Ocena częstości występowania przeciwciał przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato wśród mieszkańców Jaworzna

Transkrypt

1 mgr Barbara Koleżyńska Ocena częstości występowania przeciwciał przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato wśród mieszkańców Jaworzna Rozprawa na stopień doktora nauk medycznych Promotor Prof. dr hab. n. biol. Krzysztof Solarz Promotor pomocniczy Dr n. med. Józef Kurek Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Zakład Parazytologii Sosnowiec 2018

2 Doktorant: Barbara Koleżyńska SP ZOZ Szpital Wielospecjalistyczny w Jaworznie ul. Chełmońskiego Jaworzno bkolezynska@szpital.jaworzno.pl

3 Pragnę złożyć serdeczne podziękowania mojemu Promotorowi Panu Prof. dr hab. Krzysztofowi Solarzowi za wszelką pomoc udzieloną w trakcie przygotowywania pracy doktorskiej, cierpliwość i wyrozumiałość. Pragnę podziękować Panu dr n. med. Józefowi Kurkowi - Dyrektorowi Szpitala Wielospecjalistycznego w Jaworznie a równocześnie Promotorowi pomocniczemu za nieustane wsparcie, motywację oraz wiarę we mnie. Specjalne podziękowania składam mojej Rodzinie, która zachęcała mnie do pracy i zawsze we mnie wierzyła.

4 Spis treści Wykaz skrótów... 6 Wykaz tabel i rycin... 7 I Wstęp...10 I 1 Znaczenie medyczne i epidemiologiczne kleszczy (Acari: Ixodida) I 2 Biologia i fizjologia kleszczy w aspekcie ich roli w transmisji chorób I 3 Kleszcz pospolity (Ixodes ricinus) jako główny wektor boreliozy I 4 Borelioza z Lyme - krętkowica kleszczowa I 5 Charakterystyka Borrelia burgdorferi I 6 Aktualna sytuacja epidemiologiczna boreliozy z Lyme w Polsce i na terenie województwa śląskiego I 7 Diagnostyka i leczenie boreliozy II Założenia i cele pracy...30 III Materiał i metody...33 IV Wyniki i ich omówienie...38 IV 1 Wyniki badań ankietowych IV 2 Wyniki badań immunologicznych i 2015 rok IV 3 Analiza statystyczna IV 3.1 Częstość wystąpienia pokłucia przez kleszcze w badanej grupie respondentów IV 3.2 Teren, na którym doszło do inwazji kleszcza IV 3.3 Czas ekspozycji od momentu inwazji do usunięcia kleszcza IV 3.4 Częstość występowania objawów w miejscu ukłucia IV 3.5 Częstość występowania dodatnich, ujemnych i wątpliwych wyników w klasie IgG i IgM testu ELISA IV 3.6 Częstość występowania dodatnich, ujemnych, wątpliwych oraz granicznych wyników w klasie IgG i IgM testu Western-blot... 56

5 IV 3.7 Rozkład wyników w podziale na pozytywne i negatywne w teście ELISA IV 3.8 Ocena zgodności wyników testu ELISA oraz testu Western-blot IV 3.9 Rozkład odpowiedzi w podziale na pozytywne / negatywne zgodnie z testem Western-blot IV 3.10 Czynniki ryzyka wystąpienia wyniku pozytywnego w teście ELISA IV 3.11 Czynniki ryzyka wystąpienia wyniku pozytywnego w teście Western-blot V Dyskusja...78 VI Wnioski...85 VII Literatura...86 Streszczenie Abstract

6 Wykaz skrótów EUCALB European Concerted Action on Lyme Borreliosis h - godzina IgG - immunoglobulina klasy G IgM - immunoglobulina klasy M mm milimetr NIZP - PZH - Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego - Państwowy Zakład Higieny OUN - ośrodkowy układ nerwowy POZ - Podstawowa Opieka Zdrowotna PPIS - Państwowy Powiatowy Inspektor Sanitarny PSSE Powiatowa Stacja Sanitarno-Epidemiologiczna PTEiLChZ - Polskie Towarzystwo Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych SOR - Szpitalny Oddział Ratunkowy SP ZOZ - Samodzielny Publiczny Zakład Opieki Zdrowotnej U/ml - Units Per Millilitre - jednostek na mililitr UM - Urząd Miejski 6

7 Wykaz tabel i rycin Tabela I. Ocena zgodności testu ELISA i Western-blot jako laboratoryjnych metod diagnozowania boreliozy z Lyme Tabela II. Ocena zgodności wyników oznaczania immunoglobulin IgM i IgG testem ELISA Tabela III. Ocena zgodności wyników oznaczania immunoglobulin IgM i IgG testem Western-blot Tabela IV. Wyniki (istotne statystycznie) jednoczynnikowej analizy regresji logistycznej wystąpienia wyników pozytywnych w teście ELISA z uwzględnieniem zmiennych opartych na wynikach badań ankietowych Tabela V. Istotne statystycznie wyniki jednoczynnikowej analizy regresji logistycznej wystąpienia wyników pozytywnych w teście Western-blot z uwzględnieniem zmiennych opartych na wynikach badań ankietowych Ryc. 1. Liczba zachorowań na boreliozę w Polsce w latach [95] Ryc. 2. Liczba zachorowań na boreliozę na terenie miasta Jaworzna w latach Ryc. 3. Liczba zachorowań na boreliozę w roku 2015 w Polsce z podziałem na województwa [98] Ryc. 4. Wyniki badań ankietowych dotyczące kontaktu z kleszczem wśród osób badanych w roku Ryc. 5. Okres czasu pomiędzy inwazją kleszcza a badaniem przesiewowym, jaki wskazali respondenci w roku Ryc. 6. Teren, na którym doszło do pokłucia przez kleszcza. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku Ryc. 7. Czas ekspozycji od momentu inwazji do momentu usunięcia kleszcza. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku Ryc. 8. Najczęstsze objawy występujące po inwazji kleszcza. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku Ryc. 9. Występowanie subiektywnych objawów grypopodobnych po pokłuciu przez kleszcza. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku Ryc. 10. Rozpoznanie boreliozy w okresie poprzedzającym przystąpienie do badania przesiewowego. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku

8 Ryc. 11. Zastosowanie antybiotykoterapii po pokłuciu przez kleszcze. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku Ryc. 12. Wyniki badań ankietowych dotyczące kontaktu z kleszczem wśród osób badanych w roku Ryc. 13. Teren, na którym doszło do pokłucia przez kleszcze. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku Ryc. 14. Czas ekspozycji od momentu inwazji do momentu usunięcia kleszcza. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku Ryc. 15. Rozpoznanie boreliozy w okresie poprzedzającym przystąpienie do badania przesiewowego. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku Ryc. 16. Najczęstsze objawy występujące po inwazji kleszcza. Wyniki badań ankietowych w roku Ryc. 17. Występowanie subiektywnych objawów grypopodobnych po pokłuciu przez kleszcza. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku Ryc. 18. Zastosowanie antybiotykoterapii po inwazji kleszcza. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku Ryc. 19. Wyniki badania poziomu przeciwciał przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato w teście ELISA wśród wszystkich próbek krwi pobranych od osób badanych w roku Ryc. 20. Wyniki badania poziomu przeciwciał przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato testem Western-blot w próbkach surowicy krwi osób badanych w roku 2013, u których uzyskano dodatni lub wątpliwy wynik w teście ELISA Ryc. 21. Wyniki testu ELISA w klasach IgG i IgM uzyskane w próbkach surowicy krwi osób badanych w roku Ryc. 22. Wyniki testu Western-blot w klasach IgG i IgM uzyskane w próbkach surowicy krwi osób badanych w roku Ryc. 23. Częstość przypadków pokłucia przez kleszcza w ogólnej liczbie badanych kobiet i mężczyzn mieszkańców Jaworzna z uwzględnieniem inwazji pojedynczych i mnogich Ryc. 24. Teren, na którym doszło do inwazji kleszcza, według wszystkich badanych respondentów Ryc. 25. Czas ekspozycji od momentu inwazji do usunięcia kleszcza w ogólnej liczbie badanych mieszkańców Jaworzna Ryc. 26. Częstość występowania poszczególnych rodzajów objawów w ogólnej liczbie badanych mieszkańców Jaworzna Ryc. 27. Częstość występowania dodatnich, ujemnych i wątpliwych wyników w klasach IgG i IgM testu ELISA w ogólnej liczbie badanych mieszkańców Jaworzna

9 Ryc. 28. Częstość występowania dodatnich, ujemnych, wątpliwych oraz granicznych wyników w klasach IgG i IgM testu Western Blot w ogólnej liczbie badanych mieszkańców Jaworzna Ryc. 29. Częstość przypadków inwazji kleszcza w grupie osób z wynikami pozytywnymi lub negatywnymi testu ELISA Ryc. 30. Udział procentowy pojedynczych i mnogich przypadków inwazji kleszcza w grupie osób z wynikami pozytywnymi lub negatywnymi testu ELISA Ryc. 31. Teren, na którym doszło do inwazji kleszcza w grupie osób z wynikami pozytywnymi lub negatywnymi testu ELISA Ryc. 32. Czas ekspozycji od momentu inwazji do usunięcia kleszcza w grupie osób z wynikami pozytywnymi lub negatywnymi testu ELISA Ryc. 33. Częstość występowania poszczególnych rodzajów objawów w grupie osób z wynikami pozytywnymi lub negatywnymi testu ELISA Ryc. 34. Częstość występowania boreliozy w przeszłości w grupie osób z wynikami pozytywnymi lub negatywnymi testu ELISA Ryc. 35. Częstość przypadków zastosowania antybiotykoterapii w grupie osób z wynikami pozytywnymi lub negatywnymi testu ELISA Ryc. 36. Częstość występowania objawów grypopodobnych w grupie osób z wynikami pozytywnymi i negatywnymi testu ELISA Ryc. 37. Częstość przypadków inwazji kleszcza w grupie osób z wynikami pozytywnymi i negatywnymi testu Western-blot Ryc. 38. Rozkład procentowy liczby przypadków inwazji kleszcza w grupie osób z wynikami pozytywnymi lub negatywnymi testu Western-blot Ryc. 39. Teren, na którym doszło do inwazji kleszcza w grupie osób z wynikami pozytywnymi lub negatywnymi testu Western-blot Ryc. 40. Czas ekspozycji od momentu inwazji do usunięcia kleszcza w grupie osób wynikami pozytywnymi lub negatywnymi testu Western-blot Ryc. 41. Częstość występowania poszczególnych rodzajów objawów w grupie osób z wynikami pozytywnymi lub negatywnymi testu Western-blot Ryc. 42. Częstość przypadków występowania boreliozy w przeszłości w grupie osób z wynikami pozytywnymi lub negatywnymi testu Western-blot Ryc. 43. Częstość przypadków zastosowania antybiotykoterapii w grupie osób z wynikami pozytywnymi lub negatywnymi testu Western-blot Ryc. 44. Częstość przypadków wystąpienia objawów grypopodobnych w grupie osób z wynikami pozytywnymi lub negatywnymi testu Western-blot

10 I Wstęp Kleszcze to duże roztocze, tworzące odrębny rząd, dzielony obecnie na dwa podrzędy: Argasina (kleszcze miękkie, obrzeżki) i Ixodina (kleszcze właściwe). Żerowanie obrzeżków na ludziach może wywoływać różnego rodzaju reakcje alergiczne, począwszy od obrzęku, rumienia, świądu, gorączki, osłabienia, bólu poprzez objawy zatrucia, jak nudności, wymioty, biegunka, aż do zaburzeń akcji serca i oddechu prowadzących do omdleń lub stanów zagrożenia życia i zdrowia. Kleszcze właściwe mają natomiast większe znaczenie jako wektory i rezerwuary patogenów [1, 2] Znaczenie kleszczy jako rezerwuarów chorób transmisyjnych groźnych dla człowieka i zwierząt jest ogromne [3-12]. Najczęstsze w Polsce choroby odkleszczowe to kleszczowe zapalenie mózgu, borelioza z Lyme, ludzka anaplazmoza granulocytarna, gorączki plamiste, tularemia, gorączka Q, babeszjoza i inne. Pasożytowanie na zwierzętach hodowlanych jest powodem strat materialnych poprzez uszkodzenie skór, obniżenie wydajności produkcji mięsa i przetworów mlecznych czy też szerzenia się chorób wektorowych [13-28]. W pracy skupiono się na boreliozie gdyż na przestrzeni ostatnich kilku lat obserwuje się wzrost liczby zachorowań na tę chorobę niemal we wszystkich województwach w skali całego kraju, a diagnostyka boreliozy nastręcza trudności zarówno lekarzom jak i diagnostom laboratoryjnym. Zachorowania są wynikiem narażenia na kontakt z kleszczem zainfekowanym jednym lub wieloma genogatunkami krętka Borrelia burgdorferi. Ponad dwadzieścia zidentyfikowanych aktualnie genogatunków krętka Borrelia burgdorferi sensu lato, brak standaryzacji testów diagnostycznych, a przede wszystkim różnorodność objawów manifestowanych przez pacjentów utrudnia postawienie właściwej diagnozy i wdrożenie odpowiedniego leczenia zapobiegającego przejściu zakażenia w stan chroniczny, w którym objawy mogą się pojawić ze strony niemal wszystkich narządów i układów. W literaturze naukowej publikowane są wyniki badań immunologicznych wykonane u pacjentów hospitalizowanych w oddziałach chorób zakaźnych lub oddziałach neurologicznych, u których w wyniku prowadzonej diagnostyki rozpoznano boreliozę lub neuroboreliozę. Badania przesiewowe w kierunku boreliozy są prowadzone w grupach zawodowo narażonych na pokłucie 10

11 przez kleszcze, takich jak leśnicy, rolnicy oraz u dawców krwi [29, 30] Brak jest ciągle szeroko zakrojonych badań prowadzonych na populacji osób, mieszkańców województwa śląskiego, które nie są zawodowo narażone na kontakt z kleszczem i ewentualną infekcję patogenem chorobotwórczym, natomiast w wyniku swojej codziennej aktywności mogą zostać zakażeni krętkiem Borrelia burgdorferi oraz mogą u nich rozwinąć się objawy choroby. Niniejsza praca jest próbą wypełnienia tej luki. Nie bez znaczenia jest również odniesienie uzyskanych wyników badań laboratoryjnych i ankietowych do danych epidemiologicznych dotyczących najwyższej w województwie śląskim zapadalności na boreliozę wśród mieszkańców miasta Jaworzna. I 1 Znaczenie medyczne i epidemiologiczne kleszczy (Acari: Ixodida) Znaczenie medyczne kleszczy wynika z bezpośrednich skutków ich żerowania na ciele żywiciela oraz z ich roli, jako rezerwuarów i przenosicieli różnych patogenów. Właściwości anatomiczne, fizjologiczne i ekologiczne kleszczy powodują, że są ogniwem łańcucha epidemiologicznego chorób transmisyjnych, które podtrzymuje naturalne ogniska tych chorób [31-39]. Kleszcze cechuje długowieczność, możliwość zmiany żywiciela podczas cyklu rozwojowego, długi czas żerowania połączony z dużą objętością pobieranego pokarmu (krwi), wprowadzenie do organizmu żywiciela dużej ilości śliny, zdolność przekazywania patogenów wśród żywicieli oraz wśród populacji samych kleszczy [16, 40-45]. Przekazywanie patogenów w obrębie populacji kleszczy odbywa się na kilka sposobów: transowarialnie, transstadialnie, transspermalnie, współbiesiadnie lub hiperpasożytniczo [9, 12, 40, 41, 46, 47]. Kiedy patogeny przenikają z ciała samicy do wnętrza rozwijającego się oocytu, bez zaburzenia normalnego rozwoju zarodka, a larwa rodzi się zakażona - mamy do czynienia z przekazem transowarialnym. Przeżywanie patogenów w okresach przekształcenia i linienia kolejnych stadiów stawonoga to przekaz transstadialny. Przekaz płciowy lub inaczej transspermalny ma miejsce podczas przekazania spermatoforu przez zakażone samce wolnym od patogenów samicom. Przekaz współbiesiadny występuje przy żerowaniu dwóch kleszczy w bliskiej odległości. Gdy futeraliki cementowe utworzone wokół narządów gębowych stykają się ze sobą u dwóch kleszczy wówczas patogeny mogą przenikać od zakażonego kleszcza do 11

12 niezakażonego. Przekaz kanibalistyczny, czyli hiperpasożytniczy ma miejsce podczas żerowania niezakażonego kleszcza (samca) na zakażonym kleszczu (samicy). Zdecydowanie największe znaczenie medyczne w Polsce ma kleszcz pospolity (Ixodes ricinus), będący rezerwuarem i przenosicielem takich patogenów jak Flavivirus odpowiedzialny za kleszczowe zapalenie mózgu, krętek Borrelia burgdorferi sensu lato wywołujący boreliozę z Lyme, riketsja Anaplasma phagocytophilum odpowiedzialna za erlichiozę i anaplazmozę, riketsja Coxiella burneti wywołującą gorączkę Q, pałeczka Francisella tularensis powodująca tularemię oraz kilka gatunków pierwotniaków z rodzaju Babesia i pierwotniak Toxoplasma gonidii, które są odpowiedzialne za występowanie odpowiednio babeszjozy i toksoplazmozy [3, 6, 9, 16-21, 23-26, 29, 45, 48, 50-53]. Kleszcze gatunku Ixodes ricinus odpowiadają za transmisję jednego z dwóch podtypów kleszczowego zapalenia mózgu występujących w Europie, czyli tzw. zachodniego, wywołującego środkowoeuropejskie kleszczowe zapalenie mózgu, natomiast kleszcze gatunku Ixodes persulcatus za transmisję podtypu wschodniego, odpowiedzialnego za wywoływanie ciężko przebiegającego rosyjskiego wiosennoletniego tajgowego zapalenia mózgu. Krążenie wirusa w przyrodzie zapewniają żywiciele rezerwuarowi, którymi są kręgowce i kleszcze, oraz wektory, jakimi są kleszcze, a także warunki środowiskowe. Ważnym ogniwem w krążeniu wirusa kleszczowego zapalenia mózgu w Polsce są także kleszcze gryzonie (Ixodes trianguliceps). Uważa się, że kleszcze te są głównymi wektorami i rezerwuarami wirusa, podtrzymującymi jego krążenie w populacjach drobnych ssaków, głównie gryzoni. Kleszcze gryzonie odgrywają zatem olbrzymią rolę w utrzymywaniu ognisk kleszczowego zapalenia mózgu w przyrodzie [47, 54]. Kleszczowe zapalenie mózgu to choroba wirusowa dotycząca układu nerwowego, szczególnie ośrodkowego, wywoływane przez wirusa z rodzaju Flavivirus, z rodziny Flaviviridae. Do zakażenia człowieka dochodzi przez kontakt z zakażonym kleszczem, przez spożywanie niepasteryzowanego mleka pochodzącego od zakażonych zwierząt czy kontakt wziewny z pyłem zawierającym zakażoną ślinę i kał kleszczy [55]. Po wniknięciu do organizmu, wirus namnaża się w komórkach skóry, drogą limfatyczną dostaje się do węzłów chłonnych, a następnie do śledziony i szpiku kostnego, podlegając przy tym ciągłej replikacji, aż w końcu przenika do ośrodkowego układu nerwowego. Choroba przebiega etapowo. W pierwszej fazie obecność wirusa we krwi powoduje wiremię, potem następuje okres inkubacji wynoszący 2-28 dni, z niecharakterystycznymi 12

13 objawami, takimi jak złe samopoczucie, bóle stawowo-mięśniowe, nieżyt górnych dróg oddechowych, objawy dyspeptyczne, wymioty, temperatura powyżej 38 C. Następnie występuje kilkudniowy okres bez gorączki, który w 70-80% przypadków kończy się zdrowieniem. U około 30% chorych dochodzi do kilkudniowej remisji, a następnie występuje kilkudniowa gorączka sięgająca do 40 C z bólami głowy, wymiotami, utratą świadomości, zapaleniem mózgu i opon mózgowo-rdzeniowych Diagnostyka opiera się na wywiadzie epidemiologicznym, badaniu przedmiotowym oraz badaniu płynu mózgowo-rdzeniowego. Brak jest swoistego leczenia, terapia głównie opiera się na postępowaniu objawowym, prowadzącym do obniżenia ciśnienia wewnątrzczaszkowego. Najważniejsza jest profilaktyka oraz aktywne uodpornienie za pomocą szczepień ochronnych [20]. Kleszcze zakażone riketsją Anaplasma phagocytophilum wywołują ludzką anaplazmozę granulocytarną (human granulocytic anaplasmosis - HGA) [3, 9, 14, 15, 28, 56]. Objawy są mało charakterystyczne, a przebieg choroby zróżnicowany od postaci bezobjawowych do bardzo ciężkich, szczególnie u osób z obniżoną odpornością. Głównymi symptomami są wysoka temperatura, bóle głowy i brzucha, bóle stawowo-mięśniowe, pocenie się, kaszel, nudności, biegunka oraz zapalenie płuc. W ciężkich przypadkach może rozwinąć się niewydolność nerek lub mogą wystąpić objawy neurologiczne [57, 58]. Pierwotniaki z rodzaju Babesia (B. microti, B. divergens, B. venatorum, B. duncani) przenoszone przez jedynego wektora i żywiciela ostatecznego, jakim są kleszcze, wywołują babeszjozę, nazywaną inaczej piroplazmozą lub malarią północy. Nazwa ta została nadana ze względu na objawy choroby, które przypominają objawy malaryczne, czyli wysoka temperatura, zlewne poty, dreszcze, bóle głowy i mięśni, bóle brzucha, nudności, wymioty, powiększenie wątroby i śledziony, niedokrwistość hemolityczna, a w ciężkich przypadkach, szczególnie u osób w podeszłym wieku lub z obniżoną odpornością, niewydolność nerek i obrzęk płuc, do zgonu włącznie. U ludzi jest rzadko rozpoznawana, znacznie częściej u zwierząt domowych np. psów. Jednakże z uwagi na fakt, że u osób immunokompetentnych może być bezobjawowa, osoby z utajoną postacią choroby są zagrożeniem, jako potencjalni dawcy krwi [28, 57, 59-62]. Bezpośrednie następstwa żerowania kleszczy na organizm żywiciela to uszkodzenia skóry, osłabienie i wpływ na normalny rozwój, uczulenie i zatruwanie organizmu, a nawet śmierć [63, 64]. Bezpośrednio obserwowane u ludzi skutki to 13

14 zmiany skórne w miejscach wkłucia i żerowania samic, czyli na nogach, pośladkach, w pachwinach, na brzuchu oraz (szczególnie u dzieci) za uszami, na linii włosów, na szyi [64]. Najniebezpieczniejszym dla ludzi następstwem żerowania kleszczy jest paraliż kleszczowy, najczęściej powodowany przez kontakt z kleszczami Dermacentor andersoni, Dermacentor variabilis, Amblyomma americanum w Ameryce Północnej oraz Ixodes holocyclus w Australii. Okres inkubacji paraliżu kleszczowego wynosi od 5 do 7 dni. Choroba może skończyć się śpiączką i zgonem w 2-3 dobie od wystąpienia objawów. Jedynym skutecznym sposobem leczenia jest jak najszybsze usunięcie kleszcza, przed rozwinięciem się fazy krytycznej. Jad, obecny w organizmie, jest prawdopodobnie szybko wydalany lub rozkładany i nie dochodzi do rozwoju śmiertelnych objawów, a pacjent szybko powraca do zdrowia. Na terenie Polski nie odnotowano przypadków paraliżu kleszczowego i nie należy go mylić z porażeniem nerwów w przebiegu zakażeń wirusowych lub bakteryjnych przenoszonych przez kleszcze [65-67]. Jednakże w związku z migracją ludzi do obszarów bytowania różnych gatunków kleszczy, nie można wykluczyć wystąpienia zachorowania na terenach innych, aniżeli uznane za endemiczne dla tej choroby. Do kleszczy z fauny polskiej, mających duże znaczenie medyczne, zalicza się opisane poniżej gatunki należące do trzech rodzin kleszczy: 1. Obrzeżkowate (Argasidae), a wśród nich należy wymienić obrzeżka gołębiego (Argas reflexus) i obrzeżka polskiego (Argas polonicus). Bytują one w gniazdach gołębich, na strychach, wieżach kościołów. Mogą przechodzić do mieszkań i szczególnie nocą atakować śpiących ludzi, ale również strażaków i hejnalistów ze względu na specyfikę ich pracy zawodowej. Argas reflexus powoduje najsilniejsze zmiany skórne w wyniku bezpośredniego żerowania. Wywołuje szereg reakcji uczuleniowych, zmian miejscowych pod postacią obrzęku i rumienia, pęcherze i obrzęki twarzy, zapalenie naczyń limfatycznych. W skrajnych przypadkach daje objawy ogólnoustrojowe do wstrząsu anafilaktycznego włącznie. 2. Kleszcze właściwe z rodziny Ixodidae Kleszcz pospolity (Ixodes ricinus) z rodziny Ixodidae atakuje gady, ptaki, ssaki i człowieka. Na człowieku mogą żerować wszystkie aktywne stadia tego kleszcza. Ma największe znaczenie w transmisji chorobotwórczych 14

15 mikroorganizmów (wirusów, bakterii i pierwotniaków) wywołujących choroby wektorowe. Kleszcz gryzoni (Ixodes trianguliceps). Występuje w całej Polsce i jest pasożytem drobnych ssaków. Przenosi wirusa kleszczowego zapalenia mózgu, riketsje Anaplasma phagocytophilum, a na Wyspach Brytyjskich pierwotniaka Babesia microti. Kleszcz jeżowy (Ixodes hexagonus) atakuje jeże i inne ssaki drapieżne w tym psy i koty. Jest wektorem wirusa kleszczowego zapalenia mózgu, krętków Borrelia burgdorferi s. l. oraz piroplazm Babesia canis i Babesia divergens. Transmituje również riketsje Anaplasma phagocytophilum. Kleszcz ten stanowi zagrożenie dla ludzi z powodu zawlekania go na tereny osiedli przez psy i koty. Kleszcz moczarowy (Ixodes apronophorus) - pasożyt gniazdowo-norowy ssaków i ptaków, odpowiedzialny za transmisję pałeczki tularemii (Francisella tularensis). 3. Kleszcze właściwe z rodziny Amblyommidae kleszcz łąkowy (Dermacentor reticulatus) żerujący na ssakach, odpowiedzialny za transmisję riketsji Rickettsia slovaca oraz pierwotniaków Babesia canis, powodujących babeszjozę psów [13]. I 2 Biologia i fizjologia kleszczy w aspekcie ich roli w transmisji chorób Kleszcze (Ixodida) są zewnętrznymi, czasowymi pasożytami kręgowców lądowych, a wybrane gatunki pasożytują również na ludziach, powodując negatywne następstwa medyczne [2, 48, 68-73]. Najczęściej występującym w Polsce gatunkiem kleszcza właściwego, o największym znaczeniu medycznym, jest kleszcz pospolity - Ixodes ricinus [74-77]. Długość ciała kleszczy (Ixodida) waha się od ułamka milimetra do około 30 mm i jest zależna od stopnia najedzenia. Ciało głodnych okazów jest spłaszczone grzbietobrzusznie, w zarysie podłużnie owalne, lekko zwężone z przodu. U kleszczy, podobnie jak u innych roztoczy, doszło do zaniku segmentacji 15

16 ciała, a ciało składa się z idiosomy (ciała właściwego) oraz gnatosomy, obejmującej narządy gębowe (chelicery i pedipalpy) umożliwiające inwazję na żywicielu. Ponadto charakterystycznymi cechami kleszczy są: (1) zróżnicowany pod względem uzębienia hypostom (element gnatosomy), będący głównym narządem przyczepu kleszcza do żywiciela, (2) organ Hallera, parzysty organ zmysłowy umiejscowiony na stopach I pary nóg, (3) tarczki oddechowe (perytremy), zlokalizowane za biodrami ostatniej pary odnóży krocznych, oraz płytki i tarczki wzmacniające pokrywy ciała (szczególnie tarczka grzbietowa zwana scutum) [25, 40, 46-48, 77, 78]. Do zapłodnienia dochodzi u wszystkich kleszczy podobnie. Może ono mieć miejsce przed lub po żerowaniu, poza żywicielem, w środowisku zewnętrznym żywiciela (gniazdo, nora) lub może zachodzić na żywicielu [68]. Cykl rozwojowy kleszczy obejmuje: jaja, larwy, nimfy i stadia dorosłe, samice i samce, o wyraźnym dymorfizmie płciowym. W rozwoju każdego stadium, poza jajem, wyróżnia się dwie fazy życiowe: pasożytniczą i niepasożytniczą. Podczas pierwszej fazy kleszcz pobiera pokarm w postaci krwi żywiciela. W drugiej fazie nie ma ścisłego związku z żywicielem [48]. U kleszczy występują cztery typy cykli rozwojowych: wielożywicielowy u Argasidae, trójżywicielowy, dwużywicielowy i jednożywicielowy u Ixodina. W pierwszym przypadku rozwijający się obrzeżek pasożytuje na więcej niż trzech żywicielach. W rozwoju trójżywicielowym poszczególne stadia (larwy, nimfy, postaci dorosłe) pasożytują na innym organizmie i z uwagi na zmianę żywiciela oraz możliwość transmisji różnych patogenów mają największe znaczenie chorobotwórcze. W rozwoju dwużywicielowym larwa i nimfa pasożytuje na jednym osobniku, natomiast w rozwoju jednożywicielowym kleszcz poprzez wszystkie stadia rozwojowe pasożytuje na jednym organizmie żywicielskim. Żywicielami mogą być różne lub te same gatunki kręgowców lądowych gdyż kleszcze dokonują wyboru różnych żywicieli. Niektóre żerują tylko i wyłącznie na jednym gatunku zwierząt, inne na kilku gatunkach lub na określonej grupie zwierząt (ptaki, gady, ssaki). Poszczególne stadia rozwojowe kleszczy właściwych mogą żerować na odmiennych gatunkach zwierząt oraz mogą wybierać gospodarzy mniejszych, średnich (larwy i nimfy) lub większych (kleszcze dorosłe). Ixodida żyją na lądzie, w różnych typach środowisk, od obszarów tropikalnych do podbiegunowych, od poziomu morza aż do strefy lodowcowej wysokich gór. Bytują zarówno w środowiskach wilgotnych, jak i pustynnych. Gatunki z podrzędu Argasina są bardziej ciepłolubne aniżeli Ixodina. 16

17 Liczebność kleszczy jest zmienna nawet na obszarze kilku metrów, przez co mówi się o rozmieszczeniu mozaikowym. Na wybór miejsca bytowania wpływają warunki klimatyczne i mikroklimatyczne danego siedliska, cechy podłoża, szata roślinna, obecność żywiciela. Wyróżnia się trzy grupy ekologiczne kleszczy polskich uwarunkowane sposobem pozyskiwania żywiciela: gniazdowo-norowe (jamy i nory ssaków, ptasie gniazda), pozagniazdowe (powierzchnia gleby, warstwa ściółki, wśród roślinności), norowo-pozagniazdowe (formy młodociane żyją na ssakach, atakują przy wejściach i wyjściach z nor, formy dorosłe na powierzchni gleby i wśród roślinności). Obrzeżki (Argasidae), występujące w Polsce to gatunki wielożywicielowe. Posiadają określoną aktywność dobową atakowania żywiciela, szczyt aktywności przypada na środek lata, bytują w siedliskach średnio wilgotnych lub suchych. Znane z Polski Ixodina to gatunki trójżywicielowe, aktywnie poszukują żywicieli w ciepłej porze roku, z dwoma szczytami aktywności - wiosennym i letniojesiennym [25, 40, 48, 54, 77]. Badania nad aktywnością kleszczy w poszczególnych porach roku prowadzone na terenie województw śląskiego, małopolskiego, świętokrzyskiego i podkarpackiego potwierdziły największą liczebność i aktywność kleszczy Ixodes ricinus w miesiącach kwiecień, maj i początek czerwca. Kleszcze, dzięki organom zmysłów są przystosowane do pasożytniczego trybu życia. Na stopie pierwszej pary nóg umiejscowiony jest wspomniany już organ Hallera, główny organ zmysłowy, dzięki któremu kleszcz potrafi zlokalizować i wykryć potencjalnego żywiciela. Organ ten jest uważany za narząd węchu, ponadto umożliwia odbieranie podniet zmysłowych, mechanicznych, chemicznych, jest wrażliwy na bodźce temperaturowe i stopień wilgotności. Grupa szczecinek zmysłowych położonych na wierzchołku IV członu pedipalp tworzy organ głaszczkowy. Odpowiada on za percepcję smaku, bodźców mechanicznych, chemicznych, związanych z procesami płciowymi kleszczy. Organ cheliceralny jest zlokalizowany na wierzchołku palców chelicer. Przypuszczalnie kontroluje proces ssania pokarmu przez kleszcza, podczas wrzynania się chelicer w ciało ofiary odbiera bodźce regulujące czynność mięśni cheliceralnych. Kleszcze mają rozwinięte oczy albo jedynie fotoreceptory, czułe na zmianę intensywności nasilenia światła. Oczy występujące u niektórych kleszczy (np. Dermacentor reticulatus) są płaskie lub wypukłe, wystające ponad powierzchnię tarczki grzbietowej. W zależności od gatunku, kleszcze mogą mieć jedną lub dwie pary oczu. Układ pokarmowy kleszczy 17

18 jest przystosowany do ich pasożytniczego trybu życia. Występuje hypertrofia jelita środkowego, które posiada silne rozczłonkowanie na boczne uchyłki oraz ślinianek, które wypełniają większą część jamy ciała. Podczas żerowania w organizmie kleszczy dochodzi do dużych zmian morfologiczno-anatomicznych i fizjologicznych. U nimf i adulti większości przedstawicieli rodziny Argasidae żerowanie ma charakter czasowy. Obrzeżki żerują intensywnie i krótko. Postacie dorosłe żerują kilka razy, nimfy mogą żerować dwukrotnie. Larwy gatunków Argasidae pasożytujące na ptakach i nietoperzach mogą żerować kilka dni (3-10). Większość larw i niektóre nimfy Argasidae i Ixodidae sensu lato żerują wolno, w dłuższym odcinku czasu, do syta, w każdym stadium rozwojowym. Wchłonięcie pożywienia powoduje szereg nieodwracalnych zmian morfologiczno-anatomicznych i fizjologicznych. W przypadku kleszcza Ixodes ricinus larwy żerują 2-5 dób, nimfy 2-7 dób, samice 6-11 dób. W czasie długotrwałego żerowania na żywicielu larwy, nimfy i samice kleszcza pospolitego wchłaniają krew, limfę i rozpuszczone tkanki, w stosunkowo dużych ilościach. Przyswojony i zmagazynowany pokarm jest silnie zagęszczony, nadmiar wody zostaje usunięty przez gruczoły ślinowe, a część pobranego pokarmu w postaci niezmienionej przepływa przez przewód pokarmowy kleszcza i zostaje wydalony z fekaliami [25, 34, 40, 46-48, 77]. I 3 Kleszcz pospolity (Ixodes ricinus) jako główny wektor boreliozy Kleszcze z rodzaju Ixodes odgrywają główną rolę w transmisji Borrelia burgdorferi sensu lato, w Europie i Polsce głównym wektorem boreliozy jest kleszcz pospolity (I. ricinus) [32, 34, 41, 44, 75, 79-84]. Miejscem bytowania kleszcza pospolitego są rejony o wysokim poziomie wilgotności np. lasy liściaste i mieszane, mokre pastwiska czy tereny leśne na obrzeżach miast. Wielkość kleszcza jest zróżnicowana w zależności od płci i stadium rozwojowego. Samica ma długość od 2,9-3,5 mm aż do 12 mm po żerowaniu [11]. Ciemnobrązowa tarczka grzbietowa (scutum) pokrywa około 1/3 powierzchni grzbietowej i kontrastuje z czerwoną powłoką chitynową reszty idiosomy. Samiec ma długość ciała od 1,5-2,6 mm, a tarczka grzbietowa pokrywa całą grzbietową powierzchnię idiosomy. Dymorfizm płciowy umożliwia rozróżnienie samca od samicy. Nimfa i larwa, podobnie jak samica, mają krótką tarczkę grzbietową, są znacznie od niej mniejsze oraz 18

19 pozbawione otworu płciowego. Nimfa ma długość od 1-7 mm w zależności od stopnia wysycenia ciała krwią żywiciela. Larwa ma długość od 0,5-0,8 mm i trzy pary odnóży. Aktywność dorosłych postaci kleszcza pospolitego na terenie Polski przypada na okres od wczesnej wiosny, gdy temperatura osiąga 5 C, czyli od kwietnia do początków listopada. Obserwuje się ponadto dwa szczyty aktywności kleszczy, w maju i we wrześniu [85, 86]. Nimfy są aktywne przy temperaturze powyżej 8 C, w okresach takich jak postaci dorosłe. Larwy pasożytują w miesiącach ciepłych, od maja do września, rzadziej niż samice, na żywiciela wybierają człowieka. Żywicielem dla tych kleszczy są zwierzęta różnych gatunków. Ixodes ricinus jest pasożytem poliksenicznym i euryksenicznym, a krąg jego żywicieli obejmuje około 150 gatunków ssaków i ptaków oraz 20 gatunków gadów. Samice wybierają i atakują większe ssaki, larwy i nimfy żerują na ptakach oraz małych i średnich ssakach, a nawet gadach. Człowiek jest zagrożony przez nimfy i samice, rzadziej larwy [87]. Poza aktywnością sezonową u kleszczy występuje aktywność dobowa, co ma bezpośredni związek z wahaniami wilgotności w ciągu doby [86]. Na terenie Polski największa aktywność wiosenna przypada na godziny ranne (8:00-9:00) i nocne (23:00-24:00), a w okresie letnim i wczesno-jesiennym wzrost aktywności występuje dodatkowo w godzinach od 18:00-19:00. Aktywność dzienna jest również odmienna w zależności od formy rozwojowej. Związek pomiędzy aktywnością kleszczy a zmiennymi warunkami klimatycznymi i porą roku ma ogromne znaczenie z epidemiologicznego punktu widzenia w aspekcie dynamiki zachorowań na choroby odkleszczowe. Krótka zima i wczesna ciepła wiosna sprzyjają jednoczasowej aktywności larw i nimf oraz umożliwiają żerowanie na tych samych żywicielach prowadząc do wzrostu odsetka zakażonych kleszczy. Skutkuje to zwiększoną zachorowalnością ludzi na choroby odkleszczowe [28, 51, 88]. Szybkie rozprzestrzenianie się i adoptowanie kleszcza pospolitego w ekosystemie wynika z jego właściwości biologicznych a także braku swoistego żywiciela. W Polsce najlepszym siedliskiem dla Ixodes ricinus są lasy mieszane o wilgotnym podłożu, zamieszkałe przez potencjalnych żywicieli, ale kleszcze te nie stronią również od lasów liściastych bogatych w warstwę krzewów i runa. Ixodes ricinus występuje na szlakach turystycznych oraz wokół zbiorników wodnych, ale również coraz częściej na terenach miejskich i podmiejskich (w tym w ogrodach, na prywatnych posesjach). Choroby przenoszone przez kleszcze stanowią zarówno 19

20 w Polsce jak i w Europie poważne zagrożenie zdrowotne, a kleszcz pospolity uznawany jest za groźnego pasożyta człowieka. Oprócz bezpośrednich skutków żerowania stanowi niebezpieczeństwo dla ludzi i zwierząt poprzez transmisję patogenów chorobotwórczych. Żerując, kleszcz ten przebywa od kilku do kilkunastu dni na żywicielu [25, 40, 47], a długi czas jego żerowania jest możliwy dzięki szczególnemu przystosowaniu jakim jest rozregulowanie mechanizmów odpowiedzi immunologicznej żywiciela. Wpływanie na układ immunologiczny żywiciela upośledzające jego funkcje, szczególnie w miejscu żerowania, ułatwia transmisję zakażenia i szybki rozwój choroby, uzależnionej od przekazanego patogenu chorobotwórczego [19]. I 4 Borelioza z Lyme - krętkowica kleszczowa Pierwsze podejrzenia lekarzy, że pokłucie przez kleszcze może mieć związek z występowaniem pewnych objawów pojawiły się na początku XX wieku. Szwedzki dermatolog Arvid Afzelius w roku 1909 wskazał na zależność między występowaniem rumienia wędrującego a pokłuciem przez kleszcze. Wyniki zaprezentował na spotkaniu Szwedzkiego Towarzystwa Dermatologii. Trzynaście lat później, neurologiczną postać boreliozy opisało niezależnie od siebie, dwóch francuskich neurologów Charles Garin oraz Antoine Bujadoux. Dopiero w połowie lat siedemdziesiątych XX wieku borelioza została rozpoznana w Stanach Zjednoczonych w okolicy miasta Lyme w stanie Connecticut. Prowadzone badania doprowadziły do identyfikacji bakterii odpowiedzialnej za powstanie choroby. Willy Burgdorfer wyizolował w roku 1982 z uchyłków jelita kleszcza jeleniego (Ixodes dammini, syn. Ixodes scapularis) krętki, które potem nazwano jego imieniem, oraz udowodnił związek pomiędzy ukłuciem tego kleszcza a występowaniem choroby. Nazwa rodzajowa bakterii Borrelia pochodzi od nazwiska strasburskiego bakteriologa Amedee Borrela, który odkrył tę bakterię w 1905 roku [89]. Borelioza z Lyme jest najczęściej spotykaną na półkuli północnej, chorobą zakaźną przenoszoną przez kleszcze. Patogenem jest krętek B. burgdorferi, pierwotnie występujący u kleszczy z rodziny Ixodidae [13, 32, 41, 44, 80, 81, 83]. Pierwsze przypadki zachorowań na boreliozę w Polsce opisano na Pomorzu Zachodnim w 1987 roku [68], natomiast w związku z występowaniem kleszczy na 20

21 gęsto zalesionych obszarach to właśnie w tych rejonach jest najwięcej zakażeń, szczególnie w okresie lata i jesieni. Ryzyko odkleszczowego zakażenia krętkami jest uzależnione od terenu, na którym miała miejsce inwazja kleszcza, od jego stadium rozwojowego oraz czasu inwazji. Do zakażenia człowieka dochodzi w wyniku ekspozycji, przez ślinę lub z wymiocinami kleszcza, bez względu na stadium rozwojowe, w którym znajduje się kleszcz. Po wypełnieniu jelita krwią żywiciela, bakterie namnażają się w jelicie kleszcza. Następnie migrują do ślinianek i zostają wstrzyknięte do rany żywiciela. Do zakażenia krętkiem wymagany jest minimum 24 godzinny kontakt z kleszczem. Ryzyko zakażenia wzrasta proporcjonalnie do czasu przebywania kleszcza w skórze, a 100% zakażenie występuje w trzeciej dobie [13]. Jak już wspomniano, grupa Borrelia burgdorferi sensu lato obejmuje obecnie ponad 20 gatunków, ale borelioza z Lyme powodowana jest głównie przez trzy genogatunki chorobotwórcze dające różne objawy kliniczne. Borrelia garinii (występująca w Azji i Europie) powoduje zaburzenia ze strony układu nerwowego. Borrelia burgdorferii sensu stricto (występująca w Stanach Zjednoczonych i Europie) objawy reumatologiczne, natomiast Borrelia afzelii (występująca w Azji i Europie) przewlekłe zanikowe zapalenie skóry. Głównym nosicielem Borrelia burgdorferi s. l. w Europie jest często występujący w lasach kleszcz Ixodes ricinus z rodziny Ixodidae ale również do zakażenia może dojść podczas inwazji pcheł, komarów i innych muchówek krwiopijnych [13, 32, 45, 83, 90-93]. Do zakażenia najczęściej dochodzi podczas ukłucia kleszcza lub wtarcia poprzez uszkodzoną skórę jego wydalin lub fragmentów ciała. Infekcja ma miejsce zazwyczaj po godzinach od momentu, kiedy kleszcz rozpoczął żerowanie na żywicielu. Przebieg fazowy zakażenia ma związek z różnymi etapami odpowiedzi immunologicznej na antygeny krętków. W fazie wczesnej oprócz łagodnego odczynu zapalnego w postaci rumienia obserwowanego u około 70% pacjentów pomiędzy 3 a 30 dniem po zakażeniu występuje powiększenie węzłów chłonnych oraz nacieki limfocytarne. W tej fazie drobnoustroje przemieszczają się w organizmie oraz wiążą się z receptorami zlokalizowanymi w tkankach i podścielisku międzykomórkowym. Objawy choroby ze strony różnych narządów i układów pojawiają się, gdy krętki dotrą z krwią lub chłonką do serca, stawów czy ośrodkowego układu nerwowego. U znacznego odsetka osób nieleczonych (60-70%) dochodzi w tym okresie do zapalenia stawów, które u około 10% przechodzi w postać przewlekłą. Objawy neurologiczne manifestują się 21

22 w drugim stadium infekcji. Występują uporczywe bóle głowy bez cech infekcji w płynie mózgowo-rdzeniowym, porażenia nerwów czaszkowych (szczególnie nerwu twarzowego), zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, niedosłuch lub utrata słuchu, uszkodzenia narządu wzroku oraz zmiany kardiologiczne jak zapalenie mięśnia sercowego, osierdzia czy kardiomiopatia zastoinowa. Faza późna może ujawnić się po miesiącu lub latach po ukłuciu kleszcza. Zmiany chorobowe dotyczą układu stawowo-mięśniowego, nerwowego i przewlekłych zmian skórnych [68]. Do tej pory wyróżniono trzy stadia choroby: stadium I - objaw rumienia wędrującego, stadium II - wczesne objawy kliniczne wraz z rozprzestrzenianiem się patogenu, stadium III - występowanie późnych objawów choroby. Nie jest to jednak klasyfikacja adekwatna, ponieważ kolejne stadia nakładają się na siebie. Obecnie, najlepiej rozróżnić można jedynie najwcześniejsze i najpóźniejsze stadium choroby. To pierwsze odpowiada stadium I / II, a drugie - stadium III. Późna faza choroby wiąże się z poważnymi objawami klinicznymi i bardzo trudne staje się leczenie antybiotykowe. Z tego względu niespotykanie ważna jest wczesna diagnostyka [13]. I 5 Charakterystyka Borrelia burgdorferi Boreliozę wywołuje spiralna bakteria gram ujemna z rodzaju Borrelia, która wymaga do życia warunków beztlenowych [94]. Bakterię Borrelia burgdorferi cechuje polimorfizm. Występuje ona, jako krętek, forma L (bez ściany komórkowej) oraz cysta. Posiada również możliwość przekształcenia się w ciągu kilku godzin z jednej formy w drugą, czyli cechuje ją duża zmienność. Forma, jaką przyjmuje jest zależna m.in. od czynników środowiskowych, w jakich w danym momencie bakteria się znajduje. Bakterie występują w tkance łącznej: ścięgnach, skórze, naczyniach krwionośnych; mięśniach, tkance nerwowej. Identyfikowano ją we wzgórzu, korzeniach grzbietowych rdzenia kręgowego, miazdze zębowej czy gałkach ocznych. Różnorodność form bakterii utrudnia leczenie. Każda z form jest wrażliwa na inny rodzaj antybiotyku. Objawy choroby są uzależnione od danego gatunku krętka. 22

23 B. burgdorferi powoduje objawy ze strony stawów, B. garinii daje objawy ze strony układu nerwowego, B. afzelii powoduje przewlekłe symptomy skórne [57]. I 6 Aktualna sytuacja epidemiologiczna boreliozy z Lyme w Polsce i na terenie województwa śląskiego Ustawa z dnia 5 grudnia 2008 r. o zapobieganiu oraz zwalczaniu zakażeń i chorób zakaźnych u ludzi (Dz.U Nr 234, poz.1570 z późn. zm.) nakłada na lekarzy obowiązek zgłaszania przypadków podejrzenia, rozpoznania lub zgonu z powodu chorób zakaźnych, właściwemu państwowemu inspektorowi sanitarnemu. Zgłoszenia dokonuje się niezwłocznie, nie później jednak niż w ciągu 24 godzin od chwili powzięcia podejrzenia lub rozpoznania zakażenia, choroby zakaźnej lub zgonu z powodu zakażenia lub choroby zakaźnej. Obowiązek taki dotyczy również jednostki chorobowej, jaką jest borelioza. Uzyskane w ten sposób informacje pozwalają na prowadzenie oceny sytuacji epidemiologicznej w kraju. Według informacji o zachorowaniach na choroby zakaźne i zatruciach publikowanych przez Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego - Państwowy Zakład Higieny liczba zachorowań na boreliozę z Lyme systematycznie wzrasta, co przedstawiono na Rycinie 1. Uważa się, że liczba zarejestrowanych przypadków boreliozy w Polsce nie jest dokładna, co może wynikać z problemów z rozpoznawaniem choroby (a ze względu na rozciągnięte w czasie niespecyficzne objawy wiele przypadków może być zgłaszanych z opóźnieniem lub wcale), błędnej diagnozy, fałszywie ujemnych wyników testów, braku objawów u chorego lub lekceważenia ich. 23

24 Liczba zachorowań Lata Ryc. 1. Liczba zachorowań na boreliozę w Polsce w latach [95]. Do Państwowego Powiatowego Inspektora Sanitarnego w Jaworznie (miasto liczy mieszkańców) [96] w roku 2011 napłynęły 74 zgłoszenia zachorowania na boreliozę, w roku 2012 zarejestrowano 73 zgłoszenia, w roku zgłoszeń, w roku , w roku , natomiast w roku zgłoszeń (Ryc. 2) Liczba zachorowań Lata 2016 Ryc. 2. Liczba zachorowań na boreliozę na terenie miasta Jaworzna w latach

25 Zachorowania na boreliozę w Polsce cechuje trend wzrostowy, obserwowany na przestrzeni ostatnich lat. W roku 2015 zanotowano przypadków przy zapadalności 35,4/100 tys. mieszkańców gdy przed rokiem 2013 liczba zgłoszeń nie przekraczała (z wyjątkiem 2009 r.). Największą zapadalność obserwuje się w województwach: śląskim, podlaskim, małopolskim, mazowieckim i warmińsko- mazurskim [96]. Ilość zachorowań na boreliozę w poszczególnych województwach w roku 2015 prezentuje Rycina Liczba zachorowań Województwa Ryc. 3. Liczba zachorowań na boreliozę w roku 2015 w Polsce z podziałem na województwa [98]. Warto podkreślić, żee borelioza z Lyme jest w Polsce najczęstszą chorobą zawodową w sekcji rolnictwa, leśnictwa i łowiectwa oraz najczęstszą zawodową chorobą zakaźną [99]. 25

26 I 7 Diagnostyka i leczenie boreliozy Diagnoza wczesnej fazy choroby oparta jest na objawach klinicznych, np. rumieniu wędrującym (erythema migrans), jednak objaw ten nie występuje u 20-40% pacjentów. Objawy późniejszego stadium są bardzo różnorodne. Dlatego właśnie testy serologiczne stanowią ważne narzędzie diagnozy choroby. Chociaż najpewniejszym dowodem zakażenia jest hodowla bakterii z krwi, płynu mózgowordzeniowego lub wycinka skóry, testy takie nie kwalifikują się do użytku rutynowego ze względu na długi czas wykonania i niską czułość. Krętek Borrelia ma bardzo złożoną strukturę antygenową. Antygeny te należą do białek związanych z błoną, a ich występowanie zależy od stadium choroby. Im dłużej trwa infekcja, tym większy jest zakres specyficzności antygenów. Bardzo niewielu chorych na boreliozę z Lyme prezentuje pełną gamę objawów choroby po ukłuciu kleszcza. W przypadku infekcji krętkiem Borrelia i zachorowania na boreliozę, wachlarz objawów może być bardzo szeroki i sugerować inne rozpoznanie. Diagnostyka serologiczna nie może się opierać na jednym, bardzo czułym, ale nieswoistym teście immunoenzymatycznym ELISA [100]. W przypadku wszystkich objawów choroby, z wyjątkiem pierwszych zmian skórnych pod postacią rumienia wędrującego [101, 102], Polskie Towarzystwo Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych zaleca schemat diagnostyczny oparty na wykonaniu badania specyficznych przeciwciał przeciwko Borrelia burgdorferi s. l. klasy IgG i IgM, przy pomocy technik immunoenzymatycznych (ELISA) po upływie 3 do 4 tygodni po ekspozycji na kleszcza w celu uniknięcia wyniku fałszywie ujemnego [29], następnie zweryfikowanie dodatnich i niejednoznacznych wyników przy pomocy testu Western-blot, w celu potwierdzenia specyficzności oznaczonych przeciwciał [103]. W testach Western-blot, stosowanych na terenie Europy wykorzystuje się następujące lipoproteiny: p100 - białko ściany komórkowej; prawdopodobnie związane z rzęską, pochodzące od B. afzelii, VIsE - (Variable like segence Expressed), lipoproteina powierzchniowa, białko fuzyjne, reprezentujące immunodominanty epitopowe VIsE różnych gatunków Borrelia, p58 - antygen nieokreślony, swoisty dla Borrelia, pochodzący od B. garinii, 26

27 p41- białko flagelina (rzęskowe) - pochodzące od B. burgdorferi sensu stricte, p39 - antygen BmpA (Borrelial membrane protein A) pochodzący od B. afzelii, OspA (Outer surface protein A) białko pochodzące od B. afzelii, OspC (Outer sutface protein C) białko pochodzące od Borrelia sensu stricto, B. afzelii, B. garinii i B. spielmanii, p18 - inaczej Decorin binding protein A (DbpA), białko powierzchniowe pochodzące od Borrelia sensu stricto, B. afzelii, B. garinii i B. spielmanii [13]. Lipoproteiny B. burgdorferi umożliwiają krętkom penetrację tkanek ssaków i przypuszczalnie pozwalają im dostosować się i przetrwać w zróżnicowanych środowiskach stawonogów i ssaków [13]. Uzyskany, w toku diagnostyki laboratoryjnej, wynik zawsze musi korelować ze stanem klinicznym pacjenta, a ocena zastosowanego leczenia powinna współgrać z dynamiką miana przeciwciał. Protokół diagnostyczny, zalecany przez towarzystwa naukowe w kraju i za granicą, polega na badaniu przesiewowym metodą pośrednią przy użyciu czułego, ale mało swoistego testu ELISA, a następnie wykonanie testu potwierdzenia (Western-blot) w przypadku uzyskania wyników dodatnich lub wątpliwych. Test ELISA nie daje podstawy do rozpoznania boreliozy, ale ukierunkowuje dalszą diagnostykę i eliminuje przypadki niebędące boreliozą. Pozwala na rozróżnienie klas immunoglobulin w obrębie swoistych przeciwciał, co ma znaczenie w określeniu fazy zakażenia. Wynik negatywny nie zawsze może stanowić o braku zakażenia, gdyż badanie może być wykonywane przed upływem dwóch tygodni od kontaktu z czynnikiem zakaźnym. Wynik wątpliwy lub dodatni oznacza prawdopodobieństwo zakażenia B. burgdorferi i wymaga pogłębienia diagnostyki i nie powinien być wydany pacjentowi dopóki diagnostyka nie będzie kompletna. Test Western-blot jest swoistą mapą złożoną z antygenów bakteryjnych. Na pasku diagnostycznym jest umieszczony ekstrakt z pełnego spektrum antygenów B. burgdorferi rozdzielony elektroforetycznie. W Europie i Azji trudności w tej metodzie nastręcza obecność trzech gatunków B. burgdorferi i duża zmienność antygenowa tych gatunków. W Europie zaleca się stosowanie testu Western-blot z użyciem gatunku B. afzelii, jako najbardziej czułego [13,104]. Europejskie Stowarzyszenie ds. Walki z Boreliozą 27

28 (European Union Concerted Action on Lyme Boreliosis EUCALB) zaleca stosowanie następujących kryteriów diagnostycznych: Western-blot w klasie IgM, dla B. afzelii - obecność, co najmniej jednego pasma spośród: p39, OspC, p17, p41, dla B. garinii - obecność, co najmniej jednego pasma spośród: p39, OspC, p41, Western- blot w klasie IgG, dla B. garinii - obecność, co najmniej jednego pasma spośród p83/100, p39, p30, OspC, p21, p17. [104] Prawidłowe rozpoznanie boreliozy uzależnione jest od zastosowanej metody diagnostycznej oraz interpretacji wyników ściśle związanej z obrazem klinicznym zakażenia [101,105]. Pomimo postępów w badaniach nad boreliozą właściwe rozpoznanie choroby jest trudne. Nadrozpoznawalność prowadzi do wdrożenia niepotrzebnego leczenia, a w pacjencie utrwala poczucie choroby aż do wystąpienia reakcji depresyjnych włącznie [13]. Leczenie boreliozy jest problematyczne ze względu na właściwości samego krętka oraz trudności diagnostyczne, które opisano powyżej. Panują dwa nurty w leczeniu polegające na skracaniu lub wydłużaniu terapii antybiotykowej. Najmniej kontrowersji wzbudza sposób leczenia w przypadku wystąpienia erythema migrans. Rutynowo stosowanymi antybiotykami, w takim przypadku, są doksycyklina i amoksycylina. U osób nadwrażliwych na antybiotyki beta-laktamowe lub u których istnieją przeciwwskazania do ich stosowania zaleca się azytromycynę. W przypadku neuroboreliozy obwodowej z zajęciem lub bez zajęcia ośrodkowego układu nerwowego Amerykańska Akademia Neurologii (AAN) rekomenduje włączenie penicyliny, ceftriaksonu, cefotaksimu, doksycykliny, a ewentualnie, jako leczenie alternatywne podanie amoksycyliny i cefuroksymu. Przeciwwskazaniem do podawania doksycykliny jest ciąża i okres karmienia piersią, nie stosuje się jej także u dzieci poniżej 12 roku życia. Rekomendacje International Lyme and Associated Diseases Society (ILADS) różnią się od AAN rodzajem stosowanych antybiotyków, czasem trwania terapii, zastosowaniem większych dawek, leczeniem kilkoma antybiotykami, drogą podania. W Polsce uznanym 28

29 standardem jest postępowanie lecznicze wg wytycznych Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych. Należy zaakcentować, że najlepszym sposobem uniknięcia zakażenia jest profilaktyka polegająca na jak najszybszym usunięciu kleszcza ze skóry [106, 107]. 29

30 II Założenia i cele pracy Aktualnie zwraca się coraz większą uwagę na udział owadów, pajęczaków w tym roztoczy, w transmisji chorób prowadzących do dużych uszczerbków na zdrowiu lub powodujących niezdolność do wykonywania dotychczasowej pracy, prowadzenia aktywnego trybu życia, czy w skrajnych przypadkach do śmierci. Borelioza należy do chorób zakaźnych, wektorowych, przenoszonych na organizm ludzki m. in. przez kleszcze, które są głównymi wektorami choroby. Od kilku lat systematycznie zwiększa się liczba zachorowań na choroby odkleszczowe, co znajduje odzwierciedlenie w raportach Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego - Państwowego Zakładu Higieny. Ponadto diagnostyka boreliozy nastręcza wielu trudności zarówno diagnostom laboratoryjnym jak i lekarzom. Z uwagi na wzrost liczby zachorowań na boreliozę na terenie miasta Jaworzna Wydział Zdrowia Urzędu Miejskiego w Jaworznie wraz z Państwowym Powiatowym Inspektorem Sanitarnym zwrócili uwagę na potrzebę monitorowania zakażeń odkleszczowych u swoich mieszkańców. W tym celu od roku 2012 na terenie miasta Jaworzna prowadzone są bezpłatne badania przesiewowe w kierunku boreliozy skierowane właśnie do tej grupy osób. Badania finansowane są przez Urząd Miejski. Od roku 2013 dodatnie i wątpliwe wyniki uzyskane w teście ELISA są potwierdzane testem Western-blot. Aktualnie uważa się cały obszar Polski za teren endemiczny dla boreliozy. Jaworzno, pomimo dużego stopnia zurbanizowania i uprzemysłowienia jest ośrodkiem o dużych walorach przyrodniczych. Według danych statystycznych 74,3% powierzchni Jaworzna zajmują tereny zielone, z czego 34,25% stanowią użytki rolne, a 40% leśne. Niewiele ponad 20% to tereny zabudowane i zurbanizowane, wśród których są prawdziwe enklawy zieleni w postaci parków. Lasy państwowe, niepaństwowe i gminne w poszczególnych dzielnicach zajmują 50 kilometrów kwadratowych i są często odwiedzane przez rowerzystów, a 6 szlaków pieszych o długości 125 kilometrów zachęca do aktywności amatorów pieszych wędrówek. Miejskimi atrakcjami są również zbiorniki wodne, np. Sosina, Tarka, Zalew Łęg, Koparki oraz kompleksy leśne takie jak Zespół Przyrodniczo-Krajobrazowy Sadowa Góra, Park Gródek, Góra Wielkanoc, Dobra-Wilkoszyn, rezerwat przyrody Dolina 30

31 Żabnik, gdzie znajdują się rzadkie gatunki roślin chronionych. Ukształtowanie terenu i bliskość przyrody sprawiają, że mieszkańcy często i chętnie korzystają z form rekreacji, ale równocześnie są narażeni na kontakt z wektorami groźnych chorób, bardzo często z kleszczami pospolitymi. Badania prowadzone na terenie województwa śląskiego w populacji kleszczy wskazują na wysoki odsetek zakażonych bądź zarażonych kleszczy [79], stąd nie jest zaskoczeniem fakt, iż u coraz większej grupy osób poddawanej badaniom uzyskuje się potwierdzenie infekcji krętkiem Borrelia burgdorferi. Warto również zasygnalizować, iż w badaniach ankietowych prowadzonych równolegle z badaniami laboratoryjnymi, ankietowani często podają, jako miejsce narażenia na pokłucie przez kleszcze, nie las, lecz najbliższe otoczenie domu czy ogródek działkowy. Wypoczynek w kompleksach typowo leśnych nie jest już warunkiem koniecznym dla kontaktu z kleszczem. Diagnostyka różnicowa w przypadku podejrzenia infekcji krętkiem Borrelia, potwierdzona dwustopniowo, ma kluczowe znaczenie przy podejmowaniu decyzji leczniczych, szczególnie o konieczności zastosowania właściwej antybiotykoterapii przez odpowiedni okres czasu. Ponadto wzrost liczby zachorowań wśród mieszkańców miasta Jaworzna, którzy wskazują teren miasta, jako miejsce kontaktu z kleszczem potwierdza wyniki prowadzonych badań faunistycznych na populacji kleszczy zebranych z terenu Jaworzna. Z badań prowadzonych przez Solarza i wsp. [ ] oraz w laboratorium Wojewódzkiej Stacji Sanitarno-Epidemiologicznej w Katowicach na kleszczach zebranych z terenu zbiorników wodnych oraz dostarczanych przez mieszkańców do WSSE wynika, że odsetek zakażonych kleszczy jest wysoki, co stanowi realne zagrożenie dla mieszkańców Jaworzna, a miasto można uznać za teren o podwyższonym ryzyku dla tej choroby [116,117]. W pracy poddano analizie badania wykonane w latach 2013 i 2015 z uwagi na dużą grupę osób biorących udział w badaniach przesiewowych oraz zastosowanie po raz pierwszy dwustopniowego protokołu diagnostycznego, zgodnego z wytycznymi Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych, w zakresie diagnostyki boreliozy. Cele niniejszej pracy to: 1. ocena częstości występowania przeciwciał przeciwko Borrelia bugdorferi sensu lato u mieszkańców Jaworzna przy pomocy testu immunoenzymatycznego ELISA; 31

32 2. ocena częstości występowania przeciwciał przeciwko Borrelia bugdorferi sensu lato u mieszkańców Jaworzna przy pomocy testu Western-blot; 3. wykrycie zależności między wynikami uzyskanymi przy pomocy obydwu testów, z podziałem na klasy IgM i IgG; 4. wykazanie zależności pomiędzy zastosowaniem antybiotykoterapii po inwazji kleszcza a poziomem przeciwciał przeciwko Borellia burgdorferi sensu lato. 32

33 III Materiał i metody W niniejszej pracy podjęto się analizy badań przesiewowych w kierunku występowania przeciwciał przeciwko krętkom Borrelia burgdorferi u mieszkańców miasta Jaworzna, którzy w wyniku codziennej normalnej aktywności realizowanej w otoczeniu przyrody zostali narażeni na pokłucie przez kleszcze. Wyniki badań laboratoryjnych prowadzono w oparciu o dwuetapową diagnostykę przy użyciu testów ELISA i Western-Blot. Badania prowadzono w latach 2013 i Objęto nimi grupę 704 osób, przyjmując za warunek udziału w badaniu zgodę oraz fakt zameldowania na terenie miasta Jaworzna. Wyniki dodatnie lub wątpliwe uzyskane w teście ELISA zostały potwierdzone testem Western-Blot. Badania zostały w całości sfinansowane przez Urząd Miejski w Jaworznie, natomiast wykonane w Laboratorium Szpitala Wielospecjalistycznego w Jaworznie. Na prowadzenie badań uzyskano zgodę komisji bioetycznej - Uchwała nr 2/2013 Uczelnianej Komisji Bioetycznej ds. Badań Naukowych przy Akademii Wychowania Fizycznego im. Jerzego Kukuczki w Katowicach z dnia 21 listopada 2013 roku w sprawie opinii o projekcie eksperymentu medycznego. Na wykorzystanie wyników badań do celów naukowych uzyskano zgodę Dyrektora Szpitala. Badaniami zostali objęci mieszkańcy miasta Jaworzna korzystający z akcji badań przesiewowych w kierunku boreliozy finansowanej przez Urząd Miasta Jaworzna w ramach akcji profilaktyki i promocji zdrowia. Badania odbyły się w SP ZOZ Szpitalu Wielospecjalistycznym w Jaworznie. Grupę badaną stanowiły 704 osoby (kobiety, mężczyźni oraz dzieci), które zamieszkują teren miasta Jaworzna. Przed badaniem każda z osób wypełniła ankietę dotyczącą czasu, miejsca i rodzaju ekspozycji na ukłucie przez kleszcze, czasu przebywania kleszcza w skórze oraz objawów chorobowych występujących bezpośrednio po ukłuciu lub w odstępie czasowym jednakże kojarzonym z pokłuciem przez kleszcze. Zebrano informacje o ewentualnie zastosowanym leczeniu, szczególnie antybiotykoterapii po inwazji. Kryteria włączenia do badania: 1. Udokumentowane zameldowanie na terenie miasta Jaworzna. 2. Zgoda na udział w badaniu. 33

34 Kryteria wykluczenia z badania: 1. Miejsce zameldowania poza miastem Jaworzno 2. Brak zgody na udział w badaniu. Każda z 704 osób zgłaszająca się do Samodzielnego Publicznego Zakładu Opieki Zdrowotnej (dalej SP ZOZ) Szpitala Wielospecjalistycznego w Jaworznie celem wzięcia udziału w prowadzonym badaniu przesiewowym przedstawiła dokument potwierdzający miejsce zameldowania na terenie Jaworzna. Wśród osób, które wyraziły chęć udziału w badaniu skriningowym przeprowadzono ankietę dotyczącą narażenia na pokłucie przez kleszcze. Jako osoba odpowiedzialna, z ramienia Szpitala, za przygotowanie i poprowadzenie akcji, opracowałam w 2013 roku ankietę, która została pozytywnie zaakceptowana przez pracowników Wydziału Zdrowia Urzędu Miejskiego w Jaworznie będącego płatnikiem badań. Autorska ankieta składała się z trzech części: dane osobowe (płeć, wiek, zawód), wywiad epidemiologiczny dotyczący ekspozycji na kleszcze oraz deklarowane objawy chorobowe, ich umiejscowienie oraz stopień nasilenia. Respondenci przystępowali do badań po otrzymaniu pełnej informacji o celu i metodyce badania. Odpowiadając na ankietę należało podać następujące informacje: czy doszło do kontaktu z kleszczem, a jeśli tak to czy było to jednokrotne czy wielokrotne pokłucie; datę ostatniego pokłucia przez kleszcze; teren, na którym doszło do pokłucia przez kleszcze, lokalizacja; miejsce narażenia: las, park, działka, łąka, inne; czas ekspozycji od ukłucia do usunięcia kleszcza ze skóry; do 2h, 2-24h, powyżej 24h, nie potrafię określić; występowanie w miejscu ukłucia objawów: zaczerwienie ustępujące po usunięciu kleszcza, rumień w miejscu ukłucia lub w innej lokalizacji; zachorowanie na boreliozę w przeszłości; 34

35 zastosowanie antybiotykoterapii po pokłuciu i ewentualnie długość zastosowanego leczenia; inne objawy kojarzone od momentu pokłucia: zmiany skórne, zaburzenia neurologiczne, objawy stawowe, objawy ze strony układu krążenia. Następnie, z żyły przedramienia, została pobrana próbka krwi o objętości 5 ml, do probówki na skrzep. Każda probówka oraz blankiet badania laboratoryjnego zostały oznakowane przy pomocy kodu kreskowego zawierającego zakodowane dane osobowe pacjenta (imię i nazwisko, PESEL). Każda z próbek krwi pobranych na skrzep, została odwirowana w celu uzyskania surowicy, w której oznaczono przeciwciała p/borrelia w grupach IgM i IgG za pomocą testu ELISA. Połowa uzyskanego materiału została zamrożona w temperaturze - 40 C do chwili wykonania dalszych oznaczeń. Dla każdego pacjenta wykonano oznaczenie miana przeciwciał przeciwko B. burgdorferi w klasie IgM oraz IgG, a w przypadku uzyskania wyniku interpretowanego jako dodatni lub wątpliwy (niezależnie od klasy przeciwciał) wykonano dodatkowo test potwierdzenia oparty na technice Western-blot dla przeciwciał IgM i IgG. Do badania wykorzystano testy firmy Bio-Mar, badania wykonywano w Laboratorium Szpitala Wielospecjalistycznego w Jaworznie. Do oceny przeciwciał w klasie IgG użyto testu ELISA - Aeskulisa Borrelia G, który jest enzymatycznym testem immunologicznym opartym na fazie stałej do ilościowego i jakościowego wykrywania przeciwciał IgG przeciwko Borrelia burgdorferi. Test IgG jest opłaszczony mieszaniną wysoce oczyszczonych antygenów ze szczepów Borrelia istotnych przy występowaniu choroby. Co więcej, mieszanina ta została wzbogacona rekombinowanym VIsE, który jest antygenem najbardziej czułym przy wykrywaniu przeciwciał IgG. Zasada testu jest następująca: próbki surowicy rozcieńczane w stosunku 1:101 są inkubowane na mikropłytkach opłaszczonych specyficznymi antygenami. Przeciwciała występujące w surowicy pacjenta wiążą się z antygenem na płytce. Frakcja przeciwciał niezwiązanych jest wypłukiwana na kolejnym etapie testu. Następnie na płytkę nanoszony jest koniugat (anty-ludzkie immunoglobuliny skoniugowane z peroksydazą chrzanową). W trakcie inkubacji, na mikropłytce następuje reakcja z kompleksem antygenów/przeciwciał próbki. Nadmiar koniugatu jest następnie wypłukiwany. Dodanie substratu (TMB) specyficznego dla enzymu, powoduje zmianę barwy w wyniku enzymatycznej reakcji kolorymetrycznej, która po określonym czasie jest zatrzymywania poprzez użycie rozcieńczonego 35

36 kwasu (kolor zmienia się z niebieskiego na żółty). Skala tworzenia zabarwienia z chromogenu jest funkcją ilości koniugatu związanego z kompleksem antygenówprzeciwciał i jest proporcjonalna do początkowego stężenia właściwych przeciwciał w próbce pacjenta. W celu interpretacji wyników z gęstości optycznej każdej próbki odczytuje się odpowiadające jej stężenie przeciwciał wyrażone w U/ml. Zakres normalny < 12 U/ml, zakres wątpliwy U/ml, wyniki pozytywne > 18 U/ml. Do oceny przeciwciał w klasie IgM użyto testu ELISA - Aeskulisa Borrelia M, który jest enzymatycznym testem immunologicznym opartym na fazie stałej do ilościowego i jakościowego wykrywania przeciwciał IgM przeciwko Borrelia burgdorferi. Test IgM jest opłaszczony oczyszczonym OspC oraz specyficznym dla Borrelia p41i, oba antygeny generują wysoką odpowiedź przeciwciał podklasy IgM. Z tego powodu oba antygeny służą jako specyficzne wskaźniki wczesnych faz infekcji Borrelia. Dodatkowo, w buforze próbek zawarto absorbent RF. Usuwa on specyficzne przeciwciała IgG, które interferują z pomiarem IgM. Co więcej, absorbenty RF zmniejszają ryzyko wystąpienia błędnie pozytywnego wyniku, wiążąc czynniki reumatoidalne działające na przeciwciała IgG połączone z antygenami. Zasada testu jest identyczna jak w zakresie klasy IgG. W celu potwierdzenia swoistości przeciwciał wykrytych w teście ELISA zastosowano metodę immunoblotting. Używano testu Aeskublot Borrelia-G oraz Aeskublot Borrelia-M firmy Bio-Mar. Aeskublot Borrelia-G jest czułym membranowym testem immunoenzymatycznym, do jakościowego wykrywania przeciwciał IgG przeciw Borrelia burgdorferi w surowicy ludzkiej. Antygeny umieszczone są na membranie z nitrocelulozy w dokładnie określonych pozycjach, tworząc szeregi równoległe. Zastosowano antygeny: p100 (białko pęcherzyków membran), VlsE (białko błonowe Borrelia - variable major protein-like sequence Expressed), p58 (nie scharakteryzowana), p41 Flagelina (białko strukturalne endoflagelin), p39 - BmpA (białko A błony Borrelia). Na każdym pasku testowym Aeskublot Borrelia-G znajdują się 4 paski kontrolne. Test może zostać uznany za ważny, jeśli: widoczna jest kontrola funkcjonalna, widoczna jest kontrola odciętej, widoczna jest właściwa kontrola koniugatu. Wyniki Aeskublot IgG należy interpretować następująco: interpretacja negatywna - 1 pasek poza VlsE > odcięta, interpretacja graniczna - VlsE lub 1 pasek + p41 odcięta, pozytywna - 2 paski poza p41 odcięta. Test Aeskublot Borrelia-M jest testem opierającym się na tej samej zasadzie jak powyżej 36

37 przedstawiony test w klasie IgG. Zasada metody jest identyczna, interpretacja jakościowa i ilościowa oraz interpretacja wyników jest analogiczna. Uzyskane wyniki badań laboratoryjnych zarówno w teście ELISA, jaki i Western-blot poddano analizie statystycznej. 37

38 IV Wyniki i ich omówienie Uzyskane wyniki obejmują badania ankietowe oraz badania immunologiczne z lat 2013 i Wyniki te zostały następnie poddane analizie statystycznej. IV 1 Wyniki badań ankietowych Jednym z warunków udziału w badaniu było wypełnienie ankiety dotyczącej ekspozycji na pokłucie przez kleszcze, ewentualne objawy po ukłuciu, wdrożone postępowanie i ewentualne leczenie. Nie wprowadzono braku pokłucia przez kleszcze, jako elementu wykluczającego z udziału w badaniu w obawie przed udzielaniem fałszywej odpowiedzi przez ankietowanych. Ankieta składała się z metryczki, w której umieszczono pytania o dane badanego, płeć, datę urodzenia, obywatelstwo, miejsce stałego zamieszkania, wykonywany zawód, nazwę zakładu pracy/nauki. W dalszej części zawarto 9 pytań dotyczących kontaktu z kleszczem, miejsca narażenia na ukłucie, czasu ekspozycji, postępowania medycznego po ukłuciu, przeszłości chorobowej, zastosowanego leczenia, objawów kojarzonych z pokłuciem przez kleszcze, wykonanych badań. Nie wszyscy ankietowani udzielili odpowiedzi na każde z postawionych pytań. Z grupy 300 osób, które poddały się badaniu krwi w 2013 roku, 231 potwierdziło kontakt z kleszczem (77%) z czego 156 osób (52%) podało wielokrotne ukłucia a 82 osoby (27,3%) jednokrotne ukłucie. Uzyskane odpowiedzi ilustruje Rycina 4. 38

39 Liczba przypadków Tak Wielokrotne ukłucia Jedno ukłucie Nie pamiętam Nie Ryc. 4. Wyniki badań ankietowych dotyczące kontaktu z kleszczem wśród osób badanych w roku Okres, jaki upłynął od momentu pokłucia przez kleszcze do czasu poddania się badaniom przesiewowym był mocno zróżnicowany. Nie ustalono ograniczeń dla mieszkańców z obawy przed zafałszowaniem rzeczywistych danych. Najkrótszy okres od pokłucia wynosił 1 miesiąc, co w przypadku odpowiedzi immunologicznej po kontakcie z antygenem jest czasem zbyt krótkim, aby uzyskać rzetelny wynik w badaniu laboratoryjnym. Skrajnie odległym okresem poprzedzającym badanie było kilkadziesiąt lat. Jednakże najliczniejszą grupę stanowiły osoby, które wskazywały na pokłucie w okresie od 2-15 miesięcy poprzedzających skrining (Rycina 5). 39

40 liczba miesięcy od pokłucia do badania Liczba pokłutych osób Ryc. 5. Okres czasu pomiędzy inwazją kleszcza a badaniem przesiewowym, jaki wskazali respondenci w roku Najczęstszym miejscem feralnego kontaktu z kleszczem był las (44% odpowiedzi) i ogród (25,66% odpowiedzi) (Rycina 6). 40

41 Liczba pokłuć przez kleszcze Las Ogród 6 21 Łąka Park Inne Ryc. 6. Teren, na którym doszło do pokłucia przez kleszcza. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku Bardzo istotnym z punktu widzenia dalszego postępowaniaa terapeutycznego oraz diagnostycznego jest okres czasu, jaki upłynął od momentu inwazji kleszcza. Nie zawsze czas ten jest możliwy do ustalenia, ale większość ankietowanych (54%) wskazywała na przedział pomiędzy 2 a 24 godzinami (Rycina 7). liczba pokłuć przez kleszcze poniżej 2 godzin 2-24 godzin powyżej 24 godzin nie potrafię określić Ryc. 7. Czas ekspozycji od momentu inwazji do momentu usunięcia kleszcza. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku

42 Również z czasem ekspozycji na ślinę kleszcza wiążą się objawy manifestowane przez pacjentów. Im dłuższy czas ekspozycji tym większe prawdopodobieństwo infekcji w przypadku zakażenia lub zarażenia kleszcza patogenami chorobotwórczymi. Najczęstszym obiektywnym objawem, na jaki zwracali uwagę ankietowani (42%) było zaczerwienienie skóry w miejscu ukłucia, które ustępowało po usunięciu kleszcza ze skóry. Na bóle i obrzęki stawów wskazało 29% badanych, a rumień wystąpił w 17,6% przypadków (Rycina 8). Na występowanie subiektywnych objawów grypopodobnych wskazywało 13,3% mieszkańców (Rycina 9). Liczba wystąpień Zaczerwienienie ustępujące po usunięciu kleszcza Rumień w miejscu inwazji Bóle i obrzęki stawów Zmiany guzkowate skóry Ryc. 8. Najczęstsze objawy występujące po inwazji kleszcza. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku Liczba wystąpień 40 Tak Nie 218 Ryc. 9. Występowanie subiektywnych objawów grypopodobnych po pokłuciu przez kleszcza. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku

43 Wśród wszystkich mieszkańców, którzy zgłosili się do badań przesiewowych w 2013 roku - 25 osób czyli 8,3 % wskazywało na rozpoznanie u nich boreliozy w przeszłości. Można domniemywać, że badania były dla nich szansą na ocenę dynamiki poziomu przeciwciał, ale niewykluczone jest również, że od czasu zachorowania mieli ponowny kontakt z kleszczem (Rycina 10). Liczba wystąpień Tak Nie Trudno powiedzieć Ryc. 10. Rozpoznanie boreliozy w okresie poprzedzającym przystąpienie do badania przesiewowego. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku Pomimo obowiązujących protokołów diagnostycznych i leczniczych w przypadku rozpoznania boreliozy, postępowanie z pacjentem w bezpośrednim okresie po pokłuciu jest bardzo różne. Zależy ono oczywiście od objawów manifestowanych przez pacjenta, ale również od wiedzy i doświadczenia lekarza, do którego zgłasza się pacjent, w bezpośrednim okresie po zauważeniu kleszcza lub zaobserwowaniu u siebie niepokojących objawów późnych. Wśród ankietowanych w roku 2013 u 97 osób (32,3%) zastosowano antybiotykoterapię (Rycina 11). Osoby, które pamiętały rodzaj zastosowanego leczenia najczęściej wymieniały antybiotyki z grupy cefalosporyn lub antybiotyki beta-laktamowe. 43

44 Liczba wystąpień 97 Tak Nie 146 Ryc. 11. Zastosowanie antybiotykoterapii po pokłuciu przez kleszcze. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku W roku 2015 badanie w kierunku oznaczenia poziomu przeciwciał przeciwko Borrelia przeprowadzono u 404 osób. Tak jak poprzednio nie ustanowiono kontaktu z kleszczem jako warunku koniecznego do zakwalifikowania się do badania. W grupie badanej 307 osób (76%) wskazało na kontakt z kleszczem z czego 177 osób (26,5%) na kontakt wielokrotny, a 99 (24,5%) na pojedynczee ukłucie (Rycina 12). Liczba przypadków Tak Wielokrotne ukłucia Jedno ukłucie Nie pamiętamm Nie Ryc. 12. Wyniki badań ankietowych dotyczące kontaktu z kleszczem wśród osób badanych w roku

45 Najczęstszym miejscem, w którym doszło do kontaktu z kleszczem był las (45%), a następnie ogród (27,5%). Pozostali ankietowani wskazywali ponadto na łąkę, park, podwórko lub plażę (Rycina 13). liczba pokłuć przez kleszcze Las Ogród Łąka Park Inne 14 Ryc. 13. Teren, na którym doszło do pokłucia przez kleszcze. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku Czas przebywania kleszcza w skórze podzielono wg prawdopodobieństwa wystąpienia późniejszych objawów chorobowych związanych z fizjologią kleszcza i sposobem jego żerowania. Najliczniejsza grupa ankietowanych (38%) wskazywała na przedział pomiędzy 2 a 24 godzinami, jako prawdopodobny czas ekspozycji na wydzieliny kleszcza. U 40 osób (9,9%) czas ten był dłuższy aniżeli 24 godziny co mogło skutkować dalszymi objawami (Rycina 14). liczba pokłuć przez kleszcze poniżej 2 godzin 2-24 godzin powyżej 24 godzin nie potrafię określić Ryc. 14. Czas ekspozycji od momentu inwazji do momentu usunięcia kleszcza. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku

46 Wśród osób przystępujących do badania, podobnie jak w roku 2013 występowały osoby, u których rozpoznano boreliozę w przeszłości. Grupa ta liczyła w 2015 roku 44 ankietowanych, czyli około 11% (Rycina 15). Liczba wystąpień Tak Nie Trudno powiedzieć Ryc. 15. Rozpoznanie boreliozy w okresie poprzedzającym przystąpienie do badania przesiewowego. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku Na pytanie o objawy zaobserwowane u siebie po pokłuciuu przez kleszcze wskazywano najliczniej na zaczerwienienie ustępujące po usunięciu kleszcza (37,6%) oraz na rumień (16%). Objawy grypopodobne odczuwałoo 11% badanych. Szczegółowe dane przedstawiono na Rycinach 16 i 17. Liczba wystąpień Zaczerwienienie ustępujące po usunięciu kleszcza Rumień w miejscu inwazji Bóle i obrzęki stawów Zmiany guzkowate skóry Ryc. 16. Najczęstsze objawy występujące po inwazji kleszcza. Wyniki badań ankietowych w roku

47 Liczba wystąpień 46 Tak Nie 290 Ryc. 17. Występowanie subiektywnych objawów grypopodobnych po pokłuciu przez kleszcza. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku Pomimo, że na wystąpienie rumienia po pokłuciu przez kleszcza wskazało 65 osób, to 90 badanych wskazało, że zastosowano u nich terapię antybiotykową (Rycina 18). Nie zawsze w przypadku rumienia czy objawów skórnych lub stawowych zastosowany został antybiotyk. W badaniu ankietowym zwróconoo uwagę na brak korelacji pomiędzy występowaniem objawów kwalifikujących do rozpoczęcia leczenia a zastosowanym leczeniem. Wskazywać to może na pewną dowolność i uznaniowość w zastosowanym leczeniu przez lekarzy, do których zgłaszają się pacjenci. Liczba wystąpień 90 Tak Nie 248 Ryc. 18. Zastosowanie antybiotykoterapii po inwazji kleszcza. Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych w roku

48 IV 2 Wyniki badańń immunologicznych i 2015 rok Z próbki krwi pobranej od każdej osoby uczestniczącej w badaniu wykonano oznaczenie poziomu przeciwciał przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato przy pomocy testu immunoenzymatycznego ELISA. Z uwagi na wysoką czułość testu i niską specyficzność oraz wytyczne w zakresie diagnostyki boreliozy założono, że wyniki dodatnie i wątpliwe w jednej lub obydwu klasach immunoglobulin zostaną zweryfikowane testem Western-blot. W roku 2013, w klasie IgG w teście ELISA uzyskano 58 wyników dodatnich i 22 wątpliwe. Natomiast w klasie IgM przy użyciu tego samego testu uzyskano 97 wyników dodatnich i 35 wątpliwych. Wśród osób, które zakwalifikowano, na podstawie wyżej przedstawionych kryteriów do testu potwierdzenia WB w klasie IgG uzyskano 12 wyników dodatnich, 104 ujemne i 12 granicznych. W klasie IgM uzyskano 32 wyniki dodatnie, 91 ujemnych i 7 granicznych. 132 osoby uzyskały wynik dodatni/wątpliwy w jednej lub obydwu klasach immunoglobulin, natomiast 41 osób uzyskało jednoznacznie dodatni wynik w teście Western-blot. U 17 osób uzyskano wynik niejednoznaczny, wymagający powtórzenia po upływie kilku tygodni, tzn. w jednej lub obydwu klasach wynik był graniczny przy ujemnym w drugiej klasie. Na podstawie analizy próbek krwi za pomocą testu ELISA uzyskano 58 wyników dodatnich w klasie IgG oraz 97 wyników w klasie IgM. Wyniki wątpliwe uzyskano w 22 próbkach w klasie przeciwciał IgG oraz w 35 próbkach w klasie IgM. Testem Western-blot uzyskano potwierdzenie dla 12 próbek w klasie IgG oraz dla 32 w klasie IgM (ryciny 19 i 20). 220 Liczba badanych próbek ujemny dodatni wątpliwy Test Elisa IgG Test Elisa IgM Ryc. 19. Wyniki badania poziomu przeciwciał przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato w teście ELISA wśród wszystkich próbek krwi pobranych od osób badanych w roku

49 104 Liczba badanych próbek ujemny dodatni wątpliwy Test Western-blott IgG Test Western-blot IgM Ryc. 20. Wyniki badania poziomu przeciwciał przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato testem Western-blot w próbkach surowicy krwi osób badanych w roku 2013, u których uzyskano dodatni lub wątpliwy wynik w teście ELISA. W próbkach surowicy krwi 404 osób, które poddały się badaniu w 2015 roku uzyskano w teście Elisa 125 wyników dodatnich w klasie IgG oraz 59 wyników wątpliwych. W klasie IgM uzyskano 83 wyniki dodatnie i 54 wątpliwe (Rycina 21). Wyniki te zostały zweryfikowane przy użyciu testu Western-blot. Liczba osób, która z uwagi na dodatni wynik w jednej lub obydwu klasach przeciwciał, przeszła do testu potwierdzenia wyniosła Liczba badanych próbek ujemny dodatni wątpliwy Test Elisa IgG Test Elisa IgM Ryc. 21. Wyniki testu ELISA w klasach IgG i IgM uzyskane w próbkach surowicy krwi osób badanych w roku

50 W teście potwierdzenia uzyskano 29 wyników dodatnich oraz 8 wyników wątpliwych w klasie IgG. Natomiast w klasie IgM uzyskano 27 wyników dodatnich i 2 wątpliwe (Rycina 22) Liczba badanych próbek ujemny dodatni wątpliwy Test Western-blot IgG Test Western-blot IgM Ryc. 22. Wyniki testu Western-blot w klasach IgG i IgM uzyskane w próbkach surowicy krwi osób badanych w roku IV 3 Analiza statystyczna Dane w skali interwałowej o rozkładzie normalnym zostały przedstawione, jako średnia ± odchylenie standardowe. Dane odbiegające od rozkładu normalnego i dane porządkowe przedstawiono, jako medianę oraz kwartyle dolny i górny. Dane jakościowe przedstawiono w postaci liczebności oraz wartości procentowych. Ocenę normalności rozkładu otrzymanych wyników dokonano na podstawie testu Shapiro- w przypadku Wilka oraz wykresu kwantylowego Q-Q. Dla porównania danych w dwóch grupach chorych zastosowano rozkładu normalnego lub po dokonaniu normalizacji test t-studenta dla danych niezależnych; jednorodnośćć wariancji oceniano testem Levene a. W celu porównaniaa zmiennych dychotomicznych zastosowano test χ 2 lub jeżeli jakaś liczebność oczekiwana była mniejsza niż 5 test χ 2 z poprawką Yates a. Ocenę zgodności metod laboratoryjnych analizowano w oparciu o współczynnika Kappa Cohena z odpowiadającym przedziałem ufności. 50

51 W celu oceny wpływu różnych czynników na szansę wystąpienia wyników pozytywnych zastosowano analizę jednoczynnikowej regresji logistycznej metodą krokową wsteczną. Za parametry istotne statystycznie uznawano zmienne, dla których poziom istotności p był mniejszy niż 0,05. Obliczenia wykonano z użyciem programów: Statistica 10.0 wersja PL, oraz Excel z pakietu MS Office. IV 3.1 Częstość wystąpienia pokłucia przez kleszcze w badanej grupie respondentów Częstość wystąpienia pokłucia przez kleszcze w badanej grupie respondentów zaprezentowano na Rycinie 23. W badaniu wzięły udział 704 osoby, w tym 471 (66,9%) kobiet. Z tej grupy 558 (79,3%) respondentów potwierdziło, że ukłucie przez kleszcza miało miejsce. Wśród nich były 362 (76,9%) kobiety oraz 73 mężczyzn (84,1 % badanych mężczyzn). W 62 (8,8%) przypadkach negowano pokłucie przez kleszcze. Takiej odpowiedzi w ankiecie udzieliło 48 (10,2%) kobiet oraz 14 (6,0%) mężczyzn. Pozostałe osoby w liczbie 84 (11,9%) podały, że nie pamiętają faktu inwazji kleszcza. W tej grupie było 61 (12,9%) kobiet oraz 23 (9,9%) mężczyzn. Spośród osób, które potwierdziły ukłucie przez kleszcza 224 respondentów podało, że było to ukłucie pojedyncze. W tej grupie znalazło się 151 (41,7%) kobiet oraz 73 (37,2%) mężczyzn. Pozostali reprezentanci grupy potwierdzającej fakt ukłucia (334 osoby tj. 59,9% respondentów) podali, że były to ukłucia wielokrotne (mnogie). Wśród nich znalazło się 211 (58,3%) kobiet oraz 123 (62,8%) mężczyzn. Wśród respondentów, którzy zostali pokłuci przez kleszcza, 441 (79,0%) badanych podało datę ostatniego ukłucia. Mediana czasu od ostatniego ukłucia wynosiła 6 miesięcy (Q 1 = 3; Q 3 = 24; zakres: miesięcy). 51

52 704 respondentów w tym 471 (66,9% kobiet) Ukłucie TAK 558 (79,3%) 362 (76,9%) kobiet 73 (84,1%) mężczyzn Ukłucie NIE 62 (8,8%) 48 (10,2%) kobiet 14 (6,0%) mężczyzn Nie pamiętam 84 (11,9%) 61 (12,9%) kobiet 23 (9,9%) mężczyzn Ukłucie pojedyncze 224 (40,1%) 151 (41,7%) kobiet 73 (37,2%) mężczyzn Ukłucie mnogie 334 (59,9%) 211 (58,3%) kobiet 123 (62,8%) mężczyzn Ryc. 23. Częstość przypadków pokłucia przez kleszcza w ogólnej liczbie badanych kobiet i mężczyzn mieszkańców Jaworzna z uwzględnieniem inwazji pojedynczych i mnogich. IV 3.2 Teren, na którym doszło do inwazji kleszcza Spośród wszystkich respondentów 567 (80,5%) osób określiło teren, na którym doszło do ukłucia przez kleszcza. Odpowiedzi respondentów przedstawiono na Rycinie 24. W tej grupie 55,6% badanych doznało ukłucia przez kleszcza w lesie, 33,3% jako miejsce tego zdarzenia podaje łąkę, a 9,7% - park. Według 7,1% osób do ukłucia doszło w ogrodzie, a 5,3% respondentów wskazuje inne miejsca jako teren, na którym doszło do kontaktu z kleszczem. 52