miękkiego są arabino-4-o-metyloglukuronoksylany (Tokarzewska-Zadora i inni 2005). Stopień polimeryzacji ksylanów jest bardzo zróżnicowany i dla drewna twardego waha się 15

16 Przegląd literatury w granicy od 150 do 200, natomiast w drewnie miękkim wartość ta jest niższa reszt β-ksylopiranozowych (Collins i inni 2005). Stopień rozgałęzienia, a także zawartość grup metylowych i acetylowych odgrywają istotny wpływ na podatność hemiceluloz na działanie enzymów degradujących. Skład chemiczny hemiceluloz zależy nie tylko od rodzaju i gatunku rośliny, ale także od jej wieku. Większą ilość glukozy niż galaktozy i arabinozy zawierają drewno drzew młodych, w miarę upływu czasu w tkankach pojawia się więcej ksylozy, jednocześnie powstają kompleksy węglowodanowo-ligninowe (Bujak i Targoński 1990). Rys. 5. Struktura ksylanu (Chavez i inni 2006). Obecność ksylanów jest istotna ze względu na kształtowanie się struktury całego kompleksu ligninocelulozy, ponieważ biorą one udział w wiązaniu ligniny poprzez tworzenie wiązań estrowych pomiędzy resztami kwasu 4-O-metyloglukuronowego a ligniną lub eterowych między cząsteczką ligniny a grupami arabinozowymi ksylanu (Tokarzewska- Zadora i inni 2005). Ponadto, dzięki rozgałęzionej budowie łańcuchów ksylanów, poszczególne frakcje łączą się poprzez wiązania wodorowe także z drugim składnikiem ściany komórkowej, jakim jest celuloza (Joseleau i inni 1992). 16

17 Przegląd literatury Lignina Lignina stanowi trzeci podstawowy składnik tkanek roślinnych, obok celulozy i hemiceluloz. Jest zewnętrzną frakcją całego kompleksu, nadającą mu sztywność i wysoką odporność na działanie czynników chemicznych, fizycznych i biologicznych (w tym enzymów hydrolitycznych) (Leonowicz i inni 1999). Jej struktura jest wysoce nieregularna, a z chemicznego punktu widzenia lignina jest heteropolimerem zbudowanym z pochodnych trzech alkoholi aromatycznych: alkoholu koniferylowego, alkoholu synapinowego i alkoholu kumarylowego (Youn i inni 1995). Poszczególne monomery budujące ligninę są umiejscowione w różnych partiach tkanki roślinnej, przykładowo alkohol kumarylowy znajduje się w blaszce środkowej, z kolei alkohol koniferylowy w ścianie wtórnej. Taki układ odgrywa fizjologicznie istotne znaczenie, ponieważ powoduje wzrost odporności rośliny dzięki tworzeniu kompleksu lignin w różnych miejscach rośliny (Davin i Lewis 2005). Synteza ligniny odbywa się poprzez tworzenie wolnych rodników uwalnianych w procesie odwodorowania trzech fenylopropanowych alkoholi, a jej struktura jest stabilizowana poprzez wiązania węgiel-węgiel i wiązania fenolowo-eterowe (Sanchez 2009, Perez i inni 2002). Poszczególne prekursory ligniny występują w innych proporcjach w różnych typach drewna w drewnie miękkim przeważa alkohol koniferylowy, natomiast w ligninie drewna twardego obserwuje się wyższą zawartość alkoholu synapinowego. Na Rysunku 6 przedstawiono strukturę ligniny roślin nagonasiennych. Rys. 6. Struktura ligniny roślin nagonasiennych (Perez i inni 2002). 17

18 Przegląd literatury 2.3. Enzymy biorące udział w degradacji ligninocelulozy W związku z wzrastającym wykorzystaniem enzymów degradujących kompleks ligninocelulozy w ciągu ostatnich kilkunastu lat bardzo prężnie rozwinął się sektor biotechnologii związany z ich biosyntezą zapoczątkowany w latach osiemdziesiątych ubiegłego wieku. W wielu ośrodkach badawczych prowadzone są badania mające na celu produkcję wysoce efektywnych enzymów ligninolitycznych oraz hemicelulolitycznych, a istotnym aspektem całej produkcji jest przede wszystkim jej ekonomiczność. Coraz szersze zastosowanie znajduje produkcja enzymów metodą w podłożu stałym (SSF - solid state fermentation) ze względu na mały wkład energii, co skutkuje niskim kosztem produktu końcowego. Obserwuje się również rosnącą tendencję w wykorzystywaniu odpadowych materiałów ligninocelulozowych jako induktorów w biosyntezie pożądanych enzymów Celulazy Hydroliza celulozy wymaga synergistycznego działania kilku enzymów, które prowadzą do jej całkowitego scukrzenia dzięki rozkładowi wiązań β-1,4-glikozydowych (Rys. 7). Dotychczas zbadano wiele grup mikroorganizmów pod kątem zdolności do biosyntezy celulaz i udowodniono, że najefektywniej grupę tych enzymów produkują grzyby strzępkowe (Mathew i inni 2008). W skład kompleksu celulaz grzybowych wchodzą: endoglukanazy (EC , endo-1-4-β-glukanazy) egzoglukanazy (EC , celobiohydrolazy) β-glukozydazy (EC ) egzo-β-glukozydazy (EC ). Engoglukanazy (nazywane także karboksymetylocelulazami) katalizują hydrolizę wiązań β-1,4-glikozydowych w amorficznych obszarach celulozy, produktem ich działania są celodekstryny; powstaje duża ilość redukujących oraz nieredukujących końców, co stwarza warunki dla działania egzoglukanaz. 18

19 Przegląd literatury Egzoglukanazy stanowią główny komponent całego kompleksu celulaz (40-70%) i są zdolne do hydrolizy krystalicznej i amorficznej celulozy, celodekstryn i celotetrozy, a produktem ich działania jest głównie celobioza; wyróżnia się dwa rodzaje celobiohydrolaz: celobiohydrolaza I działa na nieredukujący koniec, natomiast celobiohydrolaza II na redukujący koniec łańcucha. β-glukozydazy biorą udział w hydrolizie celobiozy oraz oligocelodekstryn do glukozy (Sanchez 2009, Mathew i inni 2008). Egzo-β-glukozydazy katalizują reakcję oderwania glukozy od niealdehydowego końca celulozy; enzymy te nie zawsze są obecne w kompleksie celulolitycznym i odgrywają nieznaczną rolę w całym procesie hydrolizy. Rys. 7. Rozkład łańcucha celulozy z udziałem enzymów (Mussatto i Teixeira 2010). Celulazy grzybowe syntetyzowane są pozakomórkowo, a ich kompleks zawiera wszystkie grupy pożądanych enzymów, przykładem mogą być najefektywniejsze celulolitycznie grzyby strzępkowe Trichoderma reesei syntetyzujące dwie celobiohydrolazy, osiem endoglukanaz 19

20 Przegląd literatury i siedem β-glukozydaz (Mathew i inni 2008). Warto podkreślić również fakt, iż grzyby strzępkowe Aspergillus niger nabierają coraz większego znaczenia w wydajnej biosyntezie celulaz. W Tabeli 1 wymieniono gatunki grzybów strzępkowych, które są efektywnymi producentami celulaz. Tabela 1. Zestawienie różnych gatunków grzybów strzępkowych syntetyzujących celulazy (Sukumaran i inni 2005). Aspergillus Fusarium Humicola Melanocarpus Penicillium Trichoderma A. niger A. nidulans A. oryzae F. solani F. oxysporum H. insolens H. grisea M. albomyces P. brasilianum P. occitanis P. decumbans T. reesei T. longibrachiatum T. harzianum Ksylanazy Degradacja heteropolimeru, jakim jest ksylan wymaga synergistycznego działania kompleksu kilku enzymów. Wyróżnia się dwie ważne grupy enzymów hydrolizujących wiązania w ksylanie, te które działają na główny łańcuch endo-ß-1,4-ksylanaza (ksylanohydrolaza 1,4-ß-D-ksylanu, EC ), egzo-ß-1,4-ksylozydaza (ksylohydrolaza 1,4-ß-D-ksylanu, EC ), 20

21 Przegląd literatury oraz na jego grupy boczne α-l-arabinofuranozydaza (arabinofuranohydrolaza α-l-arabinofuranozydów, EC ), α-d-glukuronidaza (glukuronohydrolaza α-d-glukuronozydów, EC ), esteraza octanowa (acetyloesteraza estrów octowych, EC ), acetyloksylanoesteraza (EC ), esteraza ferulanowa i esteraza p-kumarylowa (EC ) (de Oliviera da Silva i Carmona 2008, Tokarzewska-Zadora i inni 2005, Janas i inni 2002, Haltrich i inni 1996). Efektem działania endo-ß-1,4-ksylanaz są oligomery, ksylobioza lub ksyloza, które powstają w wyniku przypadkowego działania tego enzymu na łańcuch ksylanu rozszczepieniu ulegają liniowe wiązania glikozydowe typu ß-1,4. Podobny do endoksylanaz mechanizm działania wykazują egzoksylozydazy, z tą jednak różnicą, że hydrolizują one liniowe wiązania krótkich ksylooligosacharydów oraz ksylobiozę do ksylozy rozpoczynając od nieredukującego końca. Egzo-ß-1,4-ksylozydaza jest zwykle wytwarzana równocześnie z endoksylanazą, a jej działanie jest aktywne do momentu zablokowania enzymu przez podstawniki arabinofuranozydowe i 4-O-metyloglukuronowe (Tokarzewska-Zadora i inni 2005, Polizeli i inni 2005). Miejsca działania innych enzymów ksylanolitycznych biorących udział w hydrolizie łańcuchów bocznych przedstawiono na Rysunku 8. Rys. 8. Fragment struktury ksylanu z zaznaczonymi miejscami działania poszczególnych hemicelulaz (Shallom i Shoham 2003). 21

22 Przegląd literatury Hemicelulazy pochodzenia mikrobiologicznego są wykorzystywane głównie w trzech gałęziach przemysłu papierniczym (wybielanie pulpy drzewnej), spożywczym (produkcja bioetanolu, ksylitolu, klarowanie soków, moszczy oraz win, wyrób pieczywa) oraz tekstylnym. Wśród wiodących producentów hemicelulaz są grzyby z rodzaju Trichoderma, Aspergillus, Penicillium oraz bakterie Bacillus sp. i Cryptococcus sp. (Fazary i Ju 2008, Collins i inni 2005, Romanowska i inni 2004, Subramaniyan i Prema 2002) Klasyfikacja enzymów biorących udział w rozkładzie polisacharydów Hydrolazy glikozydowe (EC x, ang. glycoside hydrolase) są enzymami odgrywającymi kluczową rolę w metabolizmie węglowodanów i stanowią obszerną grupę aktywnych białek sklasyfikowanych między innymi w bazie funkcjonującej pod nazwą Carbohydrate-Active EnZYmes database (CAZy, Podstawowym kryterium bazy jest grupowanie enzymów w ściśle określone rodziny, ze względu na ich podobieństwa w sekwencji aminokwasów. Według pierwotnego założenia, około 20 lat temu, w bazie znajdowały się jedynie celulazy, jednak niebawem została ona poszerzona do wszystkich znanych hydrolaz glikozydowych. Baza dostępna jest on-line od 1998 roku, a wraz z postępem w określaniu struktury pierwotnej poszczególnych enzymów liczba rodzin ciągle rośnie, w roku 2005 baza CAZy liczyła 96 rodzin hydrolaz glikozydowych, natomiast w dniu dzisiejszym jest już ich 130 (Cantarel i inni 2008, Henrissat 1991). W bazie znajdują się także sklasyfikowane esterazy węglowodanowe, liczba ich rodzin w porównaniu do hydrolaz glikozydowych jest zdecydowanie mniejsza i wynosi zaledwie 16. Rodziny charakteryzujące się podobną strukturą trzeciorzędową i mechanizmem katalizy zgrupowane są w poszczególne klany oznaczone skrótem GH-litera, przy czym ten wyższy stopień klasyfikacji jest sporządzony jedynie dla hydrolaz glikozydowych. Tabeli 2 przedstawiono klasyfikację do poszczególnych rodzin wybranych enzymów w oparciu o ich numerację EC. 22

23 Przegląd literatury Tabela 2. Klasyfikacja wybranych enzymów wg Carbohydrate-Active EnZYmes database ( (GH glycoside hydrolase, CE - carbohydrate esterases). Enzym EC EC EC EC EC EC EC EC Rodzina GH5, GH6, GH7, GH8, GH9, GH12, GH44, GH45, GH48, GH51, GH74, GH124 GH5, GH6, GH9, GH1, GH3, GH9, GH30, GH116 GH1, GH3 GH5, GH8, GH10, GH11, GH43 GH3, GH30, GH39, GH43, GH52, GH54, GH116, GH120 CE4, CE16 CE1 Na Rysunku 9 przedstawiono przykładowe struktury wybranych enzymów: endoglukanazy I (rodzina 7, klan GH-B) oraz ksylanazy (rodzina 11, klan GH-C) grzybów strzępkowych T. reesei. Enzymy należące do rodziny 11 (klanu GH-C) charakteryzują się III-rzędową strukturą typu β-jelly roll, wysokim punktem izoelektrycznym, niską masą cząsteczkowa, ponadto zawierają dwie reszty glutaminianowe w centrum aktywnym. Struktury β uformowane dwuwarstwowo otaczają centrum aktywne białka. W strukturze enzymu występuje jeden α-heliks uformowany naprzeciwko hydrofobowej powierzchni drugiej β-kartki. Podobnie jak ksylanazy z rodziny 11, także endoglukanaza I (rodzina 7, klan GH-B) wykazuje III-rzędowa strukturę typu β-jerry roll. Oba enzymy wykazują podobieństwo w strukturze ich rdzenia, natomiast główne różnice w budowie enzymów obu klanów wynikają ze zróżnicowania w lokalizacji, długości i orientacji elementów struktury występujących na zewnątrz rdzenia enzymu oraz w rodzaju i konformacji reszt aminokwasowych otaczających centrum aktywne. Ponadto w strukturze celulazy należącej do rodziny 7 obecne są cztery krótkie fragmenty α-helikalne w porównaniu do jednej struktury α obecnej w budowie ksylanazy T. ressei (Collins i inni 2005). 23

24 Przegląd literatury Rys. 9. Reprezentatywne struktury enzymów należących do rodziny 7 i rodziny 11 (Collins i inni 2005) (kolor czerwony struktura α-heliks, kolor niebieski fragmenty struktury ß) Enzymy degradujące ligniny Ze względu na wysoce specyficzną budowę lignin ich biodegradacja jest procesem bardziej złożonym w porównaniu do hydrolizy celulozy oraz hemiceluloz i wymaga synergistycznego działania kilku enzymów ligninolitycznych. Enzymy degradujące ligniny syntetyzowane są zewnątrzkomórkowo przez szereg mikroorganizmów, głównie jednak przez grzyby tzw. białej zgnilizny. Enzymy te działają niespecyficznie i biorą udział w różnych reakcjach utleniania w trakcie rozkładu aromatycznej struktury lignin i rozrywania wiązań pomiędzy jej podstawowymi jednostkami. Główne enzymy biorące udział w tym procesie należą do grupy peroksydaz i oksydaz fenolowych i są to: peroksydaza ligninowa (LiP, EC ) peroksydaza manganowa (MnP, EC ) lakaza (EC ). Lakazy katalizują reakcje utleniania wielu związków organicznych i nieorganicznych, a w wyniku ich działania następuje redukcja tlenu cząsteczkowego do wody. Reakcje te możemy podzielić na trzy grupy: utlenianie prostych pochodnych fenolowych bez udziału mediatora, utlenianie z udziałem mediatora oraz reakcje sprzęgania. W obecności mediatora (np. ABTS lub hydroksybenzotriazol) możliwe jest utlenianie związków niefenolowych. 24

25 Przegląd literatury Lakazy zawierają w centrum aktywnym cztery atomy miedzi, wśród których wyróżniamy trzy typy. Typ I miedzi w formie utlenionej nadaje cząsteczce niebieską barwę i jest miejscem utleniania substratu. Typ II miedzi oraz dwa atomy miedzi typu III tworzą kompleks, w którym zachodzi wiązanie i redukcja tlenu do wody (Polak i Jarosz-Wilkołazka 2007) Intensyfikacja procesów biodegradacji odpadowych materiałów ligninocelulozowych Wzrastający rozwój rolnictwa oraz przemysłu spożywczego niesie za sobą wzrost ilości generowanych w trakcie różnych procesów produktów ubocznych, w tym głównie odpadów ligninocelulozowych, a niezagospodarowana biomasa roślinna stanowi doskonałe źródło wielu pożądanych produktów, które otrzymywane są na drodze enzymatycznej hydrolizy i mogą być wykorzystane np. do produkcji bioetanolu. Wysoka efektywność intensyfikacji warunków rozkładu odpadowej ligninocelulozy jest uwarunkowana kilkoma czynnikami, które można podzielić na dwie grupy związane z substratem poddawanym biodegradacji oraz te powiązane z enzymami biorącymi udział w procesie. Do podstawowych czynników zaklasyfikowanych w pierwszej grupie zalicza się (Alvira i inni 2010): stopień polimeryzacji i krystaliczności celulozy dostępność substratu dla działania enzymów zawartość i rozmieszczenie ligniny zawartość hemiceluloz porowatość substratu. Wpływ stopnia polimeryzacji celulozy, czyli długości jej łańcucha, na skuteczność hydrolizy nie jest do końca zdefiniowana, ale czynnik ten w powiązaniu ze stopniem krystaliczności zdecydowanie odgrywa istotną rolę w degradacji tego polimeru. Obie wymienione cechy zależą od pochodzenia celulozy i źródła jej pozyskiwania. Wysoka podatność substratu na działanie enzymów jest możliwa gdy jego powierzchnia jest dostępna 25

26 Przegląd literatury dla ich działania. Podczas procesu hydrolizy, zwłaszcza w pierwszym etapie kiedy jej tempo jest wysokie, może dochodzić do zwiększania stopnia dostępności tej specyficznej powierzchni na skutek obecności substratu w środowisku wodnym. Inną barierą ograniczającą działanie hydrolaz jest lignina, która stanowi fizyczną barierę hamującą dostęp do tych części ligninocelulozy, które mają zostać poddane ich działaniu. Ponadto, na powierzchni ligniny może dochodzić do nieproduktywnego wiązania enzymów. Duża zawartość hemiceluloz może także stanowić przeszkodę, głównie jeżeli spodziewamy się wysokiej wydajności glukozy z celulozy. Stopień acetylacji hemicelulozy odgrywa istotną rolę ponieważ lignina i grupy acetylowe związane z hemicelulozą utrudniają rozkład polisacharydów. Wpływ porowatości substratu, a dokładniej rozmiar porów, na wysoki stopień scukrzania jest z kolei bezpośrednio związany z wielkością działających na substrat enzymów (Alvira i inni 2010, Taherzadeh i Karimi 2008, Mansfield i inni 1999) Czynniki wpływające na zwiększenie wydajności biosyntezy enzymów degradujących celulozę i hemicelulozę Do przeprowadzenia procesu hydrolizy odpadowej biomasy ligninocelulozowej niezbędny jest kompleks wydajnych enzymów wykazujących aktywność celulolityczną i hemicelulolityczną. Na rynku powszechnie dostępne są komercyjne preparaty enzymatyczne, które mogą być wykorzystywane w tym procesie, np. Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921, endo-1,4-β-xylanase from Trichoderma longibrachiatum, Xylanase from Trichoderma viride, Cellulase from Aspergillus niger, Cellobiase from Aspergillus niger wszystkie wymienione wiodącej firmy Sigma-Aldrich. Jednakże koszt procesu z ich zastosowaniem jest wysoki, dlatego należy poszukiwać innych, tańszych metod pozyskiwania enzymów, które doprowadzą do efektywnego rozkładu celulozy i hemiceluloz w kierunku, między innymi, cukrów prostych. Istotnym czynnikiem wpływającym na intensyfikację procesu jest system prowadzenia hodowli mikroorganizmów. Hodowle wgłębne charakteryzują się jednorodnymi warunkami dla rozwoju drobnoustrojów, prostotą w modyfikacji ich warunków (ph, temperatura, prędkość wstrząsania, stężenie składników pokarmowych) oraz wysokim stopniem automatyzacji w nowych technologiach (Mussatto i Teixeira 2010), co zdecydowanie 26

27 Przegląd literatury przemawia za stosowaniem tej metody. W ostatnich latach coraz większe zainteresowanie wzbudza metoda hodowli w podłożu stałym (SSF solid state fermentation), która jest przede wszystkim bardziej ekonomiczna w porównaniu do metod hodowli wgłębnych. Sposób hodowli SSF wykorzystywany przede wszystkim w produkcji enzymów, pasz, antybiotyków, kwasów organicznych, biopescytydów, związków aromatycznych. Ponadto podczas SSF dochodzi do biokonwersji ligninocelulozy przy udziale mikroorganizmów, a hodowla może być prowadzona z wykorzystaniem różnych odpadów rolno-spożywczych, takich jak kaczany kukurydziane, słoma pszenna czy łuski ryżowe (Sukumaran i inni 2005, Tengerdy i Szakacs 2003, Robinson i inni 2001, Pandey i inni 2000). Jednym z kryteriów decydującym o wyborze sposobu hodowli SSF jest przede wszystkim struktura substratu. Podczas hodowli w podłożu stałym wzrost mikroorganizmów obserwowany jest na powierzchni, wewnątrz oraz pomiędzy cząstkami substratu. Przydatność materiału, zwłaszcza w przypadku biomasy ligninocelulozowej, determinowana jest jej fizykochemicznymi właściwościami (Brijwani i Vadlani 2011). Produkcja enzymów jest uwarunkowana przez wiele czynników, jako główne można wymienić ph podłoża, temperaturę procesu, natlenienie oraz rodzaj i stężenie substratu zastosowanego jako induktor, które pojedynczo lub we wzajemnym oddziaływaniu mogą wpływać na biosyntezę (Tholudur i inni 1999). Ze względu na niski koszt i dostępność najczęściej jako źródło węgla i induktor wykorzystuje się laktozę, jednak do produkcji celulaz wykorzystuje się także wiele innych substratów, od czystej celulozy począwszy, na odpadach rolno-spożywczych skończywszy. Wykorzystywana w tym celu, w ostatnim czasie coraz częściej, odpadowa biomasa ligninocelulozowa wywołuje indukcję biosyntezy enzymów na poziomie równorzędnym z powszechnie stosowanymi induktorami, a w niektórych przypadkach nawet na wyższym. Należy zwrócić uwagę na fakt, że stosowanie rozpuszczalnych źródeł węgla może zahamować syntezę celulaz w wyniku nagromadzenia się produktów rozkładu wywołujących represję kataboliczną (Mathew i inni 2008). Warunki hodowli sprzyjające produkcji celulaz głównie przez grzyby Trichoderma to kwaśne ph podłoża oraz temperatura w zakresie C. Efektywną metodą wywołującą nadprodukcję enzymów hydrolitycznych, głównie celulolitycznych, jest mutagenizacja. W latach sześćdziesiątych ubiegłego wieku Mandels i Weber przetestowali około 100 szczepów grzybów z rodzaju Trichoderma w celu wyselekcjonowania najbardziej wydajnego w biosyntezie celulaz. Najefektywniejszy szczep 27

28 Przegląd literatury T. reesei QM6a został następnie poddany procesowi mutagenizacji z udziałem wielu czynników, między innymi promieniowania UV. Otrzymany mutant QM 9414 charakteryzował się wyższą aktywnością FPaz w stosunku do szczepu rodzicielskiego (Dashtban i inni 2009). Od tego czasu proces mutagenizacji był niejednokrotnie stosowany w celu zwiększenia wydajności w produkcji enzymów, a jako czynniki mutagenne najczęściej wykorzystuje się promieniowanie UV, bromek etydyny, N-metylo-N'-nitro-Nnitrozoguanidynę (NTG), promieniowanie γ i mikrofale, które działają pojedynczo lub w kombinacjach (Li i inni 2010, Vu i inni 2009, Chand i inni 2005, Witkowska i Bien 1991, Witkowska i inni 1989) Metody wstępnej obróbki odpadowej biomasy ligninocelulozowej Procesy, których celem jest enzymatyczna depolimeryzacja materiałów ligninocelulozowych powinny być poprzedzone wstępnym ich przygotowaniem (Pielecki i Targoński 2001). Zmian w strukturze ligninocelulozy, a co za tym idzie modyfikacji wyżej wymienionych czynników decydujących o wydajności procesu hydrolizy, dokonuje się za pomocą metod obróbki wstępnej substratu - najpopularniejsze z nich przedstawiono w Tabeli 3. Proces obróbki wstępnej ligninocelulozy mający na celu zwiększenie tempa oraz wzrost wydajności procesu hydrolizy celulozy oraz hemicelulozy powinien charakteryzować się wysoką skutecznością w usunięciu frakcji lignin oraz zmniejszeniu procentowej zawartości celulozy krystalicznej. Ponadto pożądanym efektem jest także częściowa depolimeryzacja hemiceluloz, zwiększenie powierzchni dostępnej dla działania enzymów oraz wywołanie zmian w strukturze polimeru poprzez zwiększenie porowatości modyfikowanego materiału. Istotnymi kryteriami decydującymi o wyborze odpowiedniej metody są przede wszystkim ich ekonomiczność, brak powstawania produktów ubocznych zagrażających środowisku naturalnemu oraz też takich, które mogłyby wpływać na zahamowanie właściwego procesu hydrolizy enzymatycznej (Saratale i Oh 2012, Sanchez i Cardona 2008, Olofsson i inni 2008, Taherzadeh i Karimi 2007, Galbe i Zacchi 2002). Dotychczas przeanalizowano wiele metod wstępnej modyfikacji ligninocelulozy, jednak nie można dokładnie określić, która z nich jest najbardziej efektywna pod kątem zalet oraz wad 28

29 Przegląd literatury jakimi się charakteryzują (Zheng i inni 2009). Ze względu na sposób traktowania ligninocelulozy oraz czynniki wykorzystywane do jej modyfikacji, metody obróbki wstępnej ligninocelulozy podzielić można na cztery główne grupy: fizyczne, chemiczne, fizykochemiczne oraz biologiczne (Alvira i inni 2008, Taherzadeh i Karimi 2008, Sun i Cheng 2002). Wykorzystywane są również metody kombinowane, które łączą dwie lub więcej metod z tej samej lub z różnych grup, ale nie są one osobno sklasyfikowane. W dostępnej literaturze występują ponadto różnice w klasyfikacji poszczególnych metod, szczególnie w obrębie modyfikacji fizycznych i fizykochemicznych. Tabela 3. Zestawienie wybranych metod obróbki wstępnej biomasy ligninocelulozowej ze względu na ich wady i ograniczenia w stosowaniu. Metoda obróbki wstępnej Wady i ograniczenia Rozdrabnianie mechaniczne Steam explosion AFEX (metoda steam explosion z włączeniem amoniaku) Kwaśna hydroliza Zasadowa hydroliza Biologiczne Zużycie mocy zazwyczaj wyższe niż swoista energia biomasy Zniszczenie części frakcji ksylanu, niekompletna degradacja ligniny, powstawanie związków hamujących wzrost mikroorganizmów Niska efektywność dla biomasy z wysoką zawartością ligniny Wysoki koszt, korozja aparatury, powstawanie toksycznych substancji Długi czas ekspozycji, powstawanie soli połączonych z biomasą Bardzo wolne tempo hydrolizy Spośród metod obróbki wstępnej zaliczanych do pierwszej grupy w literaturze najczęściej opisywane są: autohydroliza (uncatalyzed steam-explosion), hydrotermoliza (liquid hot water - LHW), rozdrobnienie mechaniczne, ekstruzja oraz modyfikacja materiału z wykorzystaniem promieniowania, przy czym dwie pierwsze metody wykorzystywane są 29

30 Przegląd literatury najczęściej (Zheng i inni 2009). Rozdrobnienie mechaniczne często stosowane jest jako pierwszy etap, a wybór jego sposobu zależy przede wszystkim od rodzaju odpadowej biomasy oraz preferowanej wielkości cząstek. Mielenie prowadzi do zwiększenia stopnia dostępności substratu dla enzymów, głównie dzięki obniżeniu stopnia krystaliczności celulozy, a surowiec po tym procesie ma najczęściej wielkość mm (Brodeur i inni 2011, Cadoche i Lopez 1989). Metoda bezkatalitycznej hydrolizy oparta jest na działaniu pary wodnej pod wysokim ciśnieniem, a następnie szybkim jego obniżeniu. Wysoka temperatura rzędu 160 C-260 C i odpowiadające temu ciśnienie od 0,69 do 4,83 MPa działające na substrat od kilku sekund do kilku minut powodują degradację hemicelulozy i częściowe usunięcie lignin, przy czym zastosowanie niższych temperatur i dłuższego czasu jest bardziej preferowane. Wadą tej metody jest powstawanie w jej wyniku naturalnych inhibitorów enzymów, co wymaga wielokrotnego przemycia zmodyfikowanego substratu w celu ich wyeliminowania. Pomimo to, jest to jedna z niewielu metod, które są wykorzystywane są w skali pilotażowej i została ona skomercjalizowana (Zheng i inni 2009, Mtui 2009, Taherzadeh i Karimi 2008). Metoda hydrotermolizy (inaczej nazywana solwolizą) polega na użyciu wody pod ciśnieniem w wysokiej temperaturze. Działanie sprężonej płynnej wody o temp. 200 C-230 C przez 15 minut może powodować 40-60% rozkład biomasy, w tym degradacji ulega 4-22% celulozy, 35-60% ligniny oraz usunięciu ulega prawie cała frakcja hemiceluloz (Mosier i inni 2005). Inne badania potwierdzają, że w wyniku zastosowania metody hydrotermicznej wzrasta dostępność celulozy poprzez zmiany w strukturze ligniny i częściową degradację hemiceluloz (Kristensen i inni 2008). Odmianą tej metody może być stosowanie wody o kontrolowanym odczynie w zakresie ph 4-7 w temperaturze 160 C-190 C. W otrzymanej cieczy po modyfikacji znajdują się głównie oligosacharydy, ilość monocukrów jest minimalna (Kim i inni 2009). W wyniku działania na substrat różnych typów promieniowania dochodzi do zmniejszenia stopnia krystaliczności i polimeryzacji celulozy, częściowej hydrolizy hemicelulozy oraz depolimeryzacji ligniny. Najczęściej w tym celu wykorzystuje się promieniowanie ultradźwiękowe, promieniowanie γ i UV oraz mikrofale. Jednak ze względu na wysoką specyficzność wobec substratu, wysoki koszt i duże zużycie energii metody te są stosowane bardzo rzadko (Zheng i inni 2009, Ramoz 2003). Stosunkowo nową, obiecującą fizyczną metodą modyfikacji biomasy ligninocelulozowej jest ekstruzja. W trakcie obróbki surowiec jest poddany działaniu 30

31 Przegląd literatury temperatury i ciśnienia, co skutkuje fizycznymi i chemicznymi zmianami w strukturze obrabianej biomasy (Alvira i inni 2010). Metoda ta posiada wiele zalet, m.in. stosowanie umiarkowanych temperatur, brak strat surowca, brak konieczności dodawania lub usuwania składników podczas ciągłego procesu ekstruzji, szybkie przenikanie wysokiej temperatury oraz, co jest najważniejsze, brak powstawania produktów hamujących proces hydrolizy (Karunanithy i Muthukumarappan 2011). Wśród chemicznych metod obróbki wstępnej ligninocelulozy najczęściej stosuje się kwasową lub zasadową hydrolizę. W wyniku działania kwasami dochodzi do zwiększenia rozpuszczalności hemiceluloz co prowadzi do wzrostu dostępności celulozy dla działania enzymów. Metoda ta może być prowadzona z udziałem stężonych kwasów, głównie kwasu siarkowego, solnego i azotowego, oraz ich wodnych roztworów (Carvalheiro i inni 2008). W związku z duża toksycznością stężonych kwasów, koniecznością stosowania aparatury ze stali nierdzewnej, uwaga bardziej skierowana jest na stosowanie rozcieńczonych kwasów (0,5% - 1,5%). Proces obróbki może być prowadzony w wyższej temperaturze (około 180 C) przez krótszy czas lub w temperaturze niższej (120 C) przez minut (dla stężonych kwasów można zastosować jeszcze niższą temperaturę rzędu 40 C). Wadą kwasowej hydrolizy ligninocelulozy jest powstawanie furfuralu, HMF i innych aromatycznych składników ligniny, które wpływają w dalszych etapach na metabolizm drobnoustrojów (Alvira i inni 2010). Stosowanie kwasów organicznych, takich jak kwas maleinowy, może ograniczyć syntezę szkodliwych produktów ubocznych (Kootstra i inni 2009). W zasadowej hydrolizie ligninocelulozy wykorzystuje się najczęściej NaOH, Ca(OH) 2 i amoniak. W efekcie zastosowania tych związków dochodzi do zwiększenia dostępności substratu dla kompleksu enzymów. Wodorotlenek sodu powoduje rozpulchnienie substratu, zwiększenie wewnętrznej powierzchni celulozy oraz zmniejszenie stopnia polimeryzacji i krystaliczności celulozy, a także rozerwanie struktury ligniny. Zastosowanie NaOH może prowadzić do spadku procentowego udziału ligniny z 24-55% do 20% w kompleksie ligninocelulozy drzew twardych. Modyfikacja odpadowej ligninocelulozy może zachodzić w temperaturze pokojowej i może trwać od kilku sekund do nawet kilku dni. W porównaniu do kwasowej hydrolizy zastosowanie zasad powodują mniejszą degradację cukrów, ponadto metoda ta jest bardziej efektywna dla rolniczej biomasy odpadowej niż innych materiałów, np. ligninocelulozy drzew (Kumar i Wyman 2009, Taherzadeh i Karimi 2008). 31

32 Przegląd literatury Metoda steam explosion z włączeniem amoniaku (AFEX) jest jedną z najpopularniejszych fizyko-chemicznych metod obróbki wstępnej odpadowej ligninocelulozy. W tym procesie biomasa jest zanurzona w ciekłym amoniaku w wysokiej temperaturze i pod wysokim ciśnieniem, które jest nagle redukowane (Kumar i inni 2009). W przeciwieństwie do metody klasycznej AFEX charakteryzuje się łagodniejszymi warunkami reakcji (umiarkowana temperatura) oraz wyklucza konieczność przemywania zmodyfikowanego produktu, co skutkuje powstawaniem jedynie stałej frakcji po zakończeniu modyfikacji. Po procesie dochodzi głównie do zmniejszenia krystaliczności celulozy oraz zerwania wiązań między ligniną a cukrami, a teoretyczna wydajność glukozy z modyfikowanej słomy kukurydzianej może wynosić nawet 98% (Balan i inni 2009). Metody biologicznej obróbki materiału używane były przede wszystkim w celu zwiększenia strawności substratów ligninocelulozowych stanowiących pasze dla zwierząt. Ze względu na niezagrażający środowiskowi naturalnemu sposób modyfikacji, coraz częściej wykorzystuje się je jako poprzedzające proces enzymatycznej hydrolizy opadowej biomasy. W tym celu wykorzystuje się głównie grzyby białej i brunatnej zgnilizny (Phanerochaete chrysosporium, Ceriporia lacerata, Cyathus stercolerus, Pleurotus ostreaus), a w efekcie ich działania dochodzi głównie do degradacji lignin i hemicelulozy oraz małych strat w ilości celulozy. Zaletami tej metody są przede wszystkim jej nietoksyczność, niski nakład energii, niski koszt i łagodne warunki procesu, jednak podstawową wadą jest długi czas i niska efektywność. W celu zwiększenia wydajności biologicznych metod obróbki wstępnej stosuje się metody kombinowane, w połączeniu np. z H 2 O 2 lub ultradźwiękami (Huang i inni 2011, Alvira i inni 2010) Czynniki wpływające na efektywność procesu enzymatycznej hydrolizy odpadowej biomasy ligninocelulozowej Proces hydrolizy celulozy i hemiceluloz może być prowadzony na drodze chemicznej z udziałem rozcieńczonych kwasów oraz metodą enzymatyczną z wykorzystaniem kompleksu enzymów. Oba typy hydrolizy charakteryzują się pewnymi korzyściami i wadami, które przedstawiono w Tabeli 4. 32

33 Przegląd literatury Podstawowymi czynnikami przemawiającym za stosowaniem metody enzymatycznej jest jej wyższa wydajność, brak powstawania toksycznych inhibitorów oraz stosowanie związków nie zagrażających środowisku naturalnemu. Enzymatyczna hydroliza przebiega w łagodnych warunkach, najczęściej stosuje się temperaturę w zakresie C i ph 4,5 5,0. Wysoka wydajność procesu enzymatycznej hydrolizy jest jednak determinowana także innymi parametrami procesu, które powinny zostać zoptymalizowane. Stężenie substratu i jego jakość, zastosowana metoda obróbki wstępnej, poziom aktywności enzymów oraz warunki reakcji takie jak temperatura, ph i prędkość wstrząsania są głównymi czynnikami wpływającymi na wydajność hydrolizy materiałów ligninocelulozowych. Określenie optymalnej temperatury procesu oraz ph hydrolizy jest bezpośrednio związane z rodzajem odpadowego materiału, źródłem enzymów oraz czasem trwania procesu. Z kolei stężenie substratu w zawiesinie jest głównym czynnikiem wpływającym na wydajności i tempo rozkładu. Wysokie stężenie substratu może powodować efekt inhibujący, który istotnie wpływa na prędkość procesu. Ponadto, nagromadzenie dużej ilości produktów końcowych metabolizmu, takich jak glukoza czy celobioza może spowodować zahamowanie działania endoglukanaz, celobiohydrolaz i ß-glukozydaz. Zastosowanie odpowiedniej proporcji pomiędzy poziomem enzymów, a stężeniem substratu odgrywa także istotny wpływ na efektywność procesu. Zwiększenie dawki enzymów do pewnego poziomu wzmaga proces hydrolizy, jednak równocześnie zwiększa koszt całego procesu (Kristensen i inni 2009, Taherzadeh i Karimi 2007). Tabela 4. Porównanie czynników występujących podczas chemicznej i enzymatycznej hydrolizy celulozy i hemicelulozy (Taherzadeh i Karimi 2007). Hydroliza Hydroliza Porównywany czynnik chemiczna enzymatyczna Łagodne warunki procesu Nie Tak Wysoka wydajność procesu Nie Tak Inhibicja produktem podczas procesu Nie Tak Powstawanie inhibitorów w trakcie hydrolizy Tak Nie Niski koszt Tak Nie Krótki czas trwania procesu Tak Nie 33

34 Cel pracy 3. Cel pracy Celem pracy były próby intensyfikacji procesu biodegradacji trzech odpadowych materiałów ligninocelulozowych (odpadowych kaczanów kukurydzianych, poekstrakcyjnego odpadu kukurydzianego oraz odpadowego materiału pofiltracyjnego) prowadzonych z udziałem grzybów strzępkowych z rodzaju Trichoderma i Aspergillus. Realizacja celu pracy obejmowała następujące etapy: 1. Wytypowanie szczepów grzybów strzępkowych efektywnych w produkcji celulaz i ksylanaz podczas hodowli wgłębnych z odpadami ligninocelulozowymi jako głównym źródłem węgla i induktorem badanych enzymów oraz wzrastającym stężeniem glukozy jako dodatkowym źródłem węgla. 2. Określenie efektywnych warunków biosyntezy celulaz i ksylanaz podczas hodowli wgłębnych ze wzrastającą ilością głównego źródła węgla i energii (OKK, CGF, OMP). 3. Otrzymanie zagęszczonych preparatów enzymatycznych z wybranych płynów pohodowlanych o najwyższych aktywnościach enzymatycznych. 4. Próby praktycznego zastosowania otrzymanych preparatów w procesie enzymatycznej hydrolizy odpadowej biomasy ligninocelulozowej. 5. Określenie wpływu metod obróbki wstępnej badanych materiałów oraz dawki zagęszczonych preparatów na wydajność procesu enzymatycznej hydrolizy odpadowych substratów. 34

35 Materiały i metody 4. Materiały i metody 4.1. Materiały badawcze Drobnoustroje W niniejszej pracy wykorzystano trzy szczepy grzybów strzępkowych: Trichoderma hamatum C1, T. harzianum T33 oraz Aspergillus niger XP. Mikroorganizmy pochodziły z kolekcji własnej Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu i przechowywano je na podłożu PDA (Tab. 5) w temperaturze 4ºC. Ponadto włączono do badań także dwa szczepy grzybów białej zgnilizny Cerrena unicolor 139 (Zakład Biochemii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie) oraz Trametes versicolor 536 (Katedra Chemii, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu) w kierunku biosyntezy lakaz. Drobnoustroje te przetrzymywano na podłożu MEA (Tab. 5) w temperaturze 4ºC Otrzymanie nowych szczepów na drodze mutagenizacji promieniami UV grzybów strzępkowych T. hamatum C1 Zawiesinę zarodników (4 ml) o gęstości 12,5x10 5 jtk/ml otrzymaną w wyniku zmywu 0,1% roztworem Tween u 80 poddano procesowi mutagenizacji stosując następujące czasy naświetlania promieniami UV: 30 sekund, 1 minutę, 2 minuty, 5 minut, 10 minut, 20 minut. Proces prowadzono w odległości 20 cm od lampy emitującej promieniowanie UV. Po upływie zaplanowanego czasu naświetlania zawiesinę przetrzymywano przez 1 godzinę w zaciemnionym miejscu (fotoindukcja). W celu określenia stopnia przeżywalności mutantów sporządzono szereg rozcieńczeń i zawiesinę rozprowadzono powierzchniowo (0,1 ml) na płytki ze zmodyfikowanym podłożem Saundersa (ZSr) opisanym w Tabeli 5. Mutanty o przeżywalności 0,1% i poniżej tej wartości wykorzystano w dalszych badaniach. 35

36 Materiały i metody Następnie dokonano obserwacji makroskopowej wybranych mutantów na zmodyfikowanym podłożu Saundersa (ZS) (Tab. 5) stosując dwa różne źródła węgla (glukoza lub CMC) celem potwierdzenia zdolności mutantów do wzrostu na CMC jako głównym źródłe węgla znajdującym się w podłożu. Otrzymane nowe szczepy sprawdzono pod kątem zdolności do biosyntezy celulaz i ksylanaz w hodowlach wgłębnych Odpady ligninocelulozowe Odpadowe kaczany kukurydziane Odpadowe kaczany kukurydziane (OKK) pochodziły z dolnośląskiego zakładu przemysłu skrobiowego. Zakład produkcyjny dotychczas zagospodarowywał ten materiał m.in. w celach paszowych, jednak ze względu na wzrastającą produkcję zainteresował się innym sposobem utylizacji tego odpadu. Materiał do badań wykorzystano po uprzednim rozdrobnieniu za pomocą młynka laboratoryjnego do poziomu rozdrobnienia 1-5 mm. Skład poszczególnych frakcji OKK: celuloza 34,75 %, hemicelulozy 30,96 % oraz lignina 17,79 % Odpadowy materiał pofiltracyjny Materiał ligninocelulozowy wykorzystywany był jako medium w filtracji syropów glukozowych i fruktozowych w jednym z dolnośląskich zakładów produkcyjnych, a po zakończeniu procesu filtracji odpadowy materiał pofiltracyjny (OMP) stanowił produkt nie nadający się do ponownego użycia. Ze względu na brak innych metod jego efektywnego zagospodarowania zakład produkcyjny zainteresował się biodegradacją materiału z udziałem drobnoustrojów. Ponieważ materiał był w postaci proszku nie wymagał rozdrabniania niezbędnego do jego dalszego wykorzystania w degradacji enzymatycznej. Skład OMP: celuloza 47,64 %, hemicelulozy 12,36 %, lignina 28,26 % 1. 1 Oznaczenia składu odpadowych materiałów ligninocelulozowych wykonano w Instytucie Chemicznej Technologii Drewna Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu 36

37 Materiały i metody Poekstrakcyjny odpad kukurydziany Poekstrakcyjny odpad kukurydziany (corn gluten feed - CGF) jest produktem ubocznym w trakcie produkcji bioetanolu z kukurydzy. Wykorzystywany w niniejszej pracy CGF dostarczyło węgiersko-kanadyjskie przedsiębiorstwo biotechnologiczne Dr. Bata Ltd zainteresowane dalszym zagospodarowaniem tego materiału. Odpadową biomasę suszono przez 24 godziny w temperaturze 60ºC, a następnie rozdrabniano przy użyciu młynka laboratoryjnego do poziomu rozdrobnienia 1-5 mm. Skład poszczególnych frakcji CGF przedstawiał się następująco: celuloza 10,73 %, hemicelulozy 18,29 % oraz lignina 4,66 % Wysłodki buraczane W wybranych procesach, w celach porównawczych, zastosowano wysłodki buraczane pochodzące z dolnośląskich cukrowni. Materiał ten, łącznie z celulozą mikrokrystaliczną Avicel, wykorzystany był jako źródło węgla i induktor enzymów hydrolitycznych wytwarzanych w trakcie hodowli wstrząsanych grzybów strzępkowych Modyfikacja odpadowych materiałów ligninocelulozowych Modyfikacja odpadowego materiału pofiltracyjnego (OMP) Zastosowano dwie metody modyfikacji odpadowego materiału pofiltracyjnego: chemiczną oraz termiczną połączoną z szybką redukcją ciśnienia. Metoda chemiczna. Odpadowy materiał pofiltracyjny zawieszono w 2% roztworze NaOH i przetrzymywano w temperaturze 80ºC przez 1 godzinę. Następnie przesączono, osad przemywano wodą wodociągową aż do uzyskania neutralnego ph i wysuszono w temperaturze 50ºC. Metoda termiczna. Odpadowy materiał pofiltracyjny zawieszono w wodzie destylowanej (1:10) i przetrzymywano w autoklawie (121ºC, 1 atm) przez 1 godzinę. Po upływie podanego 37

38 Materiały i metody czasu gwałtownie zredukowano ciśnienie, mieszaninę ochłodzono, przefiltrowano i stałą frakcję wysuszono w temperaturze 50ºC Modyfikacja odpadowych kaczanów kukurydzianych (OKK) i poekstrakcyjnego odpadu kukurydzianego (CGF) Modyfikacja obu materiałów odpadowych przeprowadzona została przy użyciu metody ekstruzji. Przygotowanie materiałów odpadowych. Rozdrobnione OKK i CGF doprowadzono do wilgotności 20%, przetarto przez sito, a następnie przechowywano przez dobę w szczelnie zamkniętym worku nylonowym. Bezpośrednio przed procesem ekstruzji ponownie przetarto przez sito. Proces ekstruzji przeprowadzono wykorzystując jednoślimakowy ekstruder firmy Brabender typu Zastosowano jeden profil temperaturowy (130ºC, 150ºC i 180ºC), obroty ślimaka na poziomie 120 obr/min, dyszę o średnicy 4 mm i sprężenie ślimaka 2: Podłoża hodowlane W Tabeli 5 przedstawiono podłoża hodowlane wykorzystywane w niniejszej pracy, których skład był uzależniony od przeznaczenia i grupy badanych mikroorganizmów. Tabela 5. Wykaz wykorzystanych podłóż hodowlanych. L.p. Nazwa podłoża (skrót) Skład podłoża Przeznaczenie Źródło 1. Podłoże mineralne Mandels- Sternburg 2 (MS) Pepton (NH 4 ) 2 SO 4 KH 2 PO 4 Mocznik 1,00 g/l 1,40 g/l 2,00 g/l 0,30 g/l Biosynteza celulaz i ksylanaz przez grzyby strzępkowe z rodzajów Shah i Madamwar (2005) 2 W zależności od wariantu hodowli stosowano trzy ilości głównego źródła węgla (materiały odpadowe): 2%, 3%, 4% oraz cztery stężenia glukozy jako dodatkowego źródła węgla: 0%; 0,25%; 0,50%; 0,75%. 38

39 Materiały i metody CaCl 2 0,30 g/l Trichoderma MgSO 4 x7h 2 O 0,30 g/l i Aspergillus FeSO 4 x7h 2 O 5,00 mg/l (hodowle MnSO 4 xh 2 O 1,60 mg/l wstrząsane) ZnSO 4 xh 2 O 1,40 mg/l CoCl 2 2,00 mg/l Pepton 1 g/l Biosynteza celulaz (NH 4 ) 2 SO 4 1,40 g/l i ksylanaz przez Zmodyfikowane KH 2 PO 4 2,00 g/l grzyby strzępkowe 2. podłoże mineralne Mandels-Sternburg Mocznik CaCl 2 0, 30 g/l 0,30 g/l z rodzajów Trichoderma (ZMS) MgSO 4 x7h 2 O 0,30 g/l i Aspergillus Glukoza 2,50 g/l (hodowle w podłożu stałym - SSF) KH 2 PO 4 1,00 g/l Biosynteza lakaz Krastanov MgSO 4 x7h 2 O 0,50 g/l przez grzyby grzyby i inni (2007) CaCl 2 x2h 2 0 0,30 g/l strzępkowe z rodzaju FeSO 4 x7h 2 O 0,005 g/l Trichoderma 3. Podłoże mineralne (LT) (NH 4 ) 2 SO 4 ZnSO 4 xh 2 O 0,30 g/l 0,005 g/l (hodowle wstrząsane) KCl 0,50 g/l L-glutamina 0,50 g/l CuSO4 10,00 g/l Glukoza 20,00 g/l KH 2 PO 4 0,47 g/l Biosynteza lakaz Lindeberg MgSO 4 x7h 2 O 0,50 g/l przez grzyby białej i Holm 1952 Na 2 HPO 4 x12h 2 0 0,48 g/l zgnilizny Cerrena Ekstrakt drożdżowy 0,10 g/l unicolor 139 Podłoże mineralne L-asparagina 1,50 g/l i Trametes versicolor 4. Lindeberg Holm Mn(CH 3 COO) 2 x4h 2 O 12mg/l 536 (LH) Zn(NO 3 ) 2 x6h 2 O 3,14 mg/l (hodowle CuSO 4 x5h 2 O 3,19 mg/l wstrząsane) Ca(NO 3 )2x4H 2 O 50,00 mg/l FeCl 3 x6h 2 O 3,20 mg/l Tiamina 50,00 µg/l 39

40 Materiały i metody KH 2 PO 4 0,20 g/l Ocena stopnia K 2 HPO 4 0,15 g/l przeżywalności NaH 2 PO 4 xh 2 0 2,00 g/l mutantów Zmodyfikowane Na 2 HPO 4 1,50 g/l 5. podłoże Saundersa NaNO 3 3,80 g/l (ZSr) MgSO 4 x7h 2 O 0,30 g/l CMC 10,00 g/l Róż bengalski 33,00 mg/l Agar 20,00 g/l KH 2 PO 4 0,20 g/l Obserwacja K 2 HPO 4 0,15 g/l makroskopowa NaH 2 PO 4 xh 2 0 2,00 g/l mutantów 6. Zmodyfikowane podłoże Saundersa (ZS) Na 2 HPO 4 NaNO 3 MgSO 4 x7h 2 O Agar 1,50 g/l 3,80 g/l 0,30 g/l 20,00 g/l Pepton 5,00 g/l Glukoza lub CMC 10,00 g/l Agar 20,00 g/l 7. Potato Dextrose Agar (PDA) Potato Dextrose Broth (Difco) Agar 12,00 g/l 20,00 g/l Przechowywanie szczepów grzybów strzępkowych 8. Malt extract agar (MEA) Ekstrakt słodowy Pepton Agar 20,00 g/l 3,00 g/l 20,00 g/l Przechowywanie szczepów grzybów białej zgnilizny Hodowle drobnoustrojów Hodowle wstrząsane grzybów strzępkowych z rodzaju Trichoderma i Aspergillus w kierunku biosyntezy celulaz i ksylanaz Hodowle wstrząsane prowadzono w dwóch powtórzeniach w kolbach Erlenmayer a o poj. 500 ml w 100 ml podłoża Mandels-Sternburg (Shah i Madamwar 2005) (Tab. 5). Jako główne źródło węgla, a jednocześnie induktor badanych enzymów zastosowano odpadowe 40

41 Materiały i metody materiały ligninocelulozowe (odpadowy materiał pofiltracyjny, odpadowe kaczany kukurydziane, poekstrakcyjny odpad kukurydziany) w różnych ilościach (2%, 3%, 4%). Dodatkowe źródło węgla stanowiła glukoza (0%; 0,25%; 0,5%; 0,75%). Przygotowane podłoże (ph~5) sterylizowano (121ºC, 30 min) dwukrotnie w 24. godzinnych odstępach czasu, a następnie zaszczepiono zawiesiną zarodników (1ml) o gęstości ok. 6x10 7 jtk/ml otrzymaną w wyniku zmywu 0,1% roztworem Tween 80 z siedmiodobowego skosu. Hodowle prowadzono przez 14 dni w temperaturze 25-28ºC przy 170 obr/min. W celu oznaczenia aktywności enzymatycznych oraz poziomu białka w 3, 5, 7, 10, 12 i 14 dobie hodowli sterylnie pobierano płyn pohodowlany, zmierzono ph, a następnie odwirowano (5500 obr/min, 30 minut, 4ºC). W wybranych wariantach hodowli w trakcie ich trwania zastosowano korektę stężenia jonów wodorowych podłoża na poziomie ok. ph 5,0 przy użyciu roztworów 1M NaOH i 1M HCl. Porównawczo przeprowadzono analogiczną hodowlę szczepów C1 i XP z korektą ph podłoża, gdzie głównym źródłem węgla była celuloza mikrokrystaliczna Avicel (2%) i wysłodki buraczane (1%), ponadto podłoże uzupełniono glukozą (0,25%) w celu inicjacji wzrostu badanych szczepów Hodowle w podłożu stałym grzybów strzępkowych z rodzajów Trichoderma i Aspergillus w kierunku biosyntezy celulaz i ksylanaz Hodowle w podłożu stałym prowadzono w dwóch powtórzeniach w kolbach Erlenmayer a o pojemności 250 ml. W kolbach umieszczono 10 g odpadowych materiałów ligninocelulozowych (odpadowy materiał pofiltracyjny, odpadowe kaczany kukurydziane, poekstrakcyjny odpad kukurydziany) oraz 17,5 ml zmodyfikowanego podłoża Mandels- Sternburg o ph~5,0 (z dodatkiem 0,25% glukozy) (Tab. 5). Przygotowane podłoże sterylizowano (121ºC, 30 min) dwukrotnie w 24. godzinnych odstępach czasu, a następnie zaszczepiono zawiesiną zarodników (1 ml) o gęstości 6,0 x 10 7 jtk/ml otrzymaną w wyniku zmywu 0,1% roztworem Tween 80 z siedmiodobowego skosu. Hodowle prowadzono maksymalnie przez 14 dni w temperaturze 25-28ºC codziennie wstrząsając i utrzymując wilgotność na poziomie 60-65%. Po zakończeniu hodowli (po 3, 5, 7, 10, 12 i 14 dobie) pobierano próbę celem określenia poziomu aktywności wody oraz wilgotności, a następnie 41

42 Materiały i metody zawartość kolby ekstrahowano 0,05M buforem octanowym (50 ml) o ph 4,8 przez 60 minut przy 170 obr/min w temperaturze 25-28ºC. Otrzymany płyn odwirowano (5500 obr/min, 30 minut, 4ºC) i wykorzystano do oznaczeń enzymatycznych oraz w celu określenia poziomu związków redukujących ogółem, glukozy oraz pentoz Hodowle wstrząsane grzybów strzępkowych T. hamatum C1 i T. harzianum T33 w kierunku biosyntezy lakaz Hodowle wstrząsane prowadzono w kolbach Erlenmayer a o poj. 250 ml w 50 ml podłoża mineralnego LT (Tab. 5). Przygotowane podłoże (ph~6,0) sterylizowano (121ºC, 20 minut), a następnie po ostudzeniu zaszczepiono zawiesiną zarodników (0,5 ml) przygotowaną analogicznie jak w pkt Hodowle prowadzono przez 7 dni przy 200 obr/min w temperaturze 25-28ºC, w 4, 5, 6 i 7 dobie hodowli sterylnie pobierano płyn pohodowlany, który odwirowano (5500 obr/min, 20 minut, 4ºC) i przeznaczono do analiz Hodowle wstrząsane grzybów białej zgnilizny C. unicolor 136 i T. versicolor 536 w kierunku biosyntezy lakaz Przygotowanie inokulum. Hodowlę inokulacyjną prowadzono w podłożu mineralnym Lindeberg Holm (LH) (Tab. 5) przez 14 dni w temperaturze 25ºC przy 150 obr/min w kolbach Erlenmayer a o pojemności 250 ml. Do wysterylizowanego podłoża LH (50 ml) o ph=5,6 dodano sterylnie wyciętą kostkę (ok. 1 cm 3 ) z grzybnią badanych mikroorganizmów. Po zakończeniu hodowli inokulacyjnej zlano całą objętość do sterylnego woreczka i rozdrobniono za pomocą Stomachera (1 minuta, 140 cykli/min). Tak przygotowane inokulum wykorzystane zostało do zaszczepienia hodowli prowadzonych w kierunku biosyntezy lakaz. Hodowle produkcyjne. Hodowle wstrząsane prowadzono w dwóch powtórzeniach w kolbach Erlenmayer a o pojemności 250 ml w 50 ml podłoża LH (Tab. 5). Przygotowane podłoże o ph=5,6 42

43 Materiały i metody sterylizowano (121ºC, 20 minut), a po ostudzeniu zaszczepiono otrzymanym wcześniej inokulum (1,5 ml). Hodowle prowadzono przez 19 dni w temperaturze 25ºC przy 150 obr/min i w odstępach 2-3 dobowych pobierano sterylnie płyn pohodowlany, który następnie odwirowano przy 5500 obr/min przez 20 minut w temperaturze 4ºC. W otrzymanych próbach zmierzono aktywność lakaz Przygotowanie zagęszczonych preparatów enzymatycznych W procesie zagęszczania płynów pohodowlanych zastosowano dwa zestawy ultrafiltracyjne. W pierwszym przypadku wykorzystano wysokoprzepływowy dializator polisulfonowy ADWENCET o powierzchni roboczej 1,8m 2 zatrzymujący cząstki o masie powyżej 18 kda. Proces ultrafiltracji prowadzono przy ciśnieniu 0,05 MPa, a dla zmniejszenia strat związanych z adsorpcją białek na membranie zastosowano proces diafiltracji. W otrzymanych frakcjach zmierzono aktywność celulaz i ksylanaz. W drugim przypadku wykorzystano zestaw do ultrafiltracji Pellicon XP (Millipore), który umożliwiał stosowanie hydrofobowych membran polieterosulfonowych o różnych punktach odcięcia. W badaniach wykorzystano membrany zatrzymujące cząstki o masie powyżej 8kDa i 30 kda. Ciśnienie wejściowe wynosiło 0,3 MPa, a ciśnienie wyjściowe 0,1 MPa. Proces prowadzono w temperaturze 4 C. W otrzymanym retentacie zmierzono aktywność badanych hydrolaz Enzymatyczna hydroliza odpadowych materiałów ligninocelulozowych Substraty stosowane w procesach hydrolizy enzymatycznej W procesach enzymatycznej hydrolizy zastosowano natywne oraz modyfikowane metodami obróbki wstępnej odpady ligninocelulozowe: odpadowy materiał pofiltracyjny (OMP) odpadowe kaczany kukurydziane (OKK) 43

44 Materiały i metody poekstrakcyjny odpad kukurydziany (CGF) zmodyfikowany chemicznie odpadowy materiał pofiltracyjny (zchomp) zmodyfikowany termicznie odpadowy materiał pofiltracyjny (ztomp) ekstrudowane odpadowe kaczany kukurydziane (zokk) ekstrudowany poekstrakcyjny odpad kukurydziany (zcgf) Przebieg procesu enzymatycznej hydrolizy odpadowych materiałów ligninocelulozowych Procesy hydrolizy enzymatycznej prowadzono w dwóch powtórzeniach w kolbach plastikowych z korkiem o pojemności 100 ml. Do 1,2 g substratu dodano 2,5 ml wody i sterylizowano przez 30 minut w temperaturze 121ºC przy ciśnieniu 1 atm. Po ostudzeniu dodano 12,5 ml preparatu enzymatycznego odpowiednio rozcieńczonego 0,05 M buforem octanowym o ph 4,8. Dla utrzymania sterylności procesu dodawano kilka kryształków tymolu. Reakcje prowadzono w temperaturze 50ºC przez 24, 48 oraz 72 godzin, a następnie oddzielano pozostałość substratu od hydrolizatu poprzez sączenie. Otrzymane hydrolizaty analizowano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (wybrane warianty procesu) oraz analitycznie oznaczono w nich zawartość związków redukujących ogółem, glukozy oraz pentoz. Pozostałość substratu wysuszono w celu określenia ubytku suchej masy substratu i określenia zawartości hemiceluloz. Dla wybranych wariantów wykonano także zdjęcia za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. W procesach enzymatycznej hydrolizy zastosowano zagęszczone preparaty enzymatyczne otrzymane w badaniach własnych i porównawczo komercyjne preparaty enzymatyczne (Celluclast 1.5 oraz Novozyme 188). Ilość jednostek aktywności enzymatycznych wprowadzonych do reakcji była zróżnicowana i dlatego szczegółowo aspekt ten został opisany w rozdziale piątym Omówienie wyników. 44

45 Materiały i metody Wpływ inhibitorów na proces enzymatycznej hydrolizy modyfikowanych odpadowych kaczanów kukurydzianych Celem określenia wpływu inhibitorów na proces enzymatycznej hydrolizy zokk sporządzono roztwór następujących związków w 0,05 M buforze octanowym o ph 4,8: 5-hydroksymetylofurfural 160 mg/l kwas syryngowy 12 mg/l kwas waniliowy 22 mg/l kwas kumarylowy 88 mg/l kwas ferulowy 50 mg/l. Przebieg procesu hydrolizy. Do 1,2 g zokk dodano 2,5 ml wody destylowanej, a następnie wysterylizowano (121ºC, 30 minut, 1 atm). Po ostudzeniu dodano 12,5 ml preparatu enzymatycznego (odpowiednio rozcieńczonego 0,05 M buforem octanowym o ph 4,8 zawierającym związki inhibitorowe) otrzymanego w wyniku zagęszczenia płynu pohodowlanego szczepu M1012. Proces prowadzono przez 48 i 72 godziny w temperaturze 50ºC, następnie oddzielono hydrolizat, w którym zmierzono ilość związków redukujących ogółem, glukozy i pentoz oraz określono ubytek suchej masy w osadzie. Jednocześnie przeprowadzono proces enzymatycznej hydrolizy zokk bez dodatku inhibitorów Określenie stopnia wydajności procesu enzymatycznej hydrolizy Wydajność procesu hydrolizy enzymatycznej przedstawiono w przeliczeniu na związki redukujące ogółem wg poniższego wzoru: wydajność procesu [%] = (ilość uwolnionych zw. redukujących ogółem [mg] x 0,9) x 100% sucha masa substratu [mg] 45

46 Materiały i metody 4.2. Metody badawcze Metody analityczne Oznaczanie aktywności karboksymetylocelulaz (CMCaz) (Mandels i inni 1976, Miller 1959) Zasada metody polega na uwolnieniu związków redukujących z soli sodowej karboksymetylocelulozy (CMC-Na) i oznaczeniu ich odczynnikiem DNS 3. Kwas 3,5 dinitrosalicylowy (DNS) w obecności związków redukujących ulega przekształceniu do kwasu 3 amino 5 nitrosalicylowego, który tworzy trwałe ciemnobrązowe kompleksy z fenolem. Przygotowanie substratu 1% roztworu soli sodowej karboksymetylocelulozy. 1 g CMC-Na (Sigma) rozpuszczono na gorąco w 50 ml wody i uzupełniono 0,1M buforem octanowym o ph 4,8. Przebieg reakcji. W probówce umieszczono 0,25 ml substratu, a następnie po 5 minutach preinkubacji dodano 0,25 ml odpowiednio rozcieńczonego enzymu i mieszaninę inkubowano przez 30 minut w temperaturze 50ºC. Reakcję przerwano poprzez dodanie 1,5 ml odczynnika DNS, zawartość probówek przetrzymano przez 10 minut w 100ºC i dopełniono do 10 ml wodą destylowaną. Równocześnie wykonano próbę kontrolną, do której roztwór enzymów dodano po wprowadzeniu odczynnika DNS. Absorbancję prób właściwych oraz prób kontrolnych odczytano przy długości fali λ=530 nm wobec próby ślepej (0,5 wody destylowanej + 1,5 ml odczynnika DNS). Przyrost związków redukujących (różnica pomiędzy próbą właściwą a kontrolą) odczytano z krzywej standardowej dla glukozy (500 µg/ml). Aktywność enzymatyczną CMC-az (hodowle wgłębne) wyrażono w µmolach związków redukujących (glukozy) uwalnianych w ciągu 1 minuty przez 1 ml roztworu enzymu [U/ml]. W przypadku hodowli w podłożu stałym za jednostkę aktywności przyjęto taką ilość enzymu, która uwalniała 1 µmol glukozy w przeliczeniu na 1g substratu w ciągu 1 minuty w standardowych warunkach reakcji [U/g]. 3 Skład odczynnika DNS: 10,6 g kwasu 3,5-dinitrosalicylowego; 306 g winianu sodowo-potasowego; 19,8g NaOH; 8,3 g NaHSO 3 ; 7,6 ml fenolu; 1416 ml H 2 O. 46

47 Materiały i metody Oznaczanie aktywności celulaz scukrzających (FPaz) (Mandels i inni 1976, Miller 1959) Zasada metody polega na uwolnieniu związków redukujących z bibuły filtracyjnej Whatman No 1 i oznaczeniu ich odczynnikiem DNS. Przebieg reakcji. Pasek bibuły filtracyjnej Whatman No1 (5 mm x 60 mm) o masie 25 mg zanurzono w 0,25 ml 0,05M buforu octanowego o ph 4,8. Po 5 minutach preinkubacji do prób właściwych wprowadzono 0,25 ml roztworu enzymu i inkubowano przez 60 minut w temperaturze 50ºC. Kolejno do wszystkich probówek dodano 1,5 ml odczynnika DNS, a następnie do prób kontrolnych roztwór enzymu. Probówki umieszczono we wrzącej łaźni wodnej, po 10 minutach ostudzono i dopełniono do 10 ml wodą destylowaną. Absorbancję barwnych produktów reakcji odczytano na spektrofotometrze przy długości fali λ=530 nm wobec próby ślepej (0,5 ml wody destylowanej + 1,5 ml odczynnika DNS). Przyrost związków redukujących (różnica pomiędzy próbą właściwą a kontrolą) odczytano z krzywej standardowej dla glukozy (500 µg/ml). Aktywność enzymatyczną FP-az (hodowle wgłębne) wyrażono w µmolach związków redukujących (glukozy) uwalnianych w ciągu 1 minuty przez 1 ml roztworu enzymu [U/ml]. W przypadku hodowli w podłożu stałym za jednostkę aktywności przyjęto taką ilość enzymu, która uwalniała 1 µmol glukozy w przeliczeniu na 1g substratu w ciągu 1 minuty w standardowych warunkach reakcji [U/g] Oznaczanie aktywności ksylanaz (Deschamps i Huet 1985, Miller 1959) Zasada metody polega na uwolnieniu związków redukujących z ksylanu i oznaczeniu ich odczynnikiem DNS. Przygotowanie substratu 1% roztwór ksylanu. 1 g ksylanu (Xylan from birchwood, Sigma) roztarto w 5 ml 1 M NaOH, dodano 55 ml wody destylowanej i 5 ml 1 M CH 3 COOH. Po ustaleniu ph na poziomie 5,0 uzupełniono do objętości 100 ml 0,1 M buforem octanowym o ph 4,8. 47

48 Materiały i metody Przebieg reakcji. Do preinkubowanego substratu (0,25 ml) dodano 0,25 ml roztworu enzymu i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 50ºC. Reakcję przerwano poprzez wprowadzenie 1,5 ml odczynnika DNS, w próbie kontrolnej roztwór enzymu dodano po odczynniku DNS. Następnie probówki przetrzymywano przez 10 minut w 100ºC i po ostudzeniu zawartość dopełniono do 10 ml wodą destylowaną. Równocześnie wykonano próbę kontrolną, do której roztwór enzymu wprowadzono po dodaniu odczynnika DNS. Absorbancję odczytano na spektrofotometrze wobec próby ślepej (0,5 ml wody destylowanej + 1,5 ml odczynnika DNS) przy długości fali λ=530 nm. Przyrost związków redukujących (różnica pomiędzy próbą właściwą a kontrolą) odczytano z krzywej standardowej dla ksylozy (500 µg/ml). Aktywność enzymatyczną ksylanaz (hodowle wgłębne) wyrażono w µmolach związków redukujących (ksylozy) uwalnianych w ciągu 1 minuty przez 1 ml roztworu enzymu [U/ml]. W przypadku hodowli w podłożu stałym za jednostkę aktywności przyjęto taką ilość enzymu, która uwalniała 1 µmol ksylozy w przeliczeniu na 1g substratu w ciągu 1 minuty w standardowych warunkach reakcji [U/g] Oznaczanie aktywności β-glukozydaz (Deschamps i Huet 1984) Zasada metody polega na enzymatycznym oznaczeniu glukozy, uwolnionej w wyniku hydrolizy celobiozy. W wyniku reakcji utleniania glukozy przy udziale oksydazy glukozowej powstaje nadtlenek wodoru. Otrzymany produkt w połączeniu z 4 aminoantypiryną i fenolem w obecności peroksydazy daje trwały kompleks barwny, którego stężenie oznaczono spektrofotometrycznie. oksydaza glukozowa Glukoza + 0,5O 2 +H 2 O Glukonian + H 2 O 2 2H 2 O aminoantypiryna + fenol peroksydaza Chinonoimina + 4H 2 O Przygotowanie substratu. 0,342 g celobiozy (Merck) rozpuszczono w 100 ml 0,05 M buforu octanowego o ph 4,8. 48

49 Materiały i metody Przebieg reakcji. Do 1,8 ml roztworu standardowego celobiozy (preinkubowanego 5 minut) dodano 0,2 ml roztworu enzymu. Równocześnie wykonano do każdej próby właściwej próbę kontrolną enzymu, która zawierała 1,8 ml wody destylowanej oraz 0,2 ml enzymu. Ponadto sporządzono także jedną próbę kontrolną substratu, która składała się z 1,8 ml standardu celobiozy oraz 0,2 ml wody destylowanej. Po upływie 30 minut (50ºC ) zawartość probówek zagotowano, a następnie ochłodzono i za pomocą testu GLUCOSE (BioSystems) zmierzono stężenie glukozy. W tym celu pobrano z każdej z probówek 10 µl i wprowadzono do 1 ml odczynnika A i pozostawiono w temperaturze pokojowej na 10 minut. Dodatkowo sporządzono mieszaninę standardową, która składała się z 10 µl standardu glukozy (1 mg/ml) i 1 ml odczynnika A. Pomiaru absorbancji dokonano na spektrofotometrze przy długości fali λ=500 nm wobec odczynnika A (próba ślepa). Stężenie glukozy obliczono ze wzoru: gdzie: A próby - absorbancja próby A standardu - absorbancja standardu C glukozy - stężenie glukozy C standardu - stężenie standardu (5,55 μmol/ml glukozy lub 1 mg/ml glukozy). Aktywność enzymatyczną β-glukozydaz (hodowle wgłębne) wyrażono w µmolach glukozy uwolnionej w ciągu 1 minuty przez 1 ml roztworu enzymu [U/ml]. W przypadku hodowli w podłożu stałym za jednostkę aktywności przyjęto taką ilość enzymu, która uwalniała 1 µmol glukozy w przeliczeniu na 1g substratu w ciągu 1 minuty w standardowych warunkach reakcji [U/g]. 49

50 Materiały i metody Oznaczanie aktywności lakaz (Childs i Bardsley 1975) Aktywność lakazy mierzono wobec 0,228 mm soli sodowej kwasu 2,2 -azyno-bis-3- etylobenzeno-tiazolo-6-sulfonowego (ABTS) jako substratu. Reakcję prowadzono w 0,1 M buforze cytrynianowo-fosforanowym o ph 5,25 w temperaturze 30 C. Zmianę absorbancji monitorowano przy długości fali 420 nm. Aktywność lakazy wyrażono jako liczbę jednostek aktywności w 1 ml płynu pohodowlanego [U/ml], a za 1 U przyjęto ilość enzymu, która w warunkach reakcji powodowała zmianę absorbancji o jedną jednostkę w ciągu 1 minuty Oznaczanie białka metodą Lowry ego (Lowry i inni 1951) Zasada metody polega na redukcji odczynnika Folina-Ciocalteu do błękitu fosfomolibdenowego w obecności tyrozyny i tryptofanu. Przebieg reakcji. Do mieszaniny zawierającej 0,9 ml 0,9% roztworu NaCl i 0,1 ml roztworu białka wprowadzono 5 ml świeżo sporządzonego odczynnika AB (50 A : 1 B) 4 i po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej dodano 0,5 ml odczynnika Folina-Ciocalteu (POCH). Próby pozostawiono na 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odczytano absorbancję na spektrofotometrze przy długości fali λ=750 nm wobec próby ślepej (1 ml 0,9% NaCl + 5 ml odczynnika AB + 0,5 ml odczynnika Folina-Ciocalteu). Zawartość białka odczytano z krzywej standardowej dla albuminy wołowej (100 µg/ml) Oznaczanie ilości związków redukujących ogółem (Miller 1959) Zasada metody polega na redukcji kwasu 3,5-dinitrosalicylowego do kwasu 3 amino 5 nitro salicylowego. 4 Skład odczynnika A: 2 g Na 2 CO 3 rozpuszczone w 100 ml 0,1 M NaOH; skład odczynnika B: 0,5 g CuSO 4 x5h 2 O rozpuszczone w 100 ml 1% roztworu cytrynianu sodu 50

51 Materiały i metody Przebieg reakcji. Do 1 ml roztworu zawierającego badane związki redukujące dodano 1,5 ml odczynnika DNS, a następnie przetrzymano we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut. Po wyjęciu i ostudzeniu dopełniono wodą destylowaną do objętości 10 ml. Absorbancję zmierzono wobec próby ślepej (1 ml wody destylowanej + 1,5 ml odczynnika DNS) przy długości fali λ=530 nm. Ilość związków redukujących ogółem (jako ekwiwalent glukozy) odczytano z krzywej standardowej (500 µg/ml) Oznaczanie ilości glukozy Stężenie glukozy wyznaczono za pomocą testu GLUCOSE (BioSystems) analogicznie jak opisano w pkt Oznaczanie ilości pentoz (Mejbaum-Katzenellenbogen i Mochnacka 1966) Zasada metody oznaczania pentoz oparta na reakcji Biala polega na spektrofotometrycznym (λ=610 nm) oznaczaniu kompleksu jonów żelaza i orcyny z furfuralem, który powstaje w wyniku odwodnienia pentoz podczas ogrzewania ze stężonym kwasem solnym. Przebieg reakcji. Mieszaninę reakcyjną składającą się z 1 ml roztworu zawierającego pentozy i 1 ml świeżo sporządzonego odczynnika orcynowego przetrzymywano przez 20 minut w 100ºC, a następnie po ostudzeniu uzupełnioną wodą destylowaną do objętości 4 ml. Absorbancję odczytano wobec próby ślepej (1 ml wody destylowanej + 1 ml odczynnika orcynowego) przy długości fali λ=610 nm. Stężenie pentoz odczytano z krzywej standardowej sporządzonej dla roztworu ksylozy o stężeniu 100 µg/ml. 51

52 Materiały i metody Inne metody Oznaczanie produktów hydrolizy za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) Pomiar stężenia glukozy, celobiozy, arabinozy, kwasu glukuronowego wykonano z wykorzystaniem kolumny Aminex HPX 87H połączonej z detektorem UV (210 nm) oraz RI. Wszystkie analizy wykonano w temperaturze pokojowej. Szybkość przepływu eluentu 20 mm H 2 SO 4 wynosiła 0,3 ml/min. Określenia stężeń poszczególnych cukrów oraz kwasu glukuronowego wykonano na podstawie powierzchni pików odnoszonych do powierzchni pików roztworów wzorcowych, zawierających badane związki w ilości 5 g/l Zobrazowanie zmiany struktury ligninocelulozy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej Analizy wykonano w Pracowni Mikroskopii Elektronowej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu Wyznaczenie ubytku suchej masy substratu Uprzednio zważone sączki wykorzystano do oddzielenia osadu od hydrolizatu, po czym sączki wraz z osadem wysuszono do stałej masy (105ºC) i zważono przy pomocy wagosuszarki RADWAG WPS 110S. Ubytek suchej masy wyrażono jako różnicę masy substratu poddanego hydrolizie enzymatycznej i masy osadu pozostałego po procesie hydrolizy, co odpowiada: ubytek suchej masy [g] = M substrat (M osad+sączek - M sączka ) gdzie: M substrat sucha masa substratu poddanego procesowi hydrolizy 52

53 Materiały i metody M osad+sączek M sączka sucha masa sączka i substratu po procesie hydrolizy sucha masa sączka Oznaczanie aktywności wody oraz wilgotności podłoża Oznaczenia aktywności wody (wolnej wody) w trakcie trwania hodowli w podłożu stałym (SSF) dokonano za pomocą urządzenia LabMaster aw (Novosina) stosując faktor a w = 3 i faktor temperatury = S. Oznaczenia wilgotności wykonano wykorzystując wagosuszarkę RADWAG WPS 53

54 Omówienie wyników 5. Omówienie wyników 5.1. Biosynteza celulaz i ksylanaz przez grzyby strzępkowe Trichoderma sp. i Aspergillus sp. w hodowlach wstrząsanych Biodegradacja materiałów ligninocelulozowych zachodzi przy udziale kompleksu wyspecjalizowanych enzymów, do których zaliczamy przede wszystkim celulazy i ksylanazy. Proces, podczas którego enzymy te syntetyzowane są przez grzyby strzępkowe, wymaga określenia najefektywniejszych warunków, tj. przede wszystkim doboru odpowiedniego źródła węgla i energii, jego ilości, a także optymalnego czasu trwania hodowli. W niniejszej pracy, jako główne źródło węgla i energii, wykorzystano odpadowe materiały ligninocelulozowe pochodzące z przemysłu rolno-spożywczego, co jest istotne z punktu widzenia ochrony środowiska, ponieważ sprzyja pozyskiwaniu nowych rozwiązań zwiększających zagospodarowanie niewykorzystanych produktów ubocznych. W pierwszym etapie pracy przeprowadzono 14 dobowe hodowle wstrząsane, podczas których badano dynamikę biosyntezy wybranych enzymów hydrolitycznych CMCaz, FPaz i endo-ß-1,4-ksylanaz syntetyzowanych przez badane grzyby strzępkowe z rodzaju Trichoderma (T. hamatum C1 oraz T. harzianum T33) oraz Aspergillus (A. niger XP). W celu określenia najbardziej efektywnego induktora, wykorzystano trzy różne materiały odpadowe w ilości 2%: odpadowe kaczany kukurydziane (OKK), odpadowy materiał pofiltracyjny (OMP) i corn gluten feed, czyli poekstrakcyjny odpad kukurydziany (CGF). Jako dodatkowe, łatwo dostępne źródło węgla i energii zastosowano glukozę w trzech stężeniach (0,25%, 0,5%, 0,75%), a także prowadzono hodowle bez dodatku glukozy (0%). Ze względu na obszerną dokumentację dynamiki biosyntezy wybranych enzymów, w niniejszym rozdziale przedstawiono i omówiono jedynie najwyższe aktywności, jakie oznaczono w otrzymanych płynach pohodowlanych. 54

55 Omówienie wyników Wpływ różnych źródeł węgla na biosyntezę celulaz i ksylanaz przez szczep T. hamatum C1 Szczep T. hamatum C1 syntetyzował enzymy rozkładające celulozę i ksylan z różną intensywnością w zależności od zastosowanego głównego źródła węgla i energii. Najefektywniejszym induktorem ksylanaz, był odpadowy materiał pofiltracyjny. W podłożach z OMP odnotowano najwyższe aktywności tych enzymów, przekraczające wartość 5 U/ml w hodowlach z 0% i 0,25% dodatkiem glukozy. Istotny wpływ na biosyntezę wszystkich enzymów miało stężenie glukozy, poziom badanych aktywności obniżał się wraz ze wzrostem stężenia dodatkowego źródła węgla inicjującego wzrost grzybni - w najlepszym wariancie hodowli (0% glukozy) oznaczono CMCazy na poziomie 1,17U/ml, FPazy - 0,55 U/ml i ksylanazy - 7,29 U/ml (Rys. 12), odpowiednio w 12, 14 i 12 dobie hodowli. Podobną tendencję zauważono w hodowlach, w których zastosowano odpadowe kaczany kukurydziane, przy czym aktywność ksylanaz była prawie dwukrotnie niższa (4,02 U/ml w 12 dobie; 0% glukozy). Obecność OKK w podłożu wpłynęła z kolei korzystnie na biosyntezę CMCaz, ich najwyższe wartości aktywności mieściły się w zakresie od 0,85 U/ml do 1,07 U/ml. Różne stężenia glukozy nie miały większego wpływu na biosyntezę CMCaz i ksylanaz, jedynie w przypadku FPaz zaobserwowano negatywny wpływ rosnącego stężenia glukozy, w hodowli z dodatkiem 0,75% aktywność spadła prawie dwukrotnie w porównaniu do wariantu bez glukozy (Rys. 10). Najsłabszym induktorem badanych enzymów był poekstrakcyjny odpad kukurydziany. Aktywność ksylanaz nie przekroczyła wartości 2,00 U/ml w najlepszym wariancie hodowli z dodatkiem 0,25% glukozy i w tym przypadku była około 100% wyższa w porównaniu do pozostałych wariantów hodowli. Aktywności enzymów degradujących celulozę, w tym szczególnie FPaz, były na bardzo niskim poziomie (Rys. 11). 55

56 Aktywność [U/ml] Aktywność [U/ml] Omówienie wyników 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 2% OKK 0% glu 2% OKK 0,25% glu 2% OKK 0,5% glu 2% OKK 0,75% glu CMCazy 1,07 0,94 0,85 0,96 FPazy 0,53 0,37 0,30 0,28 Ksylanazy 4,02 3,88 3,66 3,53 Rys. 10. Porównanie najwyższych aktywności celulaz i ksylanaz syntetyzowanych przez T. hamatum C1 podczas hodowli wstrząsanych w podłożu z odpadowymi kaczanami kukurydzianymi (2%). 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 2% CGF 0% glu 2% CGF 0,25% glu 2% CGF 0,5% glu 2% CGF 0,75% glu CMCazy 0,10 0,40 0,21 0,20 FPazy 0,04 0,15 0,07 0,07 Ksylanazy 0,83 1,85 0,91 0,74 Rys. 11. Porównanie najwyższych aktywności celulaz i ksylanaz syntetyzowanych przez T. hamatum C1 podczas hodowli wstrząsanych w podłożu z poekstrakcyjnym odpadem kukurydzianym (2%). 56

57 Aktywność [U/ml] Omówienie wyników 5,00 4,00 3,00 7,29 5,71 2,00 1,00 0,00 2% OMP 0% glu 2% OMP 0,25% glu 2% OMP 0,5% glu 2% OMP 0,75% glu CMCazy 1,17 0,75 0,58 0,62 FPazy 0,55 0,25 0,25 0,17 Ksylanazy 7,29 5,71 4,64 3,27 Rys. 12. Porównanie najwyższych aktywności celulaz i ksylanaz syntetyzowanych przez T. hamatum C1 podczas hodowli wstrząsanych w podłożu z odpadowym materiałem pofiltracyjnym (2%) Wpływ różnych źródeł węgla na biosyntezę celulaz i ksylanaz przez szczep T. harzianum T33 Spośród wszystkich zastosowanych głównych źródeł węgla i energii najbardziej przydatnym induktorem zewnątrzkomórkowych hydrolaz syntetyzowanych przez szczep T. harzianum T33 były odpadowe kaczany kukurydziane. Obecność w podłożu OKK jako jedynego źródła węgla sprzyjała biosyntezie wszystkich enzymów, w wariantach z dodatkiem glukozy ich aktywność obniżała się wraz ze wzrostem jej stężenia. Najwyższe aktywności CMCaz, FPaz i ksylanaz oznaczono w 14 dobie hodowli bez dodatku glukozy i wynosiły one odpowiednio 0,93 U/ml, 0,30 U/ml i 4,33 U/ml (Rys. 13). Znacznie słabszym induktorem badanych enzymów był odpadowy materiał pofiltracyjny. Zaobserwowano, że OMP indukował głównie biosyntezę CMCaz, najwyższą aktywność zmierzono w 12 dobie hodowli w podłożu uzupełnionym glukozą w stężeniu 0,25% i wyniosła ona 1,22 U/ml, natomiast aktywności FPaz i ksylanaz były na bardzo niskim poziomie (Rys. 15). Produkcja enzymów słabo ujawniała się gdy wykorzystano poekstrakcyjny odpad kukurydziany jako główne źródło węgla i energii. Biosynteza CMCaz i FPaz była bliska lub równa zeru w wariantach 57

58 Aktywność [U/ml] Aktywność [U/ml] Omówienie wyników 0%-0,50% glukozy, jedynie dodatek 0,75% glukozy spowodował, że szczep T33 był zdolny do biosyntezy wszystkich trzech badanych enzymów, ale także na bardzo niskim poziomie (Rys. 14). 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 2% OKK 0% glu 2% OKK 0,25% glu 2% OKK 0,5% glu 2% OKK 0,75% glu CMCazy 0,93 0,87 0,67 0,61 FPazy 0,30 0,13 0,24 0,25 Ksylanazy 4,33 3,86 3,21 2,70 Rys. 13. Porównanie najwyższych aktywności celulaz i ksylanaz syntetyzowanych przez T. harzianum T33 podczas hodowli wstrząsanych w podłożu z odpadowymi kaczanami kukurydzianymi (2%). 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 2% CGF 0% glu 2% CGF 0,25% glu 2% CGF 0,5% glu 2% CGF 0,75% glu CMCazy 0,02 0,02 0,01 0,29 FPazy 0,00 0,00 0,00 0,07 Ksylanazy 0,15 0,18 0,18 0,40 Rys. 14. Porównanie najwyższych aktywności celulaz i ksylanaz syntetyzowanych przez T. harzianum T33 podczas hodowli wstrząsanych w podłożu z poekstrakcyjnym odpadem kukurydzianym (2%). 58

59 Aktywność [U/ml] Omówienie wyników 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 2% OMP 0% glu 2% OMP 0,25% glu 2% OMP 0,5% glu 2% OMP 0,75% glu CMCazy 0,48 1,22 1,09 0,74 FPazy 0,13 0,13 0,08 0,10 Ksylanazy 0,49 0,44 0,40 0,25 Rys. 15. Porównanie najwyższych aktywności celulaz i ksylanaz syntetyzowanych przez T. harzianum T33 podczas hodowli wstrząsanych w podłożu z odpadowym materiałem pofiltracyjnym (2%) Wpływ różnych źródeł węgla na biosyntezę celulaz i ksylanaz przez szczep A. niger XP Wszystkie opadowe materiały ligninocelulozowe będące w hodowlach głównym źródłem węgla i energii stanowiły stosunkowy dobry induktor enzymów syntetyzowanych przez szczep A. niger XP. Zaobserwowano także, że różne stężenia glukozy obecnej w podłożach miały niejednolity wpływ na biosyntezę zewnątrzkomórkowych hydrolaz w hodowlach z trzema głównymi źródłami węgla i energii. W podłożu z odpadowymi kaczanami kukurydzianymi, które były najlepszym induktorem ksylanaz, nie odnotowano istotnego wpływu stężenia dodatkowego źródła węgla na biosyntezę wszystkich badanych enzymów. Najwyższe zmierzone aktywności charakteryzowały się bardzo zbliżonymi wartościami w obrębie danego enzymu. Aktywności CMCaz mieściły się w zakresie od 0,44 U/ml do 0,54 U/ml, FPaz od 0,23 U/ml do 0,29 U/ml, natomiast ksylanaz od 3,79 U/ml do 3,93 U/ml (Rys. 16). Najefektywniejszą biosyntezę odnotowano głównie w ostatnich dobach hodowli (12 i 14 doba), wyjątek stanowiła najwyższa wartość aktywności ksylanaz zmierzona już w 5 dobie hodowli w podłożu z 0,25% dodatkiem glukozy (3,80 U/ml). Obecność odpadowego materiału pofiltarcyjnego w podłożu hodowlanym wpłynęła korzystnie na biosyntezę celulaz. Aktywność CMCaz była około dwukrotnie wyższa 59

60 Aktywność [U/ml] Omówienie wyników w porównaniu do wariantów, w których zastosowano OKK i CGF, osiągając w 12 dobie najwyższą wartość równą 1,21 U/ml w podłożu z 0,5% dodatkiem glukozy. Podobną tendencję zanotowano w przypadku FPaz, których najwyższe wartości aktywności przypadały na siódmą (0,48 U/ml) i dziesiątą (0,42 U/ml) dobę hodowli, odpowiednio w obecności 0,25% i 0,50% dodatkowego źródła węgla. Wzrastające stężenie glukozy w podłożu z OMP miało jednak negatywny wpływ na biosyntezę ksylanaz, ich aktywność malała od 4,05 U/ml (0% glukozy) do 2,25 U/ml (0,75% glukozy) (Rys. 18). Najsłabszym induktorem badanych enzymów, był poekstrakcyjny odpad kukurydziany. Ponadto, zarówno brak glukozy w podłożu, jak i jej najwyższe stężenie wpłynęło niekorzystnie na produkcję badanych hydrolaz. W najlepszym wariancie hodowli, z dodatkiem 0,25% glukozy, odnotowano aktywność ksylanaz na poziomie 3,14 U/ml już w 3 dobie hodowli. Podobnie FPazy były najefektywniej syntetyzowane w początkowych dobach hodowli (3 i 5 doba), osiągając jednak stosunkową niską, w porównaniu do hodowli z innymi induktorami, najwyższą wartość aktywności równą 0,17 U/ml (0,25% glukozy) (Rys. 17). 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 2% OKK 0% glu 2% OKK 0,25% glu 2% OKK 0,5% glu 2% OKK 0,75% glu CMCazy 0,44 0,53 0,54 0,52 FPazy 0,23 0,26 0,29 0,29 Ksylanazy 3,79 3,80 3,82 3,93 Rys. 16. Porównanie najwyższych aktywności celulaz i ksylanaz syntetyzowanych przez A. niger XP podczas hodowli wstrząsanych w podłożu z odpadowymi kaczanami kukurydzianymi (2%). 60

61 Aktywność [U/ml] Aktywność [U/ml] Omówienie wyników 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 2% CGF 0% glu 2% CGF 0,25% glu 2% CGF 0,5% glu 2% CGF 0,75% glu CMCazy 0,29 0,54 0,60 0,22 FPazy 0,13 0,17 0,07 0,08 Ksylanazy 2,45 3,14 2,93 2,09 Rys. 17. Porównanie najwyższych aktywności celulaz i ksylanaz syntetyzowanych przez A. niger XP podczas hodowli wstrząsanych w podłożu z poekstrakcyjnym odpadem kukurydzianym (2%). 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 2% OMP 0% glu 2% OMP 0,25% glu 2% OMP 0,5% glu 2% OMP 0,75% glu CMCazy 1,14 1,18 1,21 0,93 FPazy 0,29 0,48 0,42 0,21 Ksylanazy 4,05 3,97 3,65 2,25 Rys. 18. Porównanie najwyższych aktywności celulaz i ksylanaz syntetyzowanych przez A. niger XP podczas hodowli wstrząsanych w podłożu z odpadowym materiałem pofiltarcyjnym (2%). Określenie wpływu różnych induktorów (odpadowych materiałów ligninocelulozowych w stężeniu 2 %) oraz zmiennej ilości dodatkowego źródła węgla i energii na dynamikę biosyntezy celulaz i ksylanaz pozwoliło na dokonanie wyboru 61

62 Omówienie wyników najefektywniejszych warunków sprzyjających produkcji badanych enzymów. Główne kryterium wyboru stanowił oczywiście poziom uzyskanych aktywności, ale dodatkowo wzięto także pod uwagę najkrótszy czas (dobę hodowli), w jakim osiągnięto najwyższe wartości aktywności. Prowadzenie kolejnych doświadczeń miało na celu próbę zwiększenia efektywności biosyntezy badanych hydrolaz niezbędnych w procesie biodegradacji materiałów ligninocelulozowych poprzez zastosowanie wzrastającego stężenia głównego induktora ksylanaz i celulaz. Z doniesień literaturowych wynika ponadto, że istotnym czynnikiem wpływającym na produkcję poszczególnych grup enzymów jest ph środowiska, dlatego też hodowle prowadzono z korektą ph podłoża hodowlanego do wartości około 5,0. Do dalszego etapu badań wybrano sześć wariantów hodowli, przy czym doświadczenia prowadzono z udziałem dwóch szczepów grzybów strzępkowych szczep T. harzianum T33 wyeliminowano z dalszych badań ze względu na najniższy poziom uzyskanych aktywności enzymatycznych. Wybrane warianty hodowli zestawiono w Tabeli 6. Tabela 6. Wykaz wariantów hodowli wstrząsanych z głównym źródłem węgla (2%) wybranych do drugiego etapu badań. Szczep Główne źródło węgla i energii Stężenie dodatkowego źródła węgla T. hamatum C1 A. niger XP Odpadowe kaczany kukurydziane Poekstrakcyjny odpad kukurydziany Odpadowy materiał pofiltracyjny Odpadowe kaczany kukurydziane Poekstrakcyjny odpad kukurydziany Odpadowy materiał pofiltracyjny 0,25 % glukozy 0,25 % glukozy 0% glukozy 0,25 % glukozy 0,25 % glukozy 0% glukozy Hodowle wstrząsane prowadzono, analogicznie jak w poprzednim etapie, w podłożu Mandelsa Sternburga przez 14 dni, badając poziom biosyntezy enzymów w 3, 5, 7, 10, 12 i 14 dobie. Odpadowe materiały ligninocelulozowe (OKK, OMP, CGF) wykorzystywane przez drobnoustroje jako główne źródło węgla i energii pełniące jednocześnie funkcję induktora syntezy enzymów zastosowano w podłożach w trzech ilościach: 2%, 3%, 4%. 62

63 Omówienie wyników Wpływ różnych ilości odpadowych kaczanów kukurydzianych (OKK) w hodowlach wstrząsanych na biosyntezę celulaz i ksylanaz przez grzyby strzępkowe Oba szczepy grzybów strzępkowych syntetyzowały badane enzymy hydrolityczne z różną intensywnością w zależności od zastosowanego stężenia głównego źródła węgla i energii. Podczas hodowli zaobserwowano wysoki poziom biosyntetyzowanych ksylanaz przez szczep T. hamatum C1, ich aktywność w 14 dobie wyniosła 31,51 U/ml w podłożu z 2% OKK (Rys. 19). Zwiększenie ilości induktora w podłożu do 3% i 4% wpłynęło na efektywność biosyntezy tych enztmów i pozwoliło na osiągnięcie większych wartości aktywności odpowiadających ok. 38 U/ml (Rys. 20, Rys. 21). Biosynteza pozostałych enzymów była na niższym poziomie. W hodowlach z dodatkiem 2% i 3% OKK (0,25% glukozy) wzrost stężenia OKK do 3% spowodował zwiększenie aktywności endoglukanaz w procesie biosyntezy tych enzymów w początkowych dobach. Biosynteza CMCaz najefektywniej przebiegała w podłożu z 4% dodatkiem OKK (0,25% glukozy) zmierzając do wartości 1,51 U/ml w 14 dobie hodowli. Nie zanotowano wpływu ilości induktora na poziom produkcji ß-glukozydaz i FPaz (Rys. 19, Rys. 20, Rys. 21). W hodowlach z udziałem szczepu A. niger XP wzrastająca ilość induktora obecnego w podłożu miało wpływ na zwiększenie efektywności biosyntezy badanych hydrolaz. W porównaniu do szczepu T. hamatum C1 grzyby Aspergillus charakteryzowały się zdecydowanie wyższą produkcją ß-glukozydaz, a obecność 4% OKK (0,25% glukozy) stworzyła najbardziej sprzyjające warunki dla biosyntezy tych enzymów i osiągnięcia aktywności 3,83 U/ml i 3,94 U/ml, odpowiednio w 5 i 14 dobie hodowli (Rys. 24). Te same warunki hodowli były najbardziej odpowiednie dla produkcji ksylanaz, od 5 doby hodowli ich aktywność utrzymywała się w zakresie od 35,68 U/ml do 39,02U/ml. W porównaniu do hodowli z dodatkiem 2% i 3% OKK zaobserwowano odpowiednio około cztero- i dwukrotny wzrost ich aktywności. Profil biosyntezy CMCaz nie zmieniał się znacznie pod wpływem zmiennych warunków hodowli (Rys. 22 Rys. 24). 63

64 Aktywność CMCaz, FPaz, B-glukozydaz [U/ml] Aktywność ksylanaz [U/ml] Aktywność CMCaz, FPaz, B-glukozydaz [U/ml] Aktywność ksylanaz [U/ml] Omówienie wyników 4,00 3,50 3,00 50,00 40,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 30,00 20,00 10,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 19. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep T. hamatum C1 w hodowlach wstrząsanych z odpadowymi kaczanami kukurydzianymi (2% OKK) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 4,00 3,50 3,00 50,00 40,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 30,00 20,00 10,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 20. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep T. hamatum C1 w hodowlach wstrząsanych z odpadowymi kaczanami kukurydzianymi (3% OKK) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 64

65 Aktywność CMCaz, FPaz, B-glukozydaz [U/ml] Aktywność ksylanaz [U/ml] Aktywność CMCaz, FPaz, B-glukozydaz [U/ml] Aktywność ksylanaz [U/ml] Omówienie wyników 4,00 3,50 3,00 50,00 40,00 2,50 2,00 1,50 30,00 20,00 1,00 0,50 0,00 10,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 21. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep T. hamatum C1 w hodowlach wstrząsanych z odpadowymi kaczanami kukurydzianymi (4% OKK) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 4,00 3,50 3,00 50,00 40,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 30,00 20,00 10,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 22. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep A. niger XP w hodowlach wstrząsanych z odpadowymi kaczanami kukurydzianymi (2% OKK) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 65

66 Aktywność CMCaz, FPaz, B-glukozydaz [U/ml] Aktywność ksylanaz [U/ml] Aktywność CMCaz, FPaz, B-glukozydaz [U/ml] Aktywność ksylanaz [U/ml] Omówienie wyników 4,00 3,50 3,00 50,00 40,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 30,00 20,00 10,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 23. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep A. niger XP w hodowlach wstrząsanych z odpadowymi kaczanami kukurydzianymi (3% OKK) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 4,00 3,50 3,00 50,00 40,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 30,00 20,00 10,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 24. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep A. niger XP w hodowlach wstrząsanych z odpadowymi kaczanami kukurydzianymi (4% OKK) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 66

67 Omówienie wyników Wpływ różnych ilości poekstrakcyjnego odpadu kukurydzianego (CGF) w hodowlach wstrząsanych na biosyntezę celulaz i ksylanaz przez grzyby strzępkowe Wyniki, jakie otrzymano w pierwszym etapie badań jednoznacznie wykazały, że poekstrakcyjny odpad kukurydziany jest najmniej przydatnym induktorem badanych enzymów. Zwiększenie stężenia głównego źródła węgla i energii spowodowało pozytywny wpływ na produkcję CMCaz, FPaz i ksylanaz przez T. hamatum C1, ale ich aktywność pozostawała niestety nadal na stosunkowo niskim poziomie w porównaniu do poprzednio zastosowanego induktora (OKK). W wariancie hodowli z 2% CGF najwyższy odnotowany poziom ksylanaz wyniósł 3,96 U/ml, natomiast zwiększenie ilości induktora z 2% do 3% i 4% wywołało nasilenie procesu biosyntezy tych enzymów do poziomu odpowiednio 10,56 U/ml i 9,80 U/ml (Rys Rys. 27). Ponadto zaobserwowano dwukrotny wzrost aktywności FPaz pomiędzy dwoma wariantami hodowli - z najniższym i najwyższym stężeniem CGF (Rys 25 i Rys. 27). Szczep A. niger XP zdecydowanie lepiej wykorzystywał poekstrakcyjny odpad kukurydziany jako główne źródło węgla i energii w porównaniu do szczepu C1, co znalazło odzwierciedlenie w wyższych aktywnościach badanych enzymów, a największe różnice zaobserwowano w biosyntezie ß-glukozydaz. Poziom tych enzymów zmierzony w płynach pohodowlanych szczepu A. niger XP był średnio 20-krotnie wyższy. Wzrost stężenia CGF do 3% i 4% skutkował wydajniejszą biosyntezą ksylanaz. Począwszy od trzeciej doby hodowli aktywność ksylanaz utrzymywała się na poziomie powyżej 30 U/ml (Rys. 29, Rys. 30), a w 12 dobie hodowli z 4% CGF w podłożu nastąpił wzrost aktywności do 40,42 U/ml (Rys. 30). Wzrastające stężenie poekstrakcyjnego odpadu kukurydzianego w podłożu nie miało wpływu na wzrost efektywności biosyntezy CMCaz i FPaz (Rys. 28 Rys. 30). 67

68 Aktywność CMCaz, FPaz, B-glukozydaz [U/ml] Aktywność ksylanaz [U/ml] Aktywność CMCaz, FPaz, B-glukozydaz [U/ml] Aktywność ksylanaz [U/ml] Omówienie wyników 1,00 12,00 0,80 10,00 0,60 0,40 0,20 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 25. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep T. hamatum C1 w hodowlach wstrząsanych z poekstrakcyjnym odpadem kukurydzianym (2% CGF) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 1,00 12,00 0,80 10,00 0,60 0,40 0,20 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 26. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep T. hamatum C1 w hodowlach wstrząsanych z poekstrakcyjnym odpadem kukurydzianym (3% CGF) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 68

69 Aktywność CMCaz, FPaz, B-glukozydaz [U/ml] Aktywność ksylanaz [U/ml] Aktywność CMCaz, FPaz, B-glukozydaz [U/ml] Aktywność ksylanaz [U/ml] Omówienie wyników 1,00 12,00 0,80 10,00 0,60 0,40 0,20 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 27. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep T. hamatum C1 w hodowlach wstrząsanych z poekstrakcyjnym odpadem kukurydzianym (4% CGF) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 7,00 6,00 5,00 50,00 40,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 30,00 20,00 10,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 28. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep A. niger XP w hodowlach wstrząsanych z poekstrakcyjnym odpadem kukurydzianym (2% CGF) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 69

70 Aktywność CMCaz, FPaz, B-glukozydaz [U/ml] Aktywność ksylanaz [U/ml] Aktywność CMCaz, FPaz, B-glukozydaz [U/ml] Aktywność ksylanaz [U/ml] Omówienie wyników 7,00 6,00 5,00 50,00 40,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 30,00 20,00 10,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 29. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep A. niger XP w hodowlach wstrząsanych z poekstrakcyjnym odpadem kukurydzianym (3% CGF) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 7,00 6,00 5,00 50,00 40,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 30,00 20,00 10,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 30. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep A. niger XP w hodowlach wstrząsanych z poekstrakcyjnym odpadem kukurydzianym (4% CGF) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 70

71 Omówienie wyników Wpływ różnych ilości odpadowego materiału pofiltracyjnego (OMP) w hodowlach wstrząsanych na biosyntezę celulaz i ksylanaz przez grzyby strzępkowe Szczep T. hamatum C1 w hodowlach z odpadowym materiałem pofiltracyjnym jako głównym źródłem węgla i energii był zdolny do biosyntezy tylko trzech z czterech badanych enzymów - aktywność ß-glukozydaz zmierzona w trakcie trwania wszystkich hodowli była bliska lub równa zero. Profil produkcji CMCaz, FPaz i ksylanaz różnił się od tego, jaki zaobserwowano w poprzednich doświadczeniach ponieważ wzrastająca ilość głównego induktora enzymów powodowało obniżenie wydajności syntetyzowanych hydrolaz (Rys. 31 Rys. 33). Obecność OMP w podłożu w ilości 2% umożliwiło najefektywniejszą biosyntezę CMCaz, FPaz i ksylanaz, których wartości aktywności wyniosły odpowiednio 1,17 U/ml (12 doba), 0,55 U/ml (14 doba) i 7,29 U/ml (12 doba) (Rys. 31). W hodowlach z udziałem A. niger XP podobnie nie zaobserwowano zdecydowanie korzystnego wpływu rosnącego stężenia głównego źródła węgla i energii na wydajność biosyntezy enzymów. Jedynie w przypadku ß-glukozydaz w ostatnich dobach hodowli wystąpił blisko dwukrotny wzrost aktywności wskutek zwiększenia w podłożu ilości OMP do 3% i 4% (Rys. 35, Rys. 36). Biosynteza karboksymetylocelulaz była najefektywniejsza przy najniższej ilości induktora, maksymalną aktywność CMCaz zmierzono w 10 dobie i wyniosła ona 1,14 U/ml (Rys. 34). W hodowlach z dodatkiem 3% i 4% OMP dynamika produkcji CMCaz i FPaz w obrębie danej grupy enzymów przebiegała niemalże identycznie (Rys. 35, Rys. 36). Odpadowy materiał pofiltracyjny nie był dobrym induktorem ksylanaz w hodowlach z udziałem szczepu XP, ich aktywność nie przekroczyła w żadnym wariancie poziomu 3,00 U/ml (Rys. 34 Rys. 36). 71

72 Aktywność CMCaz, FPaz, B-glukozydaz, ksylanaz [U/ml] Aktywność CMCaz, FPaz, B-glukozydaz [U/ml] Aktywność ksylanaz [U/ml] Omówienie wyników 3,00 8,00 2,50 2,00 6,00 1,50 4,00 1,00 0,50 2,00 0,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 31. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep T. hamatum C1 w hodowlach wstrząsanych z odpadowym materiałem pofiltracyjnym (2% OMP) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0, Czas hodowli [doba] Rys. 32. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep T. hamatum C1 w hodowlach wstrząsanych z odpadowym materiałem pofiltracyjnym (3% OMP) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 72

73 Aktywność CMCazy, FPaz, B-glukozydaz [U/ml] Aktywność ksylanaz [U/ml] Aktywność CMCaz, FPaz, B-glukozydaz, ksylanaz [U/ml] Omówienie wyników 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0, Czas hodowli [doba] Rys. 33. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep T. hamatum C1 w hodowlach wstrząsanych z odpadowym materiałem pofiltracyjnym (4% OMP) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 3,00 8,00 2,50 2,00 6,00 1,50 4,00 1,00 0,50 2,00 0,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 34. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep A. niger XP w hodowlach wstrząsanych z odpadowym materiałem pofiltracyjnym (2% OMP) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 73

74 Aktywność CMCaz, FPaz, B-glukozydaz [U/ml] Aktywność ksylanaz [U/ml] Aktywność CMCaz, FPaz, B-glukozydaz [U/ml] Aktywność ksylanaz [U/ml] Omówienie wyników 3,00 8,00 2,50 2,00 6,00 1,50 4,00 1,00 0,50 2,00 0,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 35. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep A. niger XP w hodowlach wstrząsanych z odpadowym materiałem pofiltracyjnym (3% OMP) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 3,00 8,00 2,50 2,00 6,00 1,50 4,00 1,00 0,50 2,00 0,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 36. Dynamika biosyntezy zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez szczep A. niger XP w hodowlach wstrząsanych z odpadowym materiałem pofiltracyjnym (4% OMP) jako głównym źródłem węgla i energii i glukozą (0,25%); CMCazy, FPazy, ß-glukozydazy, ksylanazy. 74

75 Omówienie wyników Wpływ innych źródeł węgla na biosyntezę celulaz i ksylanaz w hodowlach wstrząsanych z udziałem grzybów strzępkowych T. hamatum C1 i A. niger XP Wykorzystywanie różnych odpadowych materiałów ligninocelulozowych jako induktorów biosyntezy celulaz i ksylanaz wynika z postępującego rozwoju przemysłu rolnospożywczego i poszukiwania nowych metod ich zagospodarowania. Większość komercyjnych preparatów celulolitycznych dostępnych na rynku produkowana jest z użyciem kosztownych chemicznych polimerów - pochodnych celulozy, takich jak np. karboksymetyloceluloza czy celuloza mikrokrystaliczna Avicel. W celu uzasadnienia przydatności badanej odpadowej biomasy roślinnej (OKK, CGF, OMP) jako induktora badanych enzymów, porównawczo przeprowadzono hodowle wstrząsane, gdzie główne źródło węgla stanowił powszechne wykorzystywane źródło węgla i induktor enzymów celulolitycznych - celuloza mikrokrystaliczna Avicel (2%). Podłoże dodatkowo uzupełniono wysłodkami buraczanymi (1%, induktor ksylanaz i celulaz) oraz glukozą (0,25%) dla zainicjowania wzrostu badanych szczepów. Szczep T. hamatum C1 w badanym podłożu najefektywniej syntetyzował ksylanazy, już w trzeciej dobie osiągnięto aktywność 1,69 U/ml i poziom tych enzymów wzrastał do 10 doby hodowli, osiągając maksymalną wartość 1,99 U/ml. Zawartość CMCaz i FPaz oznaczonych w płynie pohodowlanym w trakcie trwania hodowli zwiększała się do 10 doby i wyniosła odpowiednio 1,10 U/ml i 0,82 U/ml, i utrzymywała się na zbliżonym poziomie do końca hodowli. Maksymalną aktywność ß-glukozydaz zmierzono w 14 dobie (0,18 U/ml) (Rys. 37). Porównując omawiane wyniki z wartościami aktywności enzymów otrzymanymi w poprzednich etapach zaobserwowano, że odpadowe materiały ligninocelulozowe stanowiły dla szczepu C1 zdecydowanie efektywniejszy induktor ksylanaz, poziom ich aktywności był nawet 19-krotnie wyższy podczas hodowli z 4% OKK i glukozą (0,25%). Zmierzone wartości aktywności CMCaz były zbliżone, natomiast obecna w podłożu celuloza Avicel łącznie z wysłodkami wpłynęła korzystniej na biosyntezę FPaz (0,82 U/ml), ponieważ w hodowlach z OMP (2%), OKK (4%) i CGF (4%) zmierzono aktywność na poziomie odpowiednio 0,55U/ml, 0,36 U/ml oraz 0,19 U/ml. Podczas hodowli szczepu A. niger XP zanotowano wysoki poziom biosyntetyzowanych ß-glukozydaz. Najwyższą aktywność zmierzono w 5 dobie hodowli i wyniosła ona 1,78 U/ml. Szybki wzrost poziomu ksylanaz zaobserwowano pomiędzy 75

76 Aktywność [U/ml] Aktywność [U/ml] Omówienie wyników 0 a 5 dobą hodowli, w późniejszych dobach ich aktywność wzrastała znacznie wolniej, osiągając maksimum w 14 dobie (2,36 U/ml). Obecność zastosowanych induktorów nie wpłynęła korzystnie na biosyntezę CMCaz i FPaz, ich aktywność utrzymywała się na podobnym poziomie w trakcie trwania hodowli i maksymalnie wynosiła odpowiednio 0,45 U/ml i 0,28 U/ml (Rys. 38). 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 CMCazy FPazy B-glukozydazy Ksylanazy 0, Czas hodowli [doba] Rys. 37. Dynamika biosyntezy celulaz i ksylanaz w hodowli z udziałem T. hamatum C1 (2% Avicel + 1% wysłodki + 0,25% glukoza). 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 CMCazy FPazy B-glukozydazy Ksylanazy 0, Czas hodowli [doba] Rys. 38. Dynamika biosyntezy celulaz i ksylanaz w hodowli z udziałem A. niger XP (2% Avicel + 1% wysłodki + 0,25% glukoza). 76

77 Omówienie wyników Na Rysunku 39 zestawiono najwyższe aktywności badanych enzymów syntezowanych przez dwa szczepy grzybów strzępkowych. Największe różnice zaobserwowano w biosyntezie ß-glukozydaz, szczep A. niger XP był dziesięciokrotnie efektywniejszy. Z kolei szczep T. hamatum C1 wydajniej wykorzystywał zastosowane w podłożu induktory do produkcji pozostałych enzymów kompleksu celulolitycznego CMCaz i FPaz. A. niger XP T. hamatum C1 Ksylanazy B-glukozydazy FPazy CMCazy 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 Aktywność [U/ml] Rys. 39. Porównanie najwyższych aktywności celulaz i ksylanaz biosyntetyzowanych przez grzyby strzępkowe A. niger XP i T. hamatum C1 w trakcie hodowli wstrząsanej (2% Avicel + 1% wysłodki + 0,25% glukoza). W celu porównania przydatności badanych materiałów ligninocelulozowych z mieszaniną celulozy Avicel oraz wysłodków jako induktorów enzymów, na Rysunku 40 przedstawiono porównanie wartości aktywności celulaz i ksylanaz jakie odnotowano w 10 dobie hodowli szczepu A. niger XP z różnymi odpadami. Wybrano te właśnie warianty, ponieważ były to najefektywniejsze warunki dla biosyntezy badanych zewnątrzkomórkowych hydrolaz i będą one wykorzystywane w dalszej części niniejszej pracy. Zaprezentowane poniżej wyniki sugerują, że zastosowanie odpadowych materiałów ligninocelulozowych, szczególnie OKK i CGF, jest korzystniejsze ze względu na wydajniejszą biosyntezę w porównaniu z powszechnie stosowaną celulozą Avicel i wysłodkami. W płynach pohodowlanych zmierzono dwukrotnie wyższe poziomy aktywności CMCaz i FPaz, jednak zdecydowanie większą różnicę zaobserwowano w poziomie ksylanaz, których wartości aktywności przekraczały około 16-krotnie te oznaczone podczas hodowli z celulozą Avicel i wysłodkami. Należy także wziąć pod uwagę korzyści ekonomiczne 77

78 Omówienie wyników wynikające ze stosowania odpadowej biomasy roślinnej, ponieważ jest ona zdecydowanie tańszym źródłem węgla i energii w porównaniu do celulozy mikrokrystalicznej Avicel. 4% OKK 0,25% glu 38,02 4% CGF 0,25% glu 3% OMP 38,93 Ksylanazy B-glukozydazy FPazy CMCazy 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 Aktywność [U/ml] Rys. 40. Porównanie aktywności badanych hydrolaz zmierzonych w 10 dobie hodowli z udziałem A. niger XP z różnymi materiałami odpadowymi. 78

79 Omówienie wyników 5.2. Biosynteza celulaz i ksylanaz przez grzyby strzępkowe Trichoderma sp. i Aspergillus sp. w hodowlach w podłożu stałym Hodowle w podłożu stałym (solid state fermentation - SSF) są alternatywną metodą do hodowli wstrząsanych w produkcji m.in. enzymów degradujących celulozę i ksylan. Metody te są bardziej ekonomiczne ze względu na sposób ich prowadzenia umożliwiający ograniczenie nakładów energii. W celu porównania efektywności biosyntezy celulaz i ksylanaz prowadzono hodowle w podłożu stałym wykorzystując te same substraty, jakie zastosowano w hodowlach wstrząsanych, stanowiące główne źródło węgla i energii, a zarazem induktor pożądanych enzymów. Jako dodatkowe źródło węgla i energii użyto glukozę w stężeniu 0,25%. Hodowle prowadzono przez 14 dni, a w trakcie ich trwania badano aktywność CMCaz, FPaz, ß-glukozydaz i ksylanaz, ponadto określono ilość uwalnianych związków redukujących, w tym glukozy oraz poziom białka. Zmierzono także aktywność wody podłoża i jego wilgotność. Wartości aktywności enzymów wyrażono w U/g substratu oraz U/mg białka, a uzyskane wyniki zestawiono w Tabeli 7 i Tabeli 8. Hodowle SSF prowadzono z udziałem grzybów strzępkowych T. hamatum C1 oraz A. niger XP w trzech różnych podłożach (OKK, CGF, OMP) oba szczepy nie były zdolne do wzrostu na poekstrakcyjnym odpadzie kukurydzianym, a odpadowy materiał pofiltracyjny stanowił odpowiednie podłoże tylko dla szczepu A. niger XP. Jedynie odpadowe kaczany kukurydziane charakteryzowały się dobrą przydatnością w procesie biosyntezy celulaz i ksylanaz z udziałem obu badanych szczepów (Tab. 7, Tab. 8). Szczep A. niger XP produkował wszystkie enzymy z wyższą wydajnością w porównaniu do T. hamatum C1, szczególnie w przypadku ß-glukozydaz (analogicznie jak podczas hodowli wstrząsanych) i ksylanaz, aktywność była około 4-krotnie wyższa i wyniosła odpowiednio 6,13 U/g OKK oraz 63,68 U/g OKK (Tab. 7). W hodowli z udziałem szczepu C1 zmierzono wyższy poziom produktów degradacji wyrażonych jako uwolnione cukry redukujące, w tym glukozy, w obu przypadkach ilość tych związków zmniejszała się w trakcie trwania hodowli (Rys. 41, Rys. 42). Podczas procesu nie zaobserwowano znacznych różnic w zmierzonych wartościach aktywności wody podłoża oraz jego wilgotności, parametry te były na poziomie sprzyjającym prawidłowemu rozwojowi drobnoustrojów (Rys. 43). 79

80 Związki redukujące [mg/ml] Glukoza [mg/ml] Omówienie wyników Tabela 7. Dynamika biosyntezy celulaz i ksylanaz w hodowlach SSF z odpadowymi kaczanami kukurydzianymi jako głównym źródłem węgla (glukoza jako dodatkowe źródło węgla w stężeniu 0,25%). Aktywność Jednostka aktywności Doba hodowli A. niger XP CMCazy FPazy β- glukozydazy Ksylanazy U/g OKK 3,22 3,96 3,15 3,81 4,56 3,89 U/mg białka 0,29 0,34 0,27 0,31 0,34 0,30 U/g OKK 0,74 1,10 0,77 0,77 1,09 1,22 U/mg białka 0,07 0,09 0,07 0,06 0,08 0,10 U/g OKK 2,08 2,84 3,91 5,60 5,83 6,13 U/mg białka 0,19 0,24 0,34 0,45 0,44 0,48 U/g OKK 63,68 59,97 53,13 53,57 54,04 51,64 U/mg białka 5,68 5,12 4,56 4,33 4,09 4,04 T. hamatum C1 CMCazy FPazy β- glukozydazy Ksylanazy U/g OKK 2,16 2,67 3,04 2,94 2,59 2,83 U/mg białka 0,15 0,18 0,20 0,19 0,16 0,18 U/g OKK 0,21 0,18 0,51 0,96 0,97 0,99 U/mg białka 0,01 0,01 0,03 0,06 0,06 0,06 U/g OKK 0,00 1,60 0,27 0,30 0,20 0,19 U/mg białka 0,00 0,11 0,02 0,02 0,01 0,01 U/g OKK 15,53 14,42 12,04 11,11 12,34 9,88 U/mg białka 1,08 0,96 0,80 0,70 0,78 0,62 Związki redukujące Glukoza 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 41. Ilość uwalnianych związków redukujących oraz glukozy podczas hodowli w podłożu stałym z udziałem grzybów strzępkowych A. niger XP (OKK; 0,25% glu). 80

81 Aktywność wody Wilgotność [%] Związki redukujące [mg/ml] Glukoza [mg/ml] Omówienie wyników Związki redukujące Glukoza 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 42. Ilość uwalnianych związków redukujących oraz glukozy podczas hodowli w podłożu stałym z udziałem grzybów strzępkowych T. hamatum C1 (OKK; 0,25% glu). A. niger XP T. hamatum C1 A. niger XP T. hamatum C1 1,00 0,99 74,0 72,0 0,98 70,0 68,0 0,97 0,96 0,95 66,0 64,0 62,0 60, Czas hodowli [doba] Rys. 43. Aktywność wody i wilgotność podłoża (OKK) podczas hodowli w podłożu stałym z udziałem badanych grzybów strzępkowych ( aktywność wody, wilgotność). Spośród badanych grzybów strzępkowych, tylko szczep XP był zdolny do wzrostu na odpadowym materiale pofiltracyjnym. Najwyższe wartości wszystkich aktywności CMCaz, FPaz, ß-glukanaz i ksylanaz osiągnięto już w piątej dobie, na poziomie odpowiednio 3,43 U/g, 2,79 U/g, 0,97 U/g oraz 5,63 U/g (Tab. 8). Jednak przydatność OMP jako induktora enzymów w tym typie hodowli w porównaniu do substratu OKK była mniejsza, ze względu na niski poziom biosyntezy enzymów. Ilość produktów biodegradacji - uwolnionych cukrów 81

82 Związki redukujące [mg/ml] Glukoza [mg/ml] Omówienie wyników redukujących zmniejszała się od początku hodowli od wartości 3,71 mg/ml do 0,93 mg/ml w ostatniej dobie, w tym glukozy od 0,90 mg/ml do 0,11 mg/ml (Rys. 44). Wilgotność podłoża utrzymywała się na poziomie 66,3%-69,5%, natomiast aktywność wody podłoża mieściła się w zakresie 0,976-0,998 (Rys. 45). Tabela 8. Dynamika biosyntezy celulaz i ksylanaz w hodowlach SSF z odpadowym materiałem pofiltracyjnym jako głównym źródłem węgla (glukoza jako dodatkowe źródło węgla w stężeniu 0,25%). Aktywność Jednostka aktywności Doba hodowli A. niger XP CMCazy FPazy β- glukozydazy Ksylanazy U/g OMP 2,46 3,43 0,99 1,96 2,78 2,54 U/mg białka 0,43 0,71 0,20 0,46 0,64 0,64 U/g OMP 2,21 2,79 1,09 1,21 0,30 0,30 U/mg białka 0,39 0,58 0,22 0,29 0,07 0,08 U/g OMP 0,88 0,97 0,49 0,50 0,24 0,50 U/mg białka 0,15 0,20 0,10 0,12 0,06 0,13 U/g OMP 5,52 5,63 3,81 2,75 3,70 1,85 U/mg białka 0,97 1,17 0,79 0,65 0,85 0,47 T. hamatum C1 Brak wzrostu Związki redukujące Glukoza 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0, Czas hodowli [doba] Rys. 44. Ilość uwalnianych związków redukujących oraz glukozy podczas hodowli w podłożu stałym z udziałem grzybów strzępkowych A. niger XP (OMP; 0,25% glu). 82

83 Aktywność [U/ml] 12,74 39,02 Aktywność wody Wilgotność [%] Omówienie wyników A. niger XP A. niger XP 1,00 0, , ,97 0,96 0, Czas hodowli [doba] Rys. 45. Aktywność wody i wilgotność podłoża (OMP) podczas hodowli w podłożu stałym z udziałem badanych grzybów strzępkowych ( aktywność wody, wilgotność). Ze względów ekonomicznych bardziej zasadne wydaje się stosowanie hodowli w podłożu stałym, jednak jak pokazało powyższe doświadczenie, nie wszystkie substraty są odpowiednie do prowadzenia tego typu procesu. Poniżej zestawiono najwyższe aktywności poszczególnych enzymów, jakie uzyskano w trakcie prowadzonych hodowli. Porównanie obu metod pokazało, że biosynteza enzymów była efektywniejsza podczas hodowli wstrząsanych (Rys Rys. 51). W celach porównawczych poziomy aktywności enzymatycznych przedstawiono w U/ml oraz wyrażono jako aktywność właściwą. hodowla SSF hodowla wstrząsana 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 CMCazy FPazy ß-glukozydazy ksylanazy Rys. 46. Porównanie maksymalnych aktywności otrzymanych podczas hodowli w podłożu stałym i hodowli wstrząsanych z udziałem A. niger XP z odpadowymi kaczanami kukurydzianymi. 83

84 Aktywność [U/ml] 38,83 Aktywność [U/ml] Omówienie wyników hodowla SSF hodowla wstrząsana 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 CMCazy FPazy ß-glukozydazy ksylanazy Rys. 47. Porównanie maksymalnych aktywności otrzymanych podczas hodowli w podłożu stałym i hodowli wstrząsanych z udziałem T. hamatum C1 z odpadowymi kaczanami kukurydzianymi. hodowla SSF hodowla wstrząsana 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 CMCazy FPazy ß-glukozydazy ksylanazy Rys. 48. Porównanie maksymalnych aktywności otrzymanych podczas hodowli w podłożu stałym i hodowli wstrząsanych z udziałem A. niger XP z odpadowym materiałem pofiltracyjnym. 84

85 11,41 Aktywność właściwa [U/mg białka] 5,68 39,91 Aktywność właściwa [U/mg białka] Omówienie wyników hodowla SSF hodowla wstrząsana 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 CMCazy FPazy ß-glukozydazy ksylanazy Rys. 49. Porównanie maksymalnych aktywności właściwych otrzymanych podczas hodowli w podłożu stałym i hodowli wstrząsanych z udziałem A. niger XP z odpadowymi kaczanami kukurydzianymi. hodowla SSF hodowla wstrząsana 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 CMCazy FPazy ß-glukozydazy ksylanazy Rys. 50. Porównanie maksymalnych aktywności otrzymanych podczas hodowli w podłożu stałym i hodowli wstrząsanych z udziałem T. hamatum C1 z odpadowymi kaczanami kukurydzianymi. 85

86 Aktywność właściwa [U/mg białka] Omówienie wyników hodowla SSF hodowla wstrząsana 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 CMCazy FPazy ß-glukozydazy ksylanazy Rys. 51. Porównanie maksymalnych aktywności właściwych otrzymanych podczas hodowli w podłożu stałym i hodowli wstrząsanych z udziałem A. niger XP z odpadowym materiałem pofiltracyjnym. 86