Metody mikrobiologicznej diagnostyki zakażeń Clostridium difficile

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2017, 69: 177-185 Metody mikrobiologicznej diagnostyki zakażeń Clostridium difficile Diagnostic methods for Clostridium difficile infections Małgorzata Aptekorz, Gayane Martirosian Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Wydział Lekarski w Katowicach, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Clostridium difficile jest przyczyną 30-50% biegunek poantybiotykowych, co stanowi olbrzymie obciążenie kliniczne i ekonomiczne. U około 30% pacjentów dochodzi do nawracających zakażeń i aż u 45-65% z nich rozwijają się kolejne nawroty choroby. Podejrzenie zakażenia C. difficile wymaga bezzwłocznego wprowadzenia odpowiednich działań w obrębie kontroli zakażeń celem zapobiegania ich dalszego rozprzestrzeniania się w szpitalu. Szybka i precyzyjna diagnostyka zakażeń C. difficile jest bardzo ważnym elementem w całym łańcuchu procedur niezbędnych do wykonania. W pracy zostały omówione różne algorytmy diagnostyczne, a także porównano skuteczność stosowanych w tym celu testów immunoenzymatycznych, membranowych i molekularnych. Słowa kluczowe: Zakażenia Clostridium difficile, algorytmy diagnostyczne ABSTRACT About 30%-50% of hospital antibiotic-associated diarrheas are caused by C. difficile, which constitutes a huge clinical and economic burden. Relapses are a frequent problem (in 30 % of CDI patients) and 45-65% of these patients develop multiple recurrences. Suspicion of the CDI requires immediate action to be taken within the control of infection to prevent further spread in the hospital. Rapid and precise diagnostic is very important element in the chain of required procedures. Certain diagnostic algorithms and effectivity of different immunoenzymatic, membrane and molecular tests were compared and discussed in this publication. Keywords: Clostridium difficile Infection, diagnostic algorithms

178 M. Aptekorz i G. Martirosian Nr 1 WSTĘP Clostridium difficile to Gram-dodatnia, beztlenowo rosnąca laseczka produkująca spory, która odpowiedzialna jest za szerokie spektrum zakażeń, począwszy od łagodnej biegunki do zagrażających życiu rzekomobłoniastego zapalenia jelit oraz okrężnicy olbrzymiej. W około 90% przypadków zakażeń wywołanych przez C. difficile (CDI) pacjenci w wywiadzie zaznaczają antybiotykoterapię poprzedzającą wystąpienie objawów klinicznych. Szacuje się, że u 5-35% pacjentów przebywających w placówkach opieki zdrowotnej i otrzymujących antybiotyki może rozwinąć się biegunka. C. difficile jest przyczyną 30-50% biegunek poantybiotykowych, co stanowi olbrzymie obciążenie kliniczne i ekonomiczne (8, 20, 32). Jako czynniki ryzyka wystąpienia CDI wskazuje się wiek powyżej 65 roku życia, hospitalizację oraz długotrwałą terapię inhibitorami pompy protonowej, antagonistami receptorów H 2 itd. Wśród czynników ryzyka CDI wymieniane są chemioterapia, a także inwazyjne procedury diagnostyczne i terapeutyczne w obrębie przewodu pokarmowego, hipoalbuminemia, choroby nerek, przeszczepy narządów, zakażenie wirusem HIV, choroby autoimmunologiczne, nowotwory i choroby zapalne jelit (11, 19, 29). Bardzo często dochodzi do zakażeń nawracających - u 30% pacjentów, i aż u 45-65% z nich rozwijają się kolejne nawroty choroby. Nawroty CDI najczęściej dotyczą populacji pacjentów starszych, z chorobami współistniejącymi, nierzadko występuje kaskada nawrotów wynikająca między innymi ze złego stanu zdrowia i słabszej skuteczności środków terapeutycznych (15, 24, 28, 31). Powszechne stosowanie antybiotyków jest główną przyczyną rozwoju CDI. Na skutek występujących zaburzeń równowagi mikroflory jelitowej - jako niepożądanego następstwa antybiotykoterapii, namnaża się C. difficile, produkując dwie białkowe toksyny o wysokiej masie cząsteczkowej, uznawane za główne czynniki zjadliwości. Toksyna A jest enterotoksyną powodującą wzrost wydzielania i utratę elektrolitów i płynów, co doprowadza do objawów biegunkowych. Toksyna B posiada silne właściwości cytotoksyczne wobec enterocytów. Toksyny przyłączając się do mikrokosmków komórek nabłonkowych jelit powodują ich apoptozę (5). Toksyny A i B C. difficile (CDT) są kodowane przez geny tcda i tcdb zlokalizowane w regionie PaLoc genomu bakterii o wielkości 19,6 kpz. Nie wszystkie szczepy jednak posiadają te geny i produkują toksyny. W ostatnim czasie obserwuje się ogniska choroby o cięższym przebiegu, wysokim odsetku nawrotów, powikłań i zwiększonej śmiertelności. Dodatkowo, obserwuje się pojawienie szczepów C. difficile opornych na wiele leków przeciwbakteryjnych oraz hiperwirulentnego szczepu C. difficile PCR rybotypu 027, charakteryzującego się wysoką opornością na fluorochinolony, zwiększoną produkcją toksyn A i B, wytwarzaniem dodatkowej toksyny binarnej (CDT) oraz według niektórych autorów podwyższoną zdolnością do tworzenia spor (1, 16, 21). Co gorsza zakażenie szczepem hiperwirulentnym jest istotnym czynnikiem ryzyka nawrotu choroby (18). CO ZROBIĆ W PRZYPADKU CDI Podejrzenie CDI wymaga bezzwłocznego wprowadzenia odpowiednich działań celem zapobiegania dalszego rozprzestrzeniania się zakażenia w szpitalu. Działania te obejmują m. in. szybką i skuteczną diagnostykę, nadzór, szkolenie personelu zwłaszcza w obrębie

Nr 1 Diagnostyka zakażeń C. difficile 179 szerzenia się zakażenia i epidemiologii a także właściwą higienę rąk oraz właściwe postępowanie dezynfekcyjne dotyczące środowiska szpitalnego i sprzętu. Ponadto, wskazana jest weryfikacja polityki antybiotykowej i to zarówno dotycząca terapii jak i profilaktyki zakażeń. Zaleca się rezygnację ze zbędnej terapii przeciwbakteryjnej i/lub zminimalizowanie częstości i czasu jej trwania oraz ograniczenie liczby przepisanych leków przeciwdrobnoustrojowych. Szczególnie przydatne okazuje się ograniczenie stosowania klindamycyny, fluorochinolonów i cefalosporyn. W stosunku do pacjenta z biegunką rekomenduje się zapewnienie prawidłowej równowagi wodno-elektrolitowej oraz zaprzestanie antybiotykoterapii (w miarę możliwości) a także aplikacji leków zwalniających motorykę jelit i inhibitorów pompy protonowej. Powyższe działania powodują ustąpienie biegunki w około 20% przypadków (4, 5, 10, 17). Jednakże nawet skrupulatne przestrzeganie powyższych zaleceń czasami nie skutkuje całkowitą eliminacją CDI ze względu na powszechną obecność spor C. difficile w placówkach opieki zdrowotnej, w środowisku zewnętrznym i nawet w żywności. Z uwagi na wzrost liczby CDI istnieje pilna potrzeba potwierdzenia zakażenia, zastosowania efektywnego leczenia i skutecznej strategii zapobiegania CDI (19, 28). W związku z wyżej wymienionym szybka i precyzyjna diagnostyka CDI jest bardzo ważnym elementem w całym łańcuchu procedur niezbędnych do wykonania kiedy się podejrzewa zakażenie C. difficile. Zakażenie C. difficile według definicji EUCLID stwierdza się na podstawie obserwacji klinicznych pacjenta oraz wyników badań laboratoryjnych. W wyniku zakażenia u pacjenta pojawia się biegunka (i/lub ostre rozdęcie okrężnicy) i równocześnie stwierdza się obecność toksyn A/B C. difficile w kale lub obecność toksynotwórczego szczepu C. difficile w kale, czy też endoskopowo rozpoznaje się rzekomobłoniaste zapalenie jelita grubego, bądź potwierdza się zakażenie C. difficile histopatologicznie podczas kolektomii lub autopsji (9, 10). DIAGNOSTYKA CDI Badania mikrobiologiczne powinny być wykonane tylko z próbek kału pacjentów ze stwierdzoną biegunką, którą należy definiować jako luźne stolce, przyjmujące kształt naczynia, pojawiające się co najmniej 3 krotnie lub częściej w ciągu 24 godzin, lub gdy istnieje podejrzenie niedrożności jelit (10). Złotym standardem wśród testów wykrywających toksyny C. difficile jest test cytotoksyczności CCNA (cell cytotoxicity neutralization assay). CCNA charakteryzuje się wysoką swoistością i wysoką pozytywną wartością predykcyjną, ale test technicznie jest skomplikowany, a wynik dostępny po co najmniej 48 godzinach. Posiew próbki kału pacjenta w celu wykrycia szczepu C. difficile (TC) produkującego toksyny uważa się za metodę bardzo czułą. Jednak hodowla jest czasochłonna (3-5 dni) w związku z tym nie jest powszechnie wykonywana w laboratoriach diagnostycznych (2, 6). Obie wymienione metody są polecane jako referencyjne, z wynikami których powinno porównywać się wyniki uzyskane przy zastosowaniu innych testów (5). Jak dotąd, żadna z istniejących metod diagnostycznych nie uwzględnia równocześnie wszystkich warunków idealnego testu: wysokiej czułości i swoistości, niskich kosztów i krótkiego czasu uzyskania wyniku. Zdarza się, że przyczyny ekonomiczne ograniczają możliwości diagnostyczne i laboratoria poprzestają na wykonaniu pojedynczego testu.

180 M. Aptekorz i G. Martirosian Nr 1 Może to prowadzić do wykazania fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych wyników, w efekcie czego dochodzi albo do niepotrzebnego leczenia chorych lub pominięcia terapii pacjentów zakażonych (22). Aby tego uniknąć, w rutynowej diagnostyce laboratoryjnej CDI wykorzystuje dwu lub trójstopniowy algorytm: skriningowy test potwierdza się jednym lub dwoma kolejnymi testami lub metodą referencyjną. Pierwszy test powinien się charakteryzować wysoką ujemną wartością predykcyjną (negative predictive value, NPV) czyli niezawodnością wobec próbek z ujemnym wynikiem badania; warunki takie spełniają testy: GDH EIA i testy molekularne NAAT (nucleic acid amplification test). Ujemny wynik wstępnego testu jest raportowany zwrotnie, natomiast wynik dodatni wymaga potwierdzenia kolejnym testem, który powinien być wysoce specyficzny i wiarygodnie klasyfikować próbki jako CDI. Testy drugiego etapu powinny charakteryzować się wysoką dodatnią wartością predykcyjną (positive predictive value, PPV), czyli są prawdziwie dodatnie; np. toxin A/B EIA (4, 5, 7). Debast i wsp. (10) zalecają algorytm, który w pierwszym etapie przewiduje wykonanie testu immunoenzymatycznego wykrywającego GDH, a potem testy w kierunku toksyn C. difficile. Próbki z ujemnym wynikiem raportowane są jako ujemne, natomiast próbki z dodatnim wynikiem poddawane są dalszym badaniom testami wykrywającymi obecność wolnych toksyn w kale lub genów toksyn. Z kolei Crobach i wsp. (7) jako najlepszą strategię postępowania w zakażeniach CDI sugerują dwa algorytmy, oba dwuetapowe. Pierwszy: wykonanie NAAT i testu immunoenzymatycznego (EIA) wykrywającego toksyny A/B C. difficile, natomiast drugi algorytm przewiduje wykonanie GDH EIA oraz testu EIA, wykrywającego toksyny A/B. Polskie rekomendacje dotyczące diagnostyki CDI zalecają wykonanie dwuetapowego algorytmu badań (14). Niemniej jednak Alfa i wsp. (2) wykazali, że jeżeli stosuje się dwustopniowy algorytm składający się z testów EIA w kierunku GDH i w kierunku toksyn A/B, nie jest wykrywana ponad jedna trzecia zakażeń wywołanych toksynotwórczymi szczepami C. difficile. Obecność wolnych toksyn w kale jest istotną wskazówką ponieważ potwierdzono wzrost ryzyka śmierci u takich pacjentów w porównaniu z pacjentami, u których nie wykrywa się toksyn w kale, a tylko w szczepie wyhodowanym. Kryterium to sugeruje, iż potwierdzanie obecności wolnych toksyn powinno być istotnym etapem w diagnozowaniu infekcji C. difficile (23). Natomiast powtórne badanie laboratoryjne w trakcie tego samego epizodu biegunki ma ograniczoną wartość i nie jest zalecane (5). W badaniach laboratoryjnych diagnostyki CDI wykorzystuje się szereg testów potwierdzających/wykluczających obecność antygenu GDH i toksyn C. difficile: testy immunoenzymatyczne (enzyme immunoassays, enzyme-linked immunosorbent assays) lub testy immunochromatograficzne oraz NAAT (4). WYKRYWANIE ANTYGENU GDH I TOKSYN C. DIFFICILE Pierwotnie obecność dehydrogenazy glutaminianowej badano stosunkowo szybkimi i niedrogimi testami lateksowymi, których swoistość była stosunkowo wysoka (94-98%) jednak czułość (58-68%) była niewystarczająca (5). Obecnie występowanie antygenu GDH w kale najczęściej bada się metodami immunoenzymatycznymi, testy są łatwe do wykonania a wynik badania może być dostępny bardzo szybko. Testy te są produkowane

Nr 1 Diagnostyka zakażeń C. difficile 181 jako testy płytkowe dołkowe (well-type) EIA, w których wynik jest odczytywany wizualnie i/lub spektrofotometrycznie oraz membranowe (membrane-type) EIA tylko do odczytu wizualnego (3, 27). Crobach i wsp. (7) porównali wyniki testów GDH typu płytkowego oraz typu membranowego z obydwoma testami referencyjnymi (CCNA i TC), otrzymując wysokie wartości czułości i swoistości (odpowiednio od 86% do 97% vs 90% do 95%). Natomiast Zheng i wsp. (33) badali próbki kału na obecność antygenu GDH metodą immunoenzymatyczną płytkową oraz metodą NAATs z wykorzystaniem PCR (poszukując fragmentu genu glud). W swoich badaniach wykazali bardzo wysoką czułość obu metod, jednak z uwagi na prostotę, czas wykonania oraz względy ekonomiczne, jako testy przesiewowe polecili metodę immunoenzymatyczną. Tymczasem Tenover i wsp. (30) opisali przypadki, w których we wstępnych badaniach na obecność antygenu GDH aż 15% próbek kału zawierających toksynotwórcze szczepy C. difficile nie zostatało poprawnie zidentyfikowanych. Prócz tego przedstawiono wynik czułości testu membranowego GDH EIA (wynoszące ~60%) w porównaniu z hodowlą toksynotwórczego szczepu wnioskując, iż badania przesiewowe na obecność tegoż antygenu są mniej czułe niż dotychczas sądzono. Autor interpretuje to zjawisko zmniejszoną czułością wykrywania GDH w próbkach kału, z których hodowano szczepy PCR rybotypów innych niż rybotyp 027 (30). Wyniki czułości i swoistości różnią się znacznie, jak to wyżej przedstawiono w zależności od użytego testu GDH, dlatego wskazane jest monitorowanie badań dotyczących tych wartości oraz poszukiwanie nowych wydajniejszych testów (5). Antygen GDH to enzym charakterystyczny dla wszystkich szczepów C. difficile, zarówno wytwarzających jak i nie wytwarzających toksyn (4, 28). Dlatego też ujemny wynik raportowany jest zwrotnie, natomiast wynik dodatni jest łączony z kolejnymi testami pozwalającymi na potwierdzenie lub wykluczenie obecności wolnych toksyn A/B C. difficile lub ich genów w kale (6, 7). Na rynku dostępny jest szeroki wybór testów opartych na metodach immunoenzymatycznych oraz molekularnych (4). Testy immunoenzymatyczne wykrywające toksyny A/B C. difficile wykorzystują różne substraty oraz przeciwciała; mogą być podobne do testów wykrywających antygen GDH, typu płytkowego EIA, membranowych EIA i zautomatyzowanych EIA, wykrywających toksyny A/B; wyniki zaś mogą być rejestrowane wizualnie lub spektrofotometrycznie (7, 12, 26). Porównując dołkowe testy wykrywające toksyny A/B EIA oraz membranowe Crobach i wsp. (7) uzyskali niskie wartości czułości (45% - 91%), natomiast swoistość mieściła się w wysokim zakresie 96% - 100%. W podobnych badaniach Butler i wsp. (4) uzyskali czułość około 70% a swoistości około 98%. Metody immunoenzymatyczne wykrywające toksyny A/B C. difficile charakteryzują się wysoką swoistością jednak nie są one wystarczająco czułe, co w konsekwencji może prowadzić do niedoszacowania liczby zakażeń (30). TESTY MOLEKULARNE Badania molekularne NAATs oparte o łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) a także izotermiczne amplifikacje DNA za pośrednictwem tzw. pętli (LAMP - loop mediated isotermal amplification) lub amplifikacje zależne od helikazy (HAD - helicase dependent amplification) są najnowszymi, szybkimi i precyzyjnymi metodami wprowadzonymi do diagnostyki CDI (7, 13, 23, 30). NAATs, w tym testy komercyjne, zostały opracowane

182 M. Aptekorz i G. Martirosian Nr 1 do wykrywania najczęściej pojedynczych lub rzadziej łącznie obydwu genów kodujących toksyny A i B C. difficile (tcda, tcdb) oraz toksynę binarną (tcdc) a także delecję 117 nukleotydu genu tcdc. Metody te charakteryzują się wysoką czułością (95%) i swoistością (98%) i coraz częściej są wykorzystywane w rutynowej diagnostyce szpitalnej (4, 7). Metody molekularne wymagają wysokiego poziomu wiedzy technicznej, specjalistycznej aparatury i odczynników, wyspecjalizowanego personelu, dodatkowo są kosztowne w porównaniu z innymi metodami, co powoduje, że są często niedostępne szczególnie w mniejszych laboratoriach. Alfa i wsp. (2) przedstawili koszty testów z wykorzystaniem różnych metod diagnostycznych CDI: koszt pojedynczego testu wynosił: do 40 USD dla NAAT, do 14 USD dla testów immunoenzymatycznych, do 11,5 USD dla hodowli szczepu i badaniu jego toksynotwórczości oraz do 10 USD dla testów wykrywających GDH i toksyny A i B. Koszt dwustopniowego algorytmu, składającego się z immunoenzymatycznego oznaczenia antygenu GDH i toksyn A/B C. difficile z potwierdzeniem metodą NAAT wynosił od 90 do 112 USD. Sharp i wsp. (25) porównali koszty badania NAAT, które wynosiły około 33 USD z kosztami testu EIA wykrywającego równocześnie obecność GDH i toksyn - 12 USD. W przypadku 12% próbek, dla których nie uzyskano jednoznacznych wyników, dodatkowo stosowali metodę PCR osiągając wzrost kosztów do około 45 USD. Bywa, iż z uwagi na wysoką czułość i swoistość testów NAAT oraz wyższy koszt i długi czas przeprowadzenia badania w formie dwustopniowego algorytmu, laboratoria ograniczają się jedynie do wykonania testów molekularnych, wykrywających geny toksyn (23). W rutynowej diagnostyce nie można jednak ograniczać się jedynie do wykonywania badań genetycznych ponieważ testy te wykrywają jedynie geny kodujące toksyny, a nie same toksyny, a u pacjentów skolonizowanych toksynotwórczym szczepem C. difficile biegunka może wystąpić również z innych przyczyn (7). Co ważniejsze Crobach i wsp. (7) wskazali, że z obrazem klinicznym koreluje raczej obecność wolnych toksyn w kale (dodatni wynik CCNA) a nie sama obecność toksynotwórczego szczepu (dodatni wynik TC). Stąd próbki kału z dodatnim wynikiem CCNA (wskazujące na obecność wolnych toksyn w kale) są uznawane jako prawdziwie dodatnie. Problematyczne pozostają jednak próbki kału pacjentów, które charakteryzują się obecnością toksynotwórczego szczepu (NAAT-dodatnie; TC-dodatnie) przy równoczesnym braku wolnych toksyn w kale (EIA i CCNA-ujemne). Niewątpliwie obecność genów toksyn A/B C. difficile i/lub toksynotwórczego szczepu w próbkach kału pacjentów z podejrzeniem CDI nie musi skutkować ekspresją tych genów i produkcją toksyn, ponadto prawdopodobna jest obecność wolnych toksyn lecz w ilościach poniżej progu wykrywalności testu (7). Z naszych doświadczeń, nabytych po przebadaniu próbek materiału klinicznego uzyskanego od ponad 500 osób podejrzanych w kierunku CDI wynika, że nie zawsze uzyskuje się 100% zgodności wyników wszystkich używanych testów. Dlatego też stosowanie kilkustopniowego algorytmu diagnostycznego w zestawieniu ze stanem klinicznym pacjenta powinno być podstawą diagnostyczną zgodną z wymogami EBM. PODSUMOWANIE W rutynowej diagnostyce CDI wykorzystuje się dwu lub trójstopniowy algorytm: skriningowy test potwierdza się jednym lub dwoma kolejnymi testami lub metodą referencyjną. Szybka i precyzyjna diagnostyka CDI jest bardzo istotna ze względu na możliwość

Nr 1 Diagnostyka zakażeń C. difficile 183 szybkiego rozpoczęcia odpowiedniego leczenia, a także wdrożenia szeregu procedur kontroli zakażeń niezbędnych do zlokalizowania zakażenia i prewencji dalszego szerzenia się go w środowisku szpitalnym. Podziękowania: Praca została wykonana w ramach projektu wewnętrznego KNW-1-091/K/6/0 Wydziału Lekarskiego w Katowicach Śląskiego Uniwersytetu Medycznego. PIŚMIENNICTWO 1. Abou Chakra CN, Pepin J, Sirard S, Valiquette L. Risk factors for recurrence, complications and mortality in Clostridium difficile infection: a systematic review. PLoS One. 2014; 9: e98400. 2. Alfa MJ, Sepehri S. Combination of culture, antigen and toxin detection, and cytotoxin neutralization assay for optimal Clostridium difficile diagnostic testing. Can J Infect Dis Med Microbiol 2013; 24: 89-92. 3. Arimoto J, Horita N, Kato S i inni. Diagnostic test accuracy of glutamate dehydrogenase for Clostridium difficile: Systematic review and meta-analysis. Sci Rep. 2016; 6: 29754. 4. Butler M, Olson A, Drekonja D i inni. Early Diagnosis, Prevention, and Treatment of Clostridium difficile: Update. Rockville (MD): Agency for Healthcare Research and Quality (US); 2016. 5. Cohen SH, Gerding DN, Johnson S i inni. Society for Healthcare Epidemiology of America; Infectious Diseases Society of America. Clinical practice guidelines for Clostridium difficile infection in adults: 2010 update by the society for healthcare epidemiology of America (SHEA) and the infectious diseases society of America (IDSA). Infect Control Hosp Epidemiol 2010; 31: 431-55. 6. Crobach MJ, Dekkers OM, Wilcox MH, Kuijper EJ. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID): data review and recommendations for diagnosing Clostridium difficile-infection (CDI). Clin Microbiol Infect 2009; 15: 1053-66. 7. Crobach MJ, Planche T, Eckert C i inni. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases: update of the diagnostic guidance document for Clostridium difficile infection. Clin Microbiol Infect 2016; 22: 63-81. 8. Culligan EP, Sleator RD. Advances in the Microbiome: Applications to Clostridium difficile Infection. J Clin Med 2016; 5. pii: E83. 9. Davies KA, Ashwin H, Longshaw CM i inni. Diversity of Clostridium difficile PCR ribotypes in Europe: results from the European, multicentre, prospective, biannual, point-prevalence study of Clostridium difficile infection in hospitalised patients with diarrhoea (EUCLID), 2012 and 2013. Euro Surveill 2016; 21. 10. Debast SB, Bauer MP, Kuijper EJ. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases: update of the treatment guidance document for Clostridium difficile infection. Clin Microbiol Infect 2014; 20: 1-26. 11. Denève C, Janoir C, Poilane I i inni. New trends in Clostridium difficile virulence and pathogenesis. Int J Antimicrob Agents 2009; 33: 24-8.

184 M. Aptekorz i G. Martirosian Nr 1 12. Eastwood K, Else P, Charlett A, Wilcox MH. Comparison of nine commercially available Clostridium difficile toxin detection assays, a real-time PCR assay for C. difficile tcdb, and a glutamate dehydrogenase detection assay to cytotoxin testing and cytotoxigenic culture methods. J Clin Microbiol 2009; 47: 3211-7. 13. Goldenberg SD, Cliff PR, Smith S i inni. Two-step glutamate dehydrogenase antigen real-time polymerase chain reaction assay for detection of toxigenic Clostridium difficile. J Hosp Infect 2010; 74: 48-54. 14. Hryniewicz W, Martirosian G, Ozorowski T. Zakażenia Clostridium difficile. Diagnostyka, terapia, profilaktyka. 2011. Narodowy Program Ochrony Antybiotyków. Warszawa. Narodowy Instytut Leków. 23. 15. Kelly CP. A 76-year-old man with recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea: review of C. difficile infection. JAMA 2009; 301: 954-62. 16. Khanna S, Pardi DS. The growing incidence and severity of Clostridium difficile infection in inpatient and outpatient settings. Expert Rev Gastroenterol Hepatol 2010; 4: 409-16. 17. Korman TM. Diagnosis and management of Clostridium difficile infection. Semin Respir Crit Care Med 2015; 36: 31-43. 18. Marsh JW, Arora R, Schlackman JL i inni. Association of relapse of Clostridium difficile disease with BI/NAP1/027. J Clin Microbiol 2012; 50: 4078-82. 19. Martin J, Wilcox MH. New and emerging therapies for Clostridium difficile infection. Curr Opin Infect Dis 2016; 29: 546-54. 20. McFarland LV. Antibiotic-associated diarrhea: epidemiology, trends and treatment. Future Microbiol 2008; 3: 563-78. 21. O Connor JR, Johnson S, Gerding DN. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology 2009; 136: 1913-24. 22. Planche T, Aghaizu A, Holliman R i inni. Diagnosis of Clostridium difficile infection by toxin detection kits: a systematic review. Lancet Infect Dis 2008; 8: 777-84. 23. Planche TD, Davies KA, Coen PG i inni. Differences in outcome according to Clostridium difficile testing method: a prospective multicentre diagnostic validation study of C difficile infection. Lancet Infect Dis 2013; 13: 936-45. 24. Rodrigues R, Barber GE, Ananthakrishnan AN. A Comprehensive Study of Costs Associated With Recurrent Clostridium difficile Infection. Infect Control Hosp Epidemiol 2017; 38: 196-202. 25. Sharp SE, Ruden LO, Pohl JC i inni. Evaluation of the C.Diff Quik Chek Complete Assay, a new glutamate dehydrogenase and A/B toxin combination lateral flow assay for use in rapid, simple diagnosis of Clostridium difficile disease. J Clin Microbiol 2010; 48: 2082-6. 26. She RC, Durrant RJ, Petti CA. Evaluation of enzyme immunoassays to detect Clostridium difficile toxin from anaerobic stool culture. Am J Clin Pathol 2009; 131: 81-4. 27. Shetty N, Wren MW, Coen PG. The role of glutamate dehydrogenase for the detection of Clostridium difficile in faecal samples: a meta-analysis. J Hosp Infect 2011; 77: 1-6. 28. Surawicz CM, Brandt LJ, Binion DG i inni. Guidelines for diagnosis, treatment, and prevention of Clostridium difficile infections. Am J Gastroenterol. 2013; 108: 478-98.

Nr 1 Diagnostyka zakażeń C. difficile 185 29. Tabak YP, Zilberberg MD, Johannes RS i inni. Attributable burden of hospital-onset Clostridium difficile infection: a propensity score matching study. Infect Control Hosp Epidemiol 2013; 34: 588-96. 30. Tenover FC, Baron EJ, Peterson LR, Persing DH. Laboratory diagnosis of Clostridium difficile infection can molecular amplification methods move us out of uncertainty? J Mol Diagn. 2011; 13: 573-82. 31. Vindigni SM, Surawicz CM. C. difficile Infection: Changing Epidemiology and Management Paradigms. Clin Transl Gastroenterol. 2015; 6: e99. 32. Wiegand PN, Nathwani D, Wilcox MH. Clinical and economic burden of Clostridium difficile infection in Europe: a systematic review of healthcare-facility-acquired infection. J Hosp Infect 2012; 81: 1-14. 33. Zheng L, Keller SF, Lyerly DM i inni. Multicenter evaluation of a new screening test that detects Clostridium difficile in fecal specimens. J Clin Microbiol 2004; 42: 3837-40. Otrzymano: 10 V 2017 r. Adres Autora: 40-055 Katowice, ul. Księcia Józefa Poniatowskiego 15, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Wydział Lekarski w Katowicach, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach