Profilaktyka w akwakulturze znane i mniej znane metody dezynfekcji Joanna Grudniewska, Elżbieta Terech Majewska* Instytut Rybactwa Śródlądowego w Olsztynie *Wydział Medycyny Weterynaryjnej UW-M w Olsztynie Wstęp Dezynfekcja jest jedną z metod profilaktyki ogólnej w chowie i hodowli ryb polegającą na przestrzeganiu zasad higieny poprzez stosowanie środków myjących czy biobójczych. Jej zadaniem jest zniszczenie drobnoustrojów (saprofitów, patogenów, potencjalnych patogenów) przez działanie na struktury komórkowe lub funkcje metaboliczne. Celem tych zabiegów jest niedopuszczenie do powstania i rozwoju choroby. Dezynfekcja w rybactwie może dotyczyć samego obiektu, wylęgarni, urządzeń i sprzętu rybackiego, jak również ikry i ryb w nim hodowanych. Można ją przeprowadzać w akwakulturze dwojako, przy użyciu środków chemicznych o raz metod fizycznych takich jak: czyszczenie mechaniczne, działanie wysoką temperaturą, bezpośrednie napromieniowanie słoneczne, napromieniowanie promieniami nadfioletowymi, wysuszenie, działanie ozonem. Metody chemiczne szeroko rozumianej dezynfekcji w akwakulturze na ogół sprowadzają się do stosowania wybranych preparatów biobójczych. Dobry preparat dezynfekcyjny musi cechować wysoki stopień biodegradacji oraz niska toksyczność, natychmiastowe działanie w niskich stężeniach na szerokie spektrum organizmów i brak narastania oporności drobnoustrojów. Istotna jest również duża trwałość koncentratu i roztworów roboczych w wodzie o zróżnicowanej temperaturze, dobra rozpuszczalność i wysoka tolerancja w stosunku do substancji organicznych. Skuteczny i dobrze działający dezynfektant powinien zawierać przede wszystkim substancję bądź substancje aktywne wykazujące działanie biobójcze. Może też zawierać w swoim składzie środek powierzchniowo czynny o właściwościach myjących, wypełniacz zwiększający efekt myjący i kompozycję zapachową oraz barwnik nadający kolor. Spośród różnych grup substancji czynnych używanych w dezynfekcji tylko trzy dysponują rzeczywiście szeroką skutecznością. Są to aldehydy, chlorowce i ich związki oraz nadtlenki. Są 156
zasadniczo w stanie zniszczyć lub inaktywować wszystkie bakterie łącznie z przetrwalnikami (Bacillus sp., Clostridinum sp.), grzyby łącznie z przetrwalnikami grzybów (np. Aspergillus niger) oraz wirusy łącznie z najbardziej odpornymi, bezosłonowymi wirusami hydrofilowymi (np. poliowirusem, wirusem zaplenia wątroby typu A). Chemioterapeutyki znane i najczęściej stosowane w profilaktyce oraz zwalczaniu niektórych chorób ryb. W hodowli ryb od lat stosuje się różne preparaty do dezynfekcji oraz profilaktycznych kąpieli ikry, narybku czy też ryb starszych w celu wyeliminowania drobnoustrojów chorobotwórczych bądź pasożytów zewnętrznych. Jednakże ze względu na ograniczenia środowiskowe i pozostałości w rybach nie wszystkie mimo wysokiej skuteczności jak np. zieleń malachitowa nadają się w chwili obecnej do wykorzystania w rybactwie. Do najczęściej stosowanych w chwili obecnej, według informacji uzyskanych od hodowców ryb należą: formalina, chloramina, chlorek sodu (sól), siarczan miedzi, jodofory oraz preparaty, których substancją czynna są nadtlenki. Na szczególną uwagę zasługują tu związki utleniające, do których oprócz nadtlenku wodoru, należą sole nadkwasów mineralnych, tj. nadmanganian potasu, nadsiarczan potasu (Virkon), nadwęglan sodu (Oxyper). Należą tu również coraz częściej stosowane w ostatnich latach w rybactwie i bardzo skuteczne preparaty produkowane na bazie kwasu nadoctowego i nadtlenku wodoru (Dezynfektant CIP, Oxim, Steridiale) tak zwane kwaśne preparaty dezynfekcyjne. Oprócz wysokiej aktywności w stosunku do mikroorganizmów preparaty te charakteryzują się niską toksycznością, wysokim stopniem biodegradacji. Preparaty, których aktywnym składnikiem są nadtlenki rozpadają się już podczas stosowania lub najpóźniej zaraz potem w ściekach, tworząc niegroźne pod względem ekologicznym produkty rozpadu, a tym samym tracąc właściwości toksyczne. Kwaśne preparaty dezynfekcyjne Kwaśne preparaty biobójcze stanowiące stabilizowaną mieszaninę kwasu nadoctowego, octowego, nadtlenku wodoru i wody, w ostatnich latach znalazły szerokie zastosowanie jako substancje dezynfekujące w przemyśle spożywczym, hodowli drobiu, ryb oraz przetwórstwie ryb. Kwas nadoctowy, który jest głównym składnikiem tych środków wyróżnia się szerokim zakresem działania na bakterie, 157
wirusy i grzyby. Wykazuje aktywność w zakresie niskich temperatur (<10 o C). Posiada wysoki potencjał oksydacyjny, dzięki któremu nieodwracalnie zaburza procesy enzymatyczne komórki, co w efekcie prowadzi do śmierci mikroorganizmu. Jego zawartość w kwaśnych preparatach waha się na poziomie 10-20 %. Produkty rozkładu kwasu nadoctowego to: kwas octowy, nadtlenek wodoru, tlen i woda. Nadtlenek wodoru jest drugim składnikiem omawianych preparatów i na ogół stanowi 20-40 %. Oba składniki zaliczane są do związków silnie utleniających. Działają aktywnie w niskich stężeniach, charakteryzują się wysoką aktywnością w stosunku do bakterii, grzybów i wirusów. Są powszechnie stosowane w preparatach dezynfekcyjnych i antyseptycznych z uwagi na szybkość działania i brak narastania oporności drobnoustrojów. Ich aktywność przeciw drobnoustrojowa jest najwyższa w stosunku do bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych oraz wirusów lipofilnych. Niektóre badania wykazały, że preparaty na bazie kwasu nadoctowego skutecznie hamują rozwój grzybów na inkubowanej ikrze pstrąga tęczowego. W materiałach szkoleniowych firmy Schering-Plough Animal Health, Gould (2005) podaje, że preparaty na bazie kwasu nadoctowego mogą być z powodzeniem stosowane w profilaktycznych kąpielach ryb przy zagrożeniu inwazją kulorzęska (Ichthyophthirius multifiliis). W badaniach własnych dotyczących możliwości stosowania kwaśnych preparatów dezynfekcyjnych w akwakulturze testowano trzy kwaśne preparaty o zbliżonym składzie (Steridial W-15, Oxim i Dezynfektant-CIP). Badania prowadzono w warunkach hodowli ryb łososiowatych oraz karpia. Wykonano badanie toksyczności ostrej i oznaczenie średniego stężenia śmiertelnego LC 50 preparatu Dezynfektant-CIP oraz określono efektywne stężenia tego preparatu w profilaktycznych i leczniczych kąpielach narybku pstrąga i karpia. Ponadto przeprowadzono ocenę skuteczności preparatu w zwalczaniu wybranych pasożytów patogennych dla ryb i biobójczego działania na niektóre bakterie i wirusy. Wyliczone LC 50 preparatu Dezynfektant CIP, po 24 h dla karpia wynosiło 40,7 mg l -1, a dla pstrąga 17 mg l -1, co pozwala zaliczyć badany preparat do 3 klasy toksyczności substancji średnio toksycznych (Svobodowa i in.1991). Dezynfektant- CIP jest bardziej toksyczny dla pstrąga tęczowego niż karpia. Ocena biobójczego działania dwóch preparatów: Dezynfektant-CIP i Steridial- W15, na wybrane bakterie chorobotwórcze dla ryb wykazała, że oba kwaśne preparaty wykazywały biobójcze działanie w stosunku do bakterii Aeromonas 158
hydrophila i Yersinia ruckeri w stężeniu 0,01% i powyżej, podobnie dla Staphyloccocus aureus w stężeniu 0,01% nie zanotowano wzrostu bakterii. W przypadku bakterii Escherichia coli skutecznie redukowały ich liczbę dopiero w stężeniu 0,05%. Bakterie Peudomonas aeruginosa były wrażliwe na preparat Dezynfektant-CIP w stężeniu 0,1% i powyżej, w koncentracji 0,5 % działał biobójczo na Aeromonas sobria, a w 1% na bakterie Schewanella putrefaciens. Ocena wirusobójczego działania preparatu dezynfekcyjnego Dezynfektant CIP wykazała hamujące działania preparatu w zależności od stężenia na wirusy z rodziny: Rhabdoviridae, Birnaviria, Herpesviridae. Badany preparat w stężeniu 0,25% działał hamująco tylko na namnażanie się wirusa IHN wywołującego zakaźna martwicę układu krwiotwórczego u ryb łososiowatych. W stężeniu 0,5 %, hamował rozwój wirusów będących czynnikiem etiologicznym: wirusowej posocznicy łososiowatych (VHS), wiosennej wiremii karpia (SVC), oraz zakażenie herpeswirusem karpia koi (KHV/CNGV). Wirus IPN wywołujący zakaźną martwicę trzustki był najbardziej oporny i Dezynfektant CIP dopiero w stężeniu 1% hamował jego rozwój. Na podstawie uzyskanych wyników należy stwierdzić, że preparat Dezynfektant CIP może być z powodzeniem stosowany w odpowiednim stężeniu w profilaktyce i zwalczaniu, polegającym na doraźnej likwidacji ogniska zakażenia, następujących chorób ryb: - posocznica ryb łososiowatych (Aeromonas hydrophila) - jersinioza zwana też choroba czerwonej gęby (Yersinia ruckerii) - wirusowa krwotoczna posocznica (VHS) - zakaźna martwica układu krwiotwórczego (IHN) - zakaźna martwica trzustki (IPN) - wiosenna wiremia karpi (SVC) - zakażenie herpeswirusem karpia koi (KHV/CNGV) W wylęgarni kwaśne preparaty dezynfekcyjne hamują rozwój grzybów pleśniowych z rodzaju Saprolegnia i Achlya rozwijających się na martwej ikrze pstrąga tęczowego podczas inkubacji w aparatach długostrumieniowych i wykazują podobny efekt profilaktyczno terapeutyczny do formaliny. W okresie podchowu ryb możliwe jest przeprowadzanie co dwa, trzy dni przez 20-30 min profilaktycznych kąpieli narybku pstrąga tęczowego w preparacie Dezynfektant CIP stosując dawkę od 4 do 25 ml/m 3. Przeprowadzone badanie skuteczności preparatu Dezynfektant- CIP podczas leczniczych kąpieli ryb zainfekowanych kulorzęskiem (Ichthyophthirius 159
multiphillis) wykazały, że codzienne 20 min kąpiele ryb przez 5 dni w tym preparacie hamowały rozwój różnych stadiów rozwojowych kulorzęska na skórze i skrzelach. Najlepsze efekty kąpieli wyrażone spadkiem ilości pasożytów w badanym materiale widoczne były w grupie ryb kąpanych w stężeniu 20 i 23 ml/m 3. Dla narybku karpia zainfekowanego pierwotniakiem z rodzaju Trichodina wykonane kąpiele w koncentracji 30 i 40 ml/m 3 Dezynfektanta CIP, przy temperaturze wody 14 o C okazały się skuteczne. Kwaśne preparaty dezynfekcyjne przeznaczone są do utrzymania higieny weterynaryjnej w miejscach hodowli, przetrzymywania i transportu zwierząt oraz do dezynfekcji powierzchni mających kontakt z żywnością. Skutecznie dezynfekują wodę w obiegach zamkniętych. Usuwają grzyby, pleśń, glony, mchy z powierzchni murowanych i drewnianych. Stosując roztwór 0,1-0,5 % przy kontakcie 20-30 min można przeprowadzać dezynfekcję sprzętu i urządzeń hodowlanych. Roztwór 1-2% doskonale usuwa osad ze szklanych i plastikowych urządzeń wylęgarniczych oraz basenów. Nowe możliwości dezynfekcji w akwakulturze Dwutlenek chloru Dwutlenek chloru to utleniający biocyd i toksyna metaboliczna podobnie jak ozon i chlor. Oznacza to, że dwutlenek chloru zabija mikroorganizmy poprzez zakłócenie procesu transportu składników odżywczych przez ich ściany komórkowe, a nie przez zakłócenie procesów metabolicznych. Już w latach 40-ch XX wieku wykazywano wysoką aktywność bakteriobójczą ClO 2 przewyższającą aktywność tzw. chloru aktywnego. Jednakże ze względu na wykorzystywanie oraz wprowadzanie do wody, gazowej formy tego związku, posiadającej właściwości toksyczne i wybuchowe, co stwarzało dodatkowe zagrożenie, metoda ta była rzadko stosowana w dezynfekcji wody. Istotnym momentem w rozpowszechnieniu tej metody dezynfekcji było wyprodukowanie, stabilizowanego dwutlenek chloru ClO 2 w roztworze wodnym. Stabilizacja ClO 2 zapewniona jest przez utrzymanie ph roztworu w granicach 9 9,5. Dodatek kwasu aktywuje ten środek odkażający. Obecnie dwutlenek chloru - ClO 2 znalazł zastosowanie w wielu krajach (USA, Niemcy, Włochy, Francja) przede wszystkim do dezynfekcji wody i powoli zastępuje chlor (Cl 2 ). Dwutlenek chloru osiąga wysoką efektywność względem Escherichia Coli oraz 160
Bacillus anthracoides, wyższą od chloru aktywność bakteriobójczą ClO 2 wykazano w dezaktywacji Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Legionella Pneumophila oraz spor Bacillus megatherium. Aktywność porównywalną z chlorem wykazano także w przypadku szczepów Salmonella typhosa oraz Salmonella paratyphi. Dwutlenek chloru stosowany jest do dezynfekcji wody, a także w przemyśle papierniczym do wybielania papieru i w przemyśle spożywczym do typowej dezynfekcji. W przypadku dezynfekcji wody okazuje się być skuteczniejszy niż podchloryn. Może być wykorzystany do hamowania zakwitu glonów w zbiornikach wodnych. Dwutlenek chloru obok chloraminy, formaliny, Virkonu, jodoforów zaliczany jest do skutecznych dezynfektantów stosowanych w akwakulturze ryb łososiowatych w Chile, Szkocji i Kanadzie Skuteczny jest w niskich stężeniach od 1 do 25 mg l -1, wykazuje szybkie działanie bakteriobójcze, większość bakterii niszczy w ciągu kilku sekund. Jest skuteczny w usuwaniu biopowłoki biofilmu, posiada 2.6 razy większe właściwości utleniające niż chlor w szerokim zakresie temperatur. Skutecznie działa w szerokim zakresie ph (ph2 - ph12 ). Nie chloruje substancji organicznych i nie reaguje z amoniakiem, nie tworzy kwasów chlorowodorowych jak czyni to chlor. Wykazuje niską korozyjność, jest bezzapachowy i 5 razy bardziej rozpuszczalny w wodzie niż chlor. Nie pozostawia szkodliwych pozostałości w wodzie i nie wymaga neutralizacji. Badania własne przeprowadzone podczas profilaktycznych kąpieli w dwutlenku chloru, narybku pstrąga tęczowego z objawami choroby fin rot wskazują na skuteczność takich kąpieli. Można je przeprowadzać co drugi dzień przez 20 minut w stężeniu 5 mg l -1 i przynoszą one pozytywny efekt. Ubytki w płetwach ryb kąpanych były znacznie mniejsze i płetwy goiły się znacznie szybciej niż u ryb kąpanych w chloraminie i nie kąpanych. Nanocząsteczki i nanokoloidy Nanocząstki to obiekty, których co najmniej jeden z wymiarów nie przekracza 100 nm. Istnieją one w przyrodzie lub mogą być wytwarzane w wyniku ludzkiej działalności, w sposób zamierzony lub niezamierzony. Nanotechnologia to ogólna nazwa całego zestawu technik i sposobów tworzenia struktur o rozmiarach nanometrycznych. Obecnie materiały w skali nano znajdują zastosowanie w wielu dziedzinach, począwszy od elektroniki, poprzez medycynę, kosmetologię, na motoryzacji i budownictwie kończąc. W roku 2004 na świecie wyprodukowano 2 000 161
ton nanomateriałów o zaprojektowanym kształcie i składzie chemicznym. W latach 2011 2020 przewidywany jest wzrost tej produkcji do poziomu 58 000 ton. Jednym z kryteriów podziału nanocząstek jest ich skład chemiczny. Można je podzielić na dwie grupy: nanocząstki organiczne i nieorganiczne. Do pierwszej grupy zalicza się wirusy, fulereny i nanorurki węglowe. Przedstawicielami grupy drugiej są metale (Ag, Au, Cu), tlenki metali i sól morska. Antybakteryjne właściwości nanocząstek srebra wynikają z ich niewielkiego rozmiaru i rozwiniętej powierzchni. Pozwala to niezwykle łatwo przenikać im przez błony biologiczne i wnikać do wnętrza mikroorganizmów powodując ich obumieranie. Nanopreparaty miedziowe wykazują silne działanie grzybobójcze. Złoto w postaci nano ma wielką łatwość wnikania do wnętrza komórek organizmu i działa na nie silnie pobudzająco i regenerująco. Nanokoloidy to metal rozbity na niewyobrażalnie małe cząstki zawierające po około 500 atomów każda, rozproszone w wodzie. Są tak małe, że można je zobaczyć tylko pod mikroskopem elektronowym: dziesięć razy mniejsze od najmniejszych wirusów, dwieście razy mniejsze od najmniejszych bakterii. Nanokoloidy mają unikalną strukturę, są odporne na światło, nie zawierają zanieczyszczeń, są niezwykle aktywne biobójczo już przy bardzo małych stężeniach. Jony srebra Ag+ oraz nanosrebro znane już jest od czasów starożytnych. W Starożytnym Babilonie do przedłużania trwałości mleka używano naczyń srebrnych lub ceramicznych do których wkładano srebrene monety. W Średniowieczu konserwowano żywność w solance i naczyniach srebrnych. W późniejszym czasie zaczęto używać masowo srebrnych zastaw jako chroniących przed zatruciem. Wyniki badań laboratoryjnych wykonanych na zlecenie producentów koloidów miedzi, tytanu i srebra wskazują na silne działanie biobójcze tych substancji. Preparaty miedzi i srebra wykazywały silniejsze działanie bakteriobójcze wobec Pseudomonas aeruginosa, aniżeli wobec Staphylococcus ureus. Woda z nanomiedzią wykazuje właściwości antybakteryjne w stosunku do większości grup tlenowych bakterii izolowanych z powierzchni skóry - znacząco redukuje liczbę drobnoustrojów. Oznacza to, że wyrób stosowany na powierzchnię skóry chroni ją przed infekcjami bakteryjnymi oraz zapobiega powstawaniu zakażeń skórnych.. Ponadto koloidy nanomiedzi wykazują właściwości antygrzybicze w stosunku do patogenów Candida albicans grzybów drożdżoidalnych, odpowiedzialnych za zakażenia grzybicze. 162
Badania własne (Kazuń i in. 2008) potwierdziły biobójcze działanie srebra koloidalnego zarówno w akwarystyce jak i w warunkach laboratoryjnych. U ryb pielęgnicowatych z objawami infekcji bakteryjnej poddanych kąpielom w roztworze koloidu srebra stwierdzono poprawę stanu zdrowotnego, jednak dla niektórych gatunków ryb akwaryjnych w tych samych stężeniach koloid okazał się śmiertelny. U karpia koi z objawami infekcji grzybiczej na skórze po kąpielach w roztworze koloidu srebra obserwowano zmniejszenie ilości kłaczków pleśni na powierzchni i ograniczenie ognisk inwazji. W badaniach toksykologicznych koloidu srebra stwierdzono, że wykazuje on różny stopień toksyczności dla różnych gatunków ryb. Wykonane badania własne sugerują możliwość wykorzystania nanokoloidów u ryb łososiowatych, okoniowatych i szczupaka, przy niskiej temperaturze wody gdy skuteczność innych chemioterapeutyków jest bardzo niska. Ryby łososiowate były obiektem badań z nanocząsteczkami w innych krajach (Buridge i in. 2010). W akwakulturze i przetwórstwie ryb istnieje możliwość wykorzystania nanocząsteczek w dezynfekcji i konserwacji mięsa. Nanocząsteczki można wykorzystywać do neutralizacji toksyn, poprzez budowę filtrów wodnych, które usuwają np. pestycydy chloroorganiczne. Filtry takie działają na zasadzie adsorpcji zanieczyszczeń, a następnie ich katalitycznej neutralizacji. Na rynku pojawił się filtr zawierający nanocząstki srebra, których rozmiar mieści się w granicach 60-80 nanometrów. Srebro jest naniesione na podłoże z tlenku glinu. Jeden taki filtr pozwala oczyścić około 6000 litrów wody. Zużyty filtr można poddać recyklingowi i odzyskać srebro. Przewiduje się, że wykorzystanie nanotechnologii stworzy całkiem nowe możliwości w rolnictwie, ochronie środowiska i technologii żywności. Nanocząstki będzie można wykorzystać do monitorowania żywności i wody do picia, do wykrywania obecności związków szkodliwych, np. metali ciężkich i gazów trujących. Szkodliwy wpływ nanocząsteczek na organizmy żywe został potwierdzony w wielu badaniach istnieje też niebezpieczeństwo obciążenia środowiska wodnego po wprowadzeniu ich do wody (Handy i in. 2008). Wykazano, że toksyczność nanocząstek metali zależy od rozmiaru, kształtu, składu chemicznego, zdolności do agregacji oraz rozpuszczalności. Nanotechnologia może wpłynąć na polepszenie warunków życia i pracy człowieka. Należy jednak pamiętać także o potencjalnym szkodliwym działaniu nanocząstek na człowieka i środowisko, wynikającym z ich specyficznych 163
właściwości fizycznych i chemicznych. Zakres potencjalnie szkodliwego działania nanocząstek na organizm człowieka i środowisko nie w pełni jest jeszcze zdefiniowany, ponieważ odkrywanie stale nowych zastosowań nanoproduktów może nieść za sobą nieuświadomione dzisiaj zagrożenia. Literatura jest dostępna u autorów publikacji. 164