Enzymatyczne układy antyoksydacyjne dysmutazy nadtlenkowe, katalazy, peroksydazy

Transkrypt

1 Enzymatyczne układy antyoksydacyjne dysmutazy nadtlenkowe, katalazy, peroksydazy Wykład

2 Enzymy tworzące i unnieczynniające reaktywne formy tlenu Forstermann U, Nature Rev Cardiol 2008

3 Dysmutazy ponadtlenkowe Dysmutazy nadtlenkowe (SOD EC ) klasa enzymów katalizujących dysmutację anionorodnika nadtlenkowego do tlenu oraz nadtlenku wodoru. Dysmutazy tworzą istotny system antyoksydacyjny w komórkach niemal wszystkich żywych organizmów Jednym z wyjątków są bakterie z rodzaju Lactobacillus (Lactobacillus plantarum) -używają innego systemu -także kilka gatunków Leptospira oraz trzy wirulentne szczepy gonokoków Neisseria gonorrhoeae (bogate w katalazę oraz peroksydazy)

4 Dysmutazy ponadtlenkowe Reakcja : M (n+1)+ -SOD + O 2 M n+ -SOD + O 2 M n+ -SOD + O 2 + 2H + M (n+1)+ -SOD + H 2 O 2 Gdzie: M = Cu (n=1) ; Mn (n=2) ; Fe (n=2) ; Ni (n=2). W reakcji tej stan oksydacyjny metalu oscyluje pomiędzy n a n+1 Całościowo: O O H + H 2 O 2 + O 2

5 Dysmutazy ponadtlenkowe Figure 18.22Superoxide Dismutase Mechanism The oxidized form of superoxide dismutase (M ox ) reacts with one superoxide ion to form O 2 and generate the reduced form of the enzyme (M red ). The reduced form then reacts with a second superoxide and two protons to form hydrogen peroxide and regenerate the oxidized form of the enzyme. Stryer, Biochemistry,

6 Dysmutazy ponadtlenkowe Discovered by Irwin Fridovich and Joe McCord, SOD enzymes were previously thought to be several metalloproteins with unknown function (for example, CuZnSOD was known as erythrocuprein). [2] Several common forms of SOD exist: they are proteins cofactored with copper and zinc, or manganese, iron, or nickel. For example, Brewer (1967) identified a protein that became known as superoxide dismutase as an indophenol oxidase by protein analysis of starch gels using the phenazine-tetrazolium technique. Wikipedia

7 Różne formy dysmutaz ponadtlenkowych Ssaki (i większość strunowców) 1. SOD1 CuZn-SOD - cytoplazmatyczna, zawiera Cu & Zn w centrum aktywnym; gen zlokalizowany w chromosomie 21 (21q22.1) 2. SOD2 MnSOD- mitochondrialna zawiera Mn gen w chromosomie 6-6q SOD3 EC-SOD (CuZn-SOD) - pozakomórkowa zawiera CuZn (gen w chromosomie 4 4p15.3-p15.1) 1. SOD1 występuje poza cytozolem w jądrze komórkowym, peroksysomach, przestrzeni międzybłonowej w mitochondriach ludzkich komórek

8 Dysmutaza miedziowo-cynkowa Homodimer 32kDa jedno miejsce wiążące Zn oraz jedno Cu W każdej podjedonstce Valnetine et al., Ann Rev Biochem 2005

9 Różne formy dysmutaz ponadtlenkowych Rośliny Mn-SOD mitochondria i peroksysomy Fe-SOD chloroplasty; także peroksysomy CuZn-SOD cytosol, chloroplasty, peroksysomy, apoplasty Bakterie E. coli cztery rodzaje SOD 1. CuZnSOD periplazmatyczna 2. MnSOD wewnątrzkomórkowa 3. FeSOD 4. Hybrydowa zawiera podjednostkę enzymu Mn oraz podjednostkę Fe w tej samej dimerycznej cząsteczce

10 Dysmutazy eukariotyczne i prokariotyczne Copper and zinc most commonly used by eukaryotes. The cytosols of virtually all eukaryotic cells contain an SOD enzyme with copper and zinc (Cu-Zn-SOD). For example, Cu-Zn-SOD available commercially is normally purified from the bovine erythrocytes: The Cu-Zn enzyme is a homodimer of molecular weight 32,500. The bovine Cu-Zn protein was the first SOD structure to be solved, in [5] Iron or manganese used by prokaryotes and protists, and in mitochondria Manganese Chicken liver (and nearly all other) mitochondria, and many bacteria (such as E. coli), contain a form with manganese (Mn-SOD): for example, the Mn-SOD found in human mitochondria. \ Nickel prokaryotic.

11 Lokalizacja subkomórkowa dysmutaz W normalnych warunkach mitochondrialny łańcuch oddechowy jest głównym źródłem anionorodnika ponadtlenkowego, przekształcając około 5% cząsteczkowego tlenu do O 2 -. Faraci and Didion, ATVB 2004

12 Lokalizacja SOD względem łańcucha oddechowego w mitochondriach HZ Szeto, AAPS Journal. 2006; 8(3): E521-E531. DOI:

13 Inhibitory dysmutaz ponadtlenkowych 1. CuZnSOD - a) cyjanek b) DTC diethydithiocarbonate 2. FeSOD oraz MnSOD nie są hamowane przez cyjanek 3. FeSOD hamowana przez DTC 3. CuZnSOD oraz FeSOD są hamowane przez dlugą inkubację z nadtlenkiem wodoru, podczas gdy MnSOD nie jest

14 Wykrywanie aktywności dysmutaz ponadtlenkowych Metoda redukcji NBT (błekotu nitrotetrazoliowego) za pomocą ksantyny i oksydazy ksantynowej O 2 *- redukuje NBT do diformazanu niebieksiej barwy + CN - brak + brak +

15 Wykrywanie aktywności dysmutaz ponadtlenkowych MnSOD CuZnSOD Bez CN - a- mózg b- serce c- wątroba d- płuca 2 mm CN - Mysz Kurczak Halliwell & Gutteridge, 2001

16 SOD & nadtlenoazotyn

17 Powstawanie nadtlenoazotynu Guzik i wsp J Physiol Pharmacol 2005

18 Powstawanie nadtlenoazotynu

19 Uszkodzenie mitochondriów przez ROS oraz NO. Faraci and Didion, ATVB 2004

20 Uszkodzenie mitochondriów przez ROS oraz NO. HZ Szeto, AAPS Journal. 2006; 8(3): E521-E531. DOI:

21 Enzymy unieczynniające nadtlenek wodoru

22 Katalaza Białko hemowe (EC ) - enzym występujący u niemal wwszystkich organizmów Rozkłada nadtlenek wodoru do wody i tlenu Enzym charakteryzujący się jedną z najwyższych liczb obrotu jedna cząsteczka katalazy może przeksztalcicc w ciągu sekundy 40 mln cząsteczek nadtlenku wodoru do wody oraz tlenu Jest tetramerem każdy z łańcuchów składa się z 500 aminokwasów Zawiera 4 grupy hemowe umożliwiające enzymowi reakcję z nadtlenkiem wodoru Zlokalizowana w peroksysomach Ludzie chromosom 11, myszy chromosom 2

23 Historia badań katalazy History Catalase was first noticed as a substance in 1818 when Louis Jacques Thénard, who discovered H 2 O 2 (hydrogen peroxide), suggested that its breakdown is caused by a substance. In 1900, Oscar Loew was the first to give it the name catalase, and found its presence in many plants and animals. [8] In 1937 catalase from beef liver was crystallised by James B. Sumner [9] and the molecular weight was worked out in [10] In 1969, the amino acid sequence of bovine catalase was worked out. [11] Then in 1981, the 3D structure of the protein was revealed. [12] Wikipedia

24 Reakcje katalizowane przez katalazę (1) 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 While the complete mechanism of catalase is not currently known, the reaction is believed to occur in two stages: H 2 O 2 + Fe(III)-E H 2 O + O=Fe(IV)-E(.+) H 2 O 2 + O=Fe(IV)-E(.+) H 2 O + Fe(III)-E + O 2 [ Here Fe()-E represents the iron center of the heme group attached to the enzyme. Fe(IV)-E(.+) is a mesomeric form of Fe(V)-E, meaning that iron is not completely oxidized to +V but receives some "supporting electron" from the heme ligand. This heme has to be drawn then as radical cation (.+).

25 Reakcje katalizowana przez katalazę (2) Katalaza może utleniać także różne toksyny, takie jakie formaldehyd, kwas mrówkowy, fenole i alkohole. W reakcjach takich zużywa nadtlenku wodoru w następujący sposób H 2 O 2 + H 2 R 2H 2 O + R

26 Znaczenie katalazy w procesach chorobowych The true biological significance of catalase is not always straightforward to assess: Mice genetically engineered to lack catalase are phenotypically normal, indicating that this enzyme is dispensable in animals under some conditions. Catalase deficiency may increase the likelihood of developing Type II Diabetes Some human beings have very low levels of catalase (acatalasia), yet show few ill effects. It is likely that the predominant scavengers of H 2 O 2 in normal mammalian cells are peroxiredoxins rather than catalase According to recent scientific studies, low levels of catalase may play a role in the graying process of human hair. Hydrogen peroxide is naturally produced by the body and catalase breaks it down. If there is a dip in catalase levels, hydrogen peroxide cannot be broken down. This causes the hydrogen peroxide to bleach the hair from the inside out. Scientists believe this finding may someday be incorporated into anti-greying treatments for aging hair

27 Reaktywne formy tlenu a siwienie MSR methionine sulfoxide reductase Wood et al., FASEB J 2009

28 Komórkowe układy antyoksydacyjne Sigma-Aldrich

29 Peroksydazy Duża grupa enzymów (EC x) - katalizujących następujące reakcje ROOR' + electron donor (2 e - ) + 2H + ROH + R'OH For many of these enzymes the optimal substrate is hydrogen peroxide, but others are more active with organic hydroperoxides such as lipid peroxides. Peroxidases can contain a heme cofactor in their active sites, or redox-active cysteine or selenocysteine residues. horseradish peroxidase can use a variety of organic compounds as electron donors and acceptors. Horseradish peroxidase has an accessible active site, and many compounds can reach the site of the reaction. For an enzyme such as cytochrome c peroxidase, the compounds that donate electrons are very specific, because there is a very closed active site. Horseradish peroxidase - peroksydaza chrzanowa

30 Peroksydazy glutationowe -U ludzi w postaci 8 izoform -Używają glutationu jako dawcy elektronu i reagują z nadtlenkiem wodoru oraz organicznymi nadtlenkami -Gpx1, Gpx2, Gpx3 oraz Gpx4 enzymy zawierające selen -Gpx6 także bialko selenowe u ludzi, E-SeH + H 2 O 2 -> E-Se-OH + H 2 O E-Se-OH + GSH -> E-SeSG + H 2 O E-SeSG + GSH -> E-SeH + GSSH 2GSH + H 2 O 2 -> GSSG + H 2 O

31 Choroby spowodowane zaburzeniami w produkcji/eliminacji ROS lub związane z takimi zaburzeniami Atherogenesis Emphysema; bronchitis Parkinson disease Duchenne muscular dystrophy Cancer Alcoholic liver disease Diabetes Acute renal failure Down syndrome Cerebrovascular disorders Ischemia; reperfusion injury

32 Izoformy NOX w komórkach ściany naczyń krwionośnych

33 Znaczenie uszkodzenia ischemiczo-reperfuzyjnego w zawale mięś ęśnia sercowego Yellon & Housenloy, NEJM 2007

34 Niedobór reaktywnych form tlenu Choroba ziarniniakowa chronic granulomatous disease Chronic granulomatous disease (CGD) is a rare inherited immunodeficiency characterized by recurrent, often life threatening bacterial and fungal infections due to a functional defect in the microbial-killing activity of phagocytic neutrophils. It occurs as a result of mutations in genes encoding a multicomponent enzyme complex, the NADPH oxidase, that catalyses the respiratory burst. The majority of patients have an X-linked form of the disease which is associated with mutations in a membrane-bound component gp91phox. HLA-matched allogeneic hematopoietic stem cell (HSC) transplantation can be curative, but for patients without suitable donors, genetic modification of autologous hematopoietic stem cells is an attractive alternative.

35 Możliwości leczenia choroby ziarniniakowej terapia genowa

36 Konsekwencje nokautu genów SOD 1. Nokaut MnSOD większośc myszy umiera w ciągu 10 dni życia pozapłodowego z powodu zaburzeń w rozwoju serca, neurodegeneracji, gromadzenia tłuszczu w wątrobie i mięśniach szkieletowych i kwasicy metabolicznej 2,. Nokaut CuZn SOD 0- młode myszy wydają się zdrowe (chociaż są bardziej wrażliwe na toksyny wytwarzające anionorodnik ponadtlenkowy w starszym wieku pojawiają się zaburzenia neurologiczne oraz nowotwory: np. rak wątroby

37 Nadmierna aktywność dysmutazy nadtlenkowej Mutations in the first SOD enzyme (SOD1) can cause familial amyotrophic lateral sclerosis (ALS, a form of motor neuron disease).the most common mutation in the U.S. is A4V, while the most intensely studied is G93A. The other two isoforms of SOD have not been linked to any human diseases, Overexpression of SOD1 has been linked to the neural disorders seen in Down's syndrome.

38 SOD a stwardnienie zanikowe boczne (ALS) Over 100 different mutations have been identified in the SOD1 gene of patients diagnosed with the familial form of amyotrophic lateral sclerosis (fals). These mutations result in a highly diverse group of mutant proteins, some of them very similar to and others enormously different from wild-type SOD1. Despite their differences in properties, each member of this diverse set of mutant proteins causes the same clinical disease, presenting a challenge in formulating hypotheses as to what causes SOD1-associated fals. Valnetine et al., Ann Rev Biochem 2005

39 stwardnienie zanikowe boczne (ALS) Lou Gehring Stephen Hawking Diagnosed at age of 21

40 Stwardnienie zanikowe boczne (ALS) 1869 Jean Martin Charcot Famous patients: -Lou Gehring - Dimitir Shostakovich - Mao Zedong (infamous patient...) - Stephen Hawking suffers from unusually slowly progressing form of a disease

41 stwardnienie zanikowe boczne (ALS) Incidence 2-3: Onset at years Sporadic (SALS) most instances (90-95%) Familial (FALS) 5-10% - of these 20-25% are mapped to CuZnSOD gene Degeneration of motor neurons progressive loss of the ability to move, speak, Usually fatal within 1-5 years of onset No treatment available

42 stwardnienie zanikowe boczne (ALS) % of cases no apparent genetic linkage 5-10 % - familial ALS mutation in SOD1 gene are responsible for % of cases of FALS -about 100 different mutations in SOD1 gene -mutations do not cause the lost of functions, but rather gaining of a toxic phenotype -among others, the formation of hydroxyl radicals and peroxynitrite has been suggested

43 Stwardnienie zanikowe boczne (ALS) Yuan J & Yankner BA, Nature 407, (2000)

44 Reaktywne formy tlenu regulują syntezę czynników angiogennych

45 Czynnik aktywowany przez hipoksję np. VEGF HIF-1 & Mole et al., IUBM, 2001

46 Nadtlenek wodoru indukuje syntezę VEGF Grzenkowicz-Wydra i wsp. Mol Cel Biochem 2004

47 Nadtlenek wodoru aktywuje HIF Grzenkowicz-Wydra i wsp. Mol Cel Biochem 2004

48 Tlenek azotu indukuje syntezę VEGF nitric oxide (NO) donors, S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), and 3- morpholinosydnonimine (SIN-1) Dulak & Jozkowicz, Antioxid Redox Signal 2003

49 Tlenek azotu aktywuje czynnik transkrypcyjny HIF-1 Dulak & Jozkowicz, Antioxid Redox Signal 2003

50 Indukcja produkcji VEGF w hipoksji zależy od HO-1 Inhibition of HO-1 attenuates hypoxia-induced VEGF production (Dulak et al., Antioxid Redox Signal 2002) PNAS, March 2007, vol 104,

51 Biologiczny efekt CO może zależeć od aktywacji MnSOD Dulak & Jozkowicz, Acta Biochimica Polonica 2003

52 Wpływ ROS na regulację ekspresji genów związanych z angiogenezą

53 Kinnula and Crapo, Free Radicals Biology & Medicine, 2004

54 Dziękuję