Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO 2010 identyfikacja i lekowrażliwość pałeczek Enterobacteriaceae

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2011 Volume 47 Number 1 31-38 Kontrola jakości Quality Control Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO 2010 identyfikacja i lekowrażliwość pałeczek Enterobacteriaceae Polish National External Quality Assessment Scheme in Microbiological Diagnostics - POLMICRO 2010 identification and microbial susceptibility Enterobacteriaceae Ewa Młodzińska 1, Elżbieta Stefaniuk 1,2, Beata Chmylak 1, Anna Baraniak 2, Waleria Hryniewicz 1,2 1 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej, Warszawa, 2 Narodowy Instytut Leków, Warszawa Streszczenie Praca przedstawia wyniki XVII edycji Ogólnopolskiego Sprawdzianu Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO 2010. W roku 2010 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (COBJDM) zorganizował dwa typy sprawdzianów: jeden przeznaczony dla laboratoriów świadczących diagnostykę w szerokim zakresie oraz drugi - oddzielny sprawdzian przeznaczony dla pracowni schorzeń jelitowych stacji sanitarno-epidemiologicznych. W ramach sprawdzianu COBJDM przygotował i rozesłał do laboratoriów następujące izolaty pałeczek Gram-ujemnych z rodziny Enterobacteriacaeae: Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli Salmonella Anatum, Salmonella Concord, Salmonella Mbandaka, Salmonella Elisabethville, Salmonella Isangi, Salmonella Montevideo. Izolaty charakteryzowały się różnymi fenotypami wrażliwości na leki oraz różnymi mechanizmami oporności. Zadaniem laboratoriów była identyfikacja badanych izolatów do poziomu gatunku oraz określenie lekowrażliwości na wszystkie wymienione w ankiecie antybiotyki i chemioterapeutyki oraz podanie informacji o wykrytych mechanizmach oporności. Summary The objective of this study was to analyse and discuss the results of 16th edition of Polish National External Quality Assessment Scheme in Microbiological Diagnostics - POLMICRO 2010. In 2010 two different types of proficiency programme were organised. The first one was aimed at laboratories providing a broad spectrum of microbiological diagnostics. The second, was prepared for enteric diseases laboratories in sanitary inspection. In 2010 edition the following Enterobacteriaceae strains were distributed by the Centre of Quality Control in Microbiology (CQCM): Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli Salmonella Anatum, Salmonella Concord, Salmonella Mbandaka, Salmonella Elisabethville, Salmonella Isangi, Salmonella Montevideo.The distributed isolates present different susceptibility patterns and different mechanisms of resistance. The task of the laboratory was to identify to the species level every strain and to determine their susceptibility to all antibiotics listed in the questionnaire. The laboratories were also obliged to interpret and comment detected resistance mechanisms. Słowa kluczowe: zewnątrzlaboratoryjny sprawdzian wiarygodności, identyfikacja, lekowrażliwość, mechanizmy oporności Key words: external quality assessment scheme, identification, susceptibility to antimicrobial agents, resistance s mechanisms Wstęp W roku 2010 polskie laboratoria mikrobiologiczne uczestniczyły w XVII edycji Ogólnopolskiego Sprawdzianu Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO. Program organizowany jest od roku 1994, początkowo przez Komisję Standaryzacji i Kontroli Jakości Badań Laboratoryjnych i Mikrobiologicznych przy Departamencie Polityki Zdrowotnej Ministerstwa Zdrowia i Opieki Społecznej przy współpracy z Krajowym Zespołem Konsultanta Medycznego ds. Mikrobiologii, a od roku 1997 przez Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej, powołany przez Ministra Zdrowia i Opieki Społecznej. Celem programu jest edukacja i ocena kompetencji laboratoriów mikrobiologicznych w zakresie oznaczania lekowrażliwości i wykrywania mechanizmów oporności na leki drobnoustrojów wywołujących zakażenia. 31

Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO 2010... Program POLMICRO łączy w sobie badania biegłości i porównania międzylaboratoryjne, ma zasięg ogólnopolski, a w kolejnych edycjach programu poruszane są zarówno najnowsze problemy z zakresu klinicznej diagnostyki mikrobiologicznej, jak i te, znane od wielu lat. W ramach XVII edycji POLMICRO w roku 2010, do sprawdzianu przystąpiło 551 laboratoriów mikrobiologicznych, czyli o 14 laboratoriów więcej niż w 2009r. Laboratoria różniły się między sobą statusem jednostki, wielkością i spektrum wykonywanej diagnostyki mikrobiologicznej, liczba personelu, systemem pracy. Najliczniejsza grupę, podobnie jak w latach ubiegłych, stanowiły laboratoria medyczne, szpitalne i pozaszpitalne, publiczne i niepubliczne, ale wzrosła w porównaniu z rokiem 2009 także liczba laboratoriów inspekcji sanitarnej. Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej od roku 2005 organizuje dwa rodzaje sprawdzianów: sprawdzian POLMICRO 2010 - dla laboratoriów klinicznych i innych świadczących szeroką diagnostykę mikrobiologiczną oraz sprawdzian POLMICRO 2010/SSE - dla pracowni/laboratoriów schorzeń jelitowych. Łącznie zorganizowano cztery tury sprawdzianów, po dwie w każdej edycji. Tematem pracy jest omówienie wyników XVII edycji POLMICRO 2010. Materiał i metody Laboratoria, w ramach każdej z tur XVII edycji sprawdzianu POLMICRO 2010, otrzymały ustalony komputerowo zestaw izolatów zakodowanych wielkimi literami od A do D (Tabela 1). Do szczepów dołączona była szczegółowa instrukcja postępowania z badanymi szczepami drobnoustrojów, a także informacja dotycząca zasad udzielania odpowiedzi, wnoszenia i rozpatrywania reklamacji. Zadaniem laboratoriów była identyfikacja badanych izolatów do poziomu gatunku oraz określenie lekowrażliwości na wymienione w ankiecie antybiotyki i chemioterapeutyki oraz podanie informacji o wykrytych mechanizmach oporności. Uzyskane wyniki należało przesłać drogą elektroniczną do Centralnego Ośrodka, poprzez wypełnienie ankiety dostępnej dla każdego laboratorium, na stronie internetowej Ośrodka www.polmikro.edu.pl. Wyniki lekowrażliwości podlegały ocenie tylko w przypadku prawidłowej identyfikacji badanego szczepu do poziomu gatunku. Ocena popełnianych błędów w oznaczaniu lekowrażliwości zgodna była z zaleceniami Centers for Disease Control and Prevention (CDC) w Atlancie. Błędy oznaczania lekowrażliwości podzielono na trzy kategorie: małe, duże i bardzo duże błędy. Małe błędy polegają na zaliczeniu szczepu średniowrażliwego jako wrażliwy lub oporny, do tego rodzaju błędów zalicza się też uznanie szczepu wrażliwego lub opornego za średniowrażliwy. Błędy duże polegają na podaniu, że szczep wrażliwy jest oporny. Bardzo duży błąd (VME - very major error) oznacza określenie szczepu opornego jako wrażliwy na dany antybiotyk/chemioterapeutyk. Wystąpienie VME jest najpoważniejszym błędem i laboratorium za taki błąd przyznawana jest ocena negatywna w sprawdzianie. Wyniki i omówienie I tura programu POLMICRO 2010 (edycja ogólna) W I turze edycji ogólnej sprawdzianu przygotowano zestawy kontrolne złożone z trzech izolatów bakteryjnych. Szczepy wysłano do 471 laboratoriów mikrobiologicznych, odpowiedź otrzymano od 454 uczestników. Tabela I. Izolaty bakteryjne wykorzystane w sprawdzianie POLMICRO 2010 (XVII edycja). Tura Gatunek drobnoustrojów Numer kolekcji POLMICRO Mechanizm oporności POLMICRO 2010 (edycja ogólna) I Klebsiella pneumoniae PM-155 ESBL-ujemny, MBL-dodatni, KPC-ujemny Klebsiella pneumoniae PM-159 ESBL +/-, MBL-ujemny, KPC-ujemny Klebsiella pneumoniae PM-162 ESBL +/-, MBL-ujemny, KPC-ujemny Klebsiella pneumoniae PM-163 ESBL dodatni, MBL-ujemny, KPC-ujemny Klebsiella pneumonice ATCC 700603 PM-36 ESBL dodatni, MBL-ujemny, KPC-ujemny II Klebsiella pneumoniae PM-155 ESBL-ujemny, MBL-dodatni, KPC-ujemny Klebsiella pneumoniae PM-159 ESBL +/-, MBL-ujemny, KPC-ujemny Klebsiella pneumoniae PM-162 ESBL +/-, MBL-ujemny, KPC-ujemny POLMICRO 2010/SSE I Salmonella Anatum PM-165 ESBL-ujemny Salmonella Concord PM-166 ESBL-dodatni Salmonella Mbandaka PM-167 ESBL-ujemny Salmonella Elisabethville PM-168 ESBL-ujemny II Salmonella Isangi PM-169 ESBL-ujemny Salmonella Montevideo PM-170 ESBL-ujemny Escherichia coli PM-171 ESBL-ujemny ESBL β-laktamza o rozszerzonym spectrum substratowym (ang. extendend spectrum β-lactamase), MBL metoalo- β-laktamza, KPC karbapenemaza Klebsiella pneumonice 32

E. Młodzińska i inni Jedno laboratorium odesłało pustą ankietę i w związku z tym do oceny zakwalifikowano 453 laboratoria. Negatywny wynik końcowy niniejszej edycji przyznano 95 laboratoriom, co stanowiło 21 % ogółu laboratoriów przystępujących do sprawdzianu. Identyfikacja szczepów nie sprawiła laboratoriom trudności, w ogólnej puli wyników (n=1359) były tylko 2 błędne: jednokrotnie izolat K. pneumoniae PM-155 zidentyfikowano jako Serratia filaria, a izolat PM-159 jako Enterobacter agglomerans. Natomiast, w oznaczaniu mechanizmów oporności zanotowano znaczne rozbieżności. Najsłabiej wypadło oznaczanie MBL (metalo-β-laktamaz), których wykrywanie było wielokrotnie tematem kursów, szkół mikrobiologicznych, omawiane było także przy okazji poprzednich edycji POLMICRO. Po wnikliwej analizie uznano, że przyczyną błędnych odpowiedzi nie był brak wiedzy personelu laboratoriów w tym zakresie, a brak podstawowych odczynników do wykrywania tego mechanizmu (EDTA), bądź niewłaściwy dobór metod i w związku z tym niewłaściwe stosowanie testów i odczynników (np. E-testy do wykrywania MBL u pałeczek Enterobacteriaceae). Gdyby ocena ogólna laboratoriów została dokonana ściśle według kryteriów przyjętych w programie POLMICRO, bez analizy wyników dla poszczególnych laboratoriów, ponad 70% (n=320) laboratoriów uzyskałoby ocenę negatywną. Jednakże, wzorem poprzednich edycji POLMICRO, COBJDM zadecydował o wyłączeniu z oceny końcowej trzech najbardziej problematycznych szczepów bakteryjnych (PM-155, PM-159 i PM-162), mimo, że nie były one najtrudniejsze do diagnostyki. Zdecydowanie lepiej wypadły oznaczenia dla izolatów o bardziej skomplikowanych fenotypach oporności. W związku z powyższym, ocena końcowa została przyznana na podstawie dwóch pozostałych izolatów. Poniżej przedstawiono szczegółowe omówienie poszczególnych izolatów. K. pneumoniae PM-155 szczep wytwarzający karbapenemazy klasy B MBL (metalo-β- laktamazę). Szczep ten wykazywał oporność lub obniżoną wrażliwość na większość antybiotyków β-laktamowych. Izolat otrzymały 152 laboratoria, wytwarzanie MBL wykryło blisko 81% laboratoriów. Rycina 3 przedstawia mechanizm MBL, natomiast rycina 4 przedstawia test na ESBL w omawianym szczepie. Rycina 3. Szczep PM-155 MBL (+) Rycina 4. Szczep PM-155 ESBL(-) Rycina 1. Przykłady obrazów uzyskiwanych dla szczepów Enterobacteriaceae MBL+. Rycina 2. Przykłady obrazów uzyskiwanych dla szczepów Enterobacteriaceae KPC+. Cechą niezwykle utrudniającą wykrycie mechanizmu MBL u pałeczek jelitowych jest to, że w tej grupie szczepów, oprócz szczepów przejawiających ewidentną oporność in vitro na wszystkie substraty MBL czyli penicyliny, cefalosporyny i karbapenemy, a także połączenia β-laktamów z inhibitorami, częściej izoluje się szczepy wykazujące średnią wrażliwość lub wrażliwość na część z wymienionych grup leków, zwłaszcza karbapenemy. Według zaleceń CLSI w przypadku stwierdzenia obecności karbapenemazy należało oznaczyć wartość MIC karbapenemów i zamieścić tę wartość na wyniku bez podawania interpretacji. Na wyniku badania powinna być wskazana terapia alternatywna do β-laktamów, lekarz klinicysta i zespół ds. kontroli zakażeń powinni być natychmiast poinformowani o możliwym zagrożeniu. Zgodnie z zaleceniami EUCAST szczepy wytwarzające MBL należało interpretować z definicji jako niewrażliwe na karbapenemy i inne β-laktamy z wyjątkiem aztreonamu, który należało raportować zgodnie z wynikiem oznaczenia. Rozbieżności w udzielonych przez laboratoria odpowie- 33

Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO 2010... dziach spowodowane były tym, że część laboratoriów postąpiła zgodnie z zaleceniami CLSI, a część zgodnie z zaleceniami EUCAST. Ze względu na zaistniałe różnice pomiędzy zaleceniami CLSI i EUCAST, nie poddawano ocenie interpretacji klinicznej dla piperacyliny z tazobaktamem, ceftazydymu i karbapenemów. Zalecenia EUCAST będą w Polsce obowiązywały od 1 kwietnia 2011r. Zmieni się wtedy także metodyka oznaczania mechanizmów oporności i ich interpretacja. Procedury diagnostyczne przytoczone w niniejszym omówieniu obowiązywały w roku 2010 i do dnia wprowadzenia zaleceń europejskich. Szczepy MBL-dodatnie i KPC-dodatnie (wytwarzające karbapenemazę Klebsiella pneumoniae) powinno się wykrywać i bez względu na wynik antybiogramu kwalifikować jako jedne z najgroźniejszych patogenów bakteryjnych. Szczepy K. pneumoniae PM-159 i PM-162 były wieloopornymi szczepami nie wytwarzającymi MBL i KPC. Zgodnie z Rekomendacjami Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów w przypadku stwierdzenia fenotypu niezależnej od kwasu klawulanowego oporności na penicyliny, cefalosporyny i monobaktamy, po wykluczeniu obecności AmpC nie można odrzucić możliwości wytwarzania ESBL przez takie szczepy, maskowanej przez silne obniżenie przepuszczalności osłon komórkowych bakterii. W rutynowym laboratorium mikrobiologicznym nie jest możliwe określenie, czy szczep jest producentem ESBL czy nie. W związku z tym w tabelach z oceną w wynikach referencyjnych dla obu szczepów PM159 i PM- 162- pojawiła się *, a w polu z oceną brak oceny. K. pneumoniae PM-159 izolat ten otrzymały 142 laboratoria, aż 69 (48,6%) z nich określiło szczep jako MBL dodatni. Ryciny 5 i 6 przedstawiają mechanizmy oporności szczepu. Rycina 5. Szczep PM-159 MBL(-) Rycina 6. Szczep PM-159 - ESBL (+/-) K. pneumoniae PM-162-149 laboratoriów otrzymało szczep - 103 (69%) oznaczyło szczep jako MBL-dodatni, 20 (13.4%) określiło szczep jako KPC-dodatni. Ryciny 7 i 8 przedstawiają omawiane mechanizmy oporności. Rycina 7. Szczep PM-162 MBL(-) Rycina 8. Szczep PM-162 - ESBL (+/-) K. pneumoniae PM-163 szczep produkujący ESBL i AmpC, nie wytwarzający MBL i KPC. Wykrycie ESBL w tym szczepie było możliwe po przeprowadzeniu testu podstawowego na podłożu z kloksacyliną (250 µg/ml), która jest inhibitorem AmpC. Na podstawie testu z kwasem boronowym można było uznać szczep jako producenta KPC. Szczep ten otrzymały wszystkie laboratoria n=454, szesnaście (3.5%) z nich wykryło KPC. Laboratoriom, które stwierdziły obecność KPC w szczepie PM-163 nie uznawano tej odpowiedzi za niepoprawną. Wielu uczestników przesłało drogą e-mailową obszerne komentarze dotyczące niniejszej edycji, w których sygnalizowały, że szczep może być producentem KPC, co należy potwierdzić w laboratorium referencyjnym; takie postępowanie jest jak najbardziej prawidłowe. Uzyskane we wszystkich laboratoriach biorących udział w tej turze sprawdzianu wyniki wrażliwości szczepu PM-163 na wybrane leki (wielkości stref zahamowania wzrostu) przedstawiono w postaci wykresów (rycina 13.). Wśród rozesłanych w ramach programu szczepów trzy były producentami β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) PM-163, PM-36 i PM 164. Ponad 90% laboratoriów nie miało trudności z poprawnym oznaczeniem tego mechanizmu. Izolat K. pneumoniae PM-163-otrzymały wszystkie laboratoria n=453 i 38 (8,4%) nieprawidłowo oznaczyło ESBL; PM-164 otrzymały 304 laboratoria i tylko trzy oznaczyły mechanizm nieprawidłowo, a w szczepie PM- 36- (n=159) tylko 2 odpowiedzi były błędne. 34

E. Młodzińska i inni K. pneumoniae PM-36 szczep z kolekcji ATCC 700603, ESBL-dodatni, służący do kontroli jakości oznaczania ESBL jako kontrola pozytywna. Ryciny 9 i 10 przedstawiają mechanizmy oporności szczepu. Rycina 11. Szczep PM-164 MBL(-) Rycina 9. Szczep MBL(-) PM-36 Rycina 12. zczep PM-164- ESBL (+) Rycina 10. Szczep ESBL (+) PM-36- K. pneumoniae PM-164 - szczep z kolekcji MIKROBANK 10021, ESBL-dodatni służący do kontroli jakości oznaczania ESBL testem dwóch krążków. Ryciny 11 i 12 przedstawiają mechanizmy oporności szczepu. Aby zrównać szanse wszystkim uczestnikom Programu PO- LMICRO, Laboratoriom, które nie popełniły żadnego błędu w szczepach wyłączonych z oceny, natomiast popełniły 1 błąd bardzo duży dla pozostałych izolatów, przyznawano pozytywną ocenę końcową. Pozytywny wynik I tury sprawdzianu POLMICRO 2010 uzyskało 79% laboratoriów biorących udział w programie. Podczas oceny I tury sprawdzianu POLMICRO 2010 opracowano Cztery kroki wykrywania karbapenemaz w szczepach Enterobacteriaceae : KROK 1: Oznaczenie wrażliwości na trzy karbapenemy: imipenem (10µg), meropenem (10µg), ertapenem (10µg) KROK 2: Obniżenie wrażliwości in vitro na którykolwiek z karbapenemów, jest sygnałem do wykonania testów potwierdzających (KROK 3) KROK 3: Schemat postępowania ze szczepami podejrzanymi o wytwarzanie karbapenemaz przeprowadza się je równocześnie w kierunku MBL i KPC: Wykrywanie karbapenemaz MBL przy pomocy testu zbliżeniowego z zastosowaniem krążków z EDTA jako inhibitora tych enzymów oraz krążków z imipenemem (10µg) i ceftazydymem (30µg). Wynik odczytujemy jako pozytywny, jeśli strefa zahamowania wzrostu wyraźnie powiększa się (rozszerza się) wokół krążka z ceftazydymem i/lub imipenemem od strony krążka zawierającego EDTA. Wykrywanie karbapenemaz KPC przy pomocy testu kombinowanego z kwasem boronowym jako inhibitorem tego enzymu, w którym na krążki z imipenemem (10µg) i meropenemem (10µg), lub tylko z meropenemem podaje się kwas boronowy i bada się różnicę stref zahamowania wzrostu wokół krążka z karbapenemem i inhibitorem oraz krążka z samym karbapenemem. Wynik odczytujemy jako pozytywny, jeśli różnica stref zahamowania wzrostu wokół krążka z którymkolwiek z karbapenemów i inhibitorem oraz krążka z samym karbapenemem wyniesie 5 mm lub więcej. Uwaga: Kwas boronowy jest również dobrym inhibitorem cefalosporynaz AmpC. Omawiany test może dawać fałszywie pozytywne wyniki w przypadku szczepów Enterobacteriaceae posiadających obniżoną przepuszczalność osłon komórkowych oraz wytwarzających te enzymy na wysokim poziomie. Mogą to być szczepy gatunków będących naturalnymi producentami AmpC (np. Enterobacter cloaceae, Citrobacter freundii), bądź też szczepy innych gatunków, które nabyły geny tych β-laktamaz. KROK 4: Szczep podejrzany o wytwarzanie karbapenemaz powinien być przesłany do laboratorium referencyjnego w celu jednoznacznego potwierdzenia obecności karbapenemazy II tura programu POLMICRO 2010 (edycja ogólna) Także w tej turze wszystkie laboratoria otrzymały identyczne zestawy trzech izolatów bakteryjnych. Szczepy wysłano do 453 laboratoriów mikrobiologicznych, odpowiedź uzyskano od 444 uczestników. Wszystkie szczepy były poprzednio ro- 35

Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO 2010... Rycina 13. Rozkład stref zahamowania wzrostu K. pneumoniae PM-163 dla wybranych antybiotyków (imipenem, meropenem, tigecyklina, ciprofloksacyna, tobramycyna, amikacyna). Ogólna liczba laboratoriów 454. Interpretacja wg. CLSI, styczeń 2010 zesłane w I turze 2010, lecz były wyłączone z oceny końcowej (PM-155, PM-159 i PM-162), jako najbardziej problematyczne szczepy bakteryjne ale nie najtrudniejsze do diagnostyki. Negatywny wynik końcowy niniejszej edycji przyznano 106 laboratoriom, co stanowi 23,9% ogółu laboratoriów przystępujących do sprawdzianu. Identyfikacja szczepów tym razem sprawiła trudności pięciu laboratoriom, były to inne laboratoria niż w I turze. Dwa laboratoria nieprawidłowo zidentyfikowały wszystkie trzy izolaty, a trzy laboratoria błędnie zidentyfikowały po jednym szczepie. Izolat K. pneumoniae PM-159 zidentyfikowano dwukrotnie jako Enterobacter aerogenes i jednokrotnie jako Enterobacter aglomerans oraz jednokrotnie jako Klebsiella ozaenae. Szczep PM-162 dwa laboratoria określiły jako Klebsiella oxytoca i jedno jako Enterobacter cloaceae. Izolat PM- 155 jedno laboratorium zidentyfikowało jako Enterobacter cloaceae i jedno jako Enterobacter aglomerans, obydwa laboratoria otrzymały ten sam szczep w I turze POLMICRO 2010 i poprzednio zidentyfikowały prawidłowo. W sumie odnotowano 9 niepoprawnych identyfikacji na 1332 co oznacza 0,67 % błędnych identyfikacji, podczas gdy w I turze było 0.15% nieprawidłowych odpowiedzi. Wykrywanie mechanizmów oporności wypadło w porównaniu z I turą POLMICRO 2010 nieco lepiej. Oznaczanie metalo-β-laktamaz klasy B (MBL) z którym w poprzedniej edycji laboratoria miały trudności tym razem wypadło zadowalająco. W szczepie K. pneumoniae PM-155 MBL-dodatnim na 444 laboratoria 92% (n=441) uzyskało prawidłowy wynik, a w poprzedniej edycji 81% laboratoriów. Dla izolatów PM-159 oraz PM-162, które nie były producentami MBL, brak tego mechanizmu poprawnie określiło 95,6%(n=426) i 85,6% (n=380) laboratoriów. W pierwszej turze dla szczepu PM-159 niewiele ponad 50% uczestników uzyskało prawidłowy wynik, natomiast dla szczepu PM-162 prawidłowy wynik oznaczenia miało tylko 30 % uczestników. Szczepy K. pneumoniae PM-159 i PM-162 były wieloopornymi szczepami nie wytwarzającymi MBL i KPC. Możliwości wytwarzania ESBL przez takie szczepy nie można odrzucić, pomimo oporności na penicyliny, cefalosporyny i monobaktamy i po wykluczeniu obecności AmpC. ESBL może być maskowana przez silne obniżenie przepuszczalności osłon komórkowych bakterii. Pozytywny wynik II tury sprawdzianu POLMICRO 2010 uzyskało 76,1% laboratoriów biorących udział w programie. 36

E. Młodzińska i inni I tura POLMICRO 2010/SSE W I turze programu POLMICRO 2010/SSE przygotowano dwa zestawy kontrolne, zawierające po dwa izolaty bakteryjne Salmonella enterica subsp. enterica spośród wymienionych w tabeli 1. Do sprawdzianu przystąpiło 91 laboratoriów mikrobiologicznych stacji sanitarno-epidemiologicznych, z których każde otrzymało zestaw szczepów zakodowanych jako A i B. Pięćdziesiąt jeden laboratoriów poddało kontroli wyłącznie etap identyfikacji na poziomie zadeklarowanym przez każde z laboratoriów. W obrębie gatunku Salmonella enterica wyróżnia się 6 podgrup (podgatunków). W podgrupie Salmonella enterica subsp. enterica wyróżniono ponad 1500 serowarów, tzn. odmian serologicznych dawniej nazywanych serotypami. Różnorodność antygenowa poszczególnych serowarów jest podstawą ich różnicowania (schemat identyfikacji serologicznej Kauffmana-White a-le Minora). Szczepy należały do dwóch różnych grup, według Taksonomii i nazewnictwa rodzaju Salmonella Światowej Organizacji Zdrowia (1): 1. Grupa O:7 (dawna C 1 ) Salmonella Concord PM-166 antygen somatyczny O 6,7 ; antygen rzeskowy H I faza l,v ; II faza- 1,2 Salmonella Mbandaka PM-167 O 6,7, 14 ; H I faza z 10 ; II faza- e,n, z 15 2. Grupa O;3,10 (E 1 ) Salmonella Anatum PM-165 O 3,{10}{15}{15,34}; H I faza e,h ; II faza- 1,6 Salmonella Elisabethville PM-168 O 3,{10}{15}; H I faza r ; II faza- 1,7 Ze względu na znaczne różnice w zakresach identyfikacji pałeczek Salmonella w polskich laboratoriach inspekcji sanitarnej trudno było przyjąć sztywne kryteria akceptacji nadsyłanych wyników. W związku z tym, każde z uczestniczących w programie laboratoriów podlegało ocenie indywidualnej. Szczep PM-165 i PM-166 otrzymało 45 laboratoriów, a szczepy PM-167 i PM-168-46 laboratoriów. Wyniki identyfikacji przedstawiały się następująco: Salmonella Anatum PM-165 dwadzieścia trzy laboratoria zidentyfikowały jako S. Anatum, trzy laboratoria jako S. Hayndigo, dwanaście laboratoriów określiło prawidłowo przynależność do grupy, sześć laboratoriów oznaczyło szczep jako S. enterica i jedno jako Salmonella spp. Salmonella Concord PM-166 dwadzieścia siedem laboratoriów zidentyfikowało jako S. Concord, dziewięciu uczestników określiło poprawnie przynależność do grupy, siedem laboratoriów oznaczyło szczep jako S. enterica i jedno jako Salmonella spp. Jedno z laboratoriów określiło szczep jako Salmonella Mbandaka. Salmonella Mbandaka PM-167 trzydziestu jeden uczestników zidentyfikowało szczep jako S. Mbandaka, siedem laboratoriów określiło poprawnie przynależność do grupy, pięć laboratoriów oznaczyło szczep jako S. enterica i jedno jako Salmonella z grupy serologicznej, ale nie podano jakiej. Jedno laboratorium zidentyfikowało szczep jako S. Braenderup i jedno jako S. Djugu. Salmonella Elisabethville PM-168 - dwadzieścia cztery laboratoria zidentyfikowały szczep jako S. Elisabethville, dwanaście laboratoriów określiło prawidłowo przynależność do grupy, sześć laboratoriów oznaczyło szczep jako S. enterica i jedno jako Salmonella z grupy serologicznej, ale nie podano jakiej. Jedno laboratorium zidentyfikowało szczep jako S. Give przynależacy do tej samej grupy, dwa laboratoria określiły, że szczep jest z grupy O:1,3,19 ( E 4 ) i zidentyfikowano jeden jako S. Kouka i jeden jako S. Yalding. W oznaczaniu lekowrażliwości szczepu Salmonella Concord PM-166 wystąpiło najwięcej błędów. Odnotowano cztery bardzo duże błędy, po jednym dla ampicyliny, ceftriaksonu, ceftazydymu i cefotaksymu; dwa duże błędy w oznaczeniu wrażliwości na trimeroprim/sulfametoksazol i dziewięć małych błędów w przypadku oznaczenia lekowrażliwości na amoksycyliny z kwasem klawulanowym. Szczep ten jest producentem β laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym, dwa laboratoria nieprawidłowo oznaczyły wytwarzanie ESBL. Pozostałe szczepy przesłane w ramach tej kontroli nie sprawiły laboratoriom trudności i tylko jedno laboratorium określiło szczep Salmonella Anatum PM-165 jako ESBL dodatni, zamiast ESBL ujemny. Zgodnie z zaleceniami szczepy wytwarzające ESBL należało traktować jako szczepy oporne na wszystkie penicyliny (bez połączeń z inhibitorami), cefalosporyny (z wyjątkiem cefamycyn) i aztreonam. Pozytywny wynik I tury sprawdzianu POLMICRO 2010/SSE uzyskało 87 (95,6%) laboratoriów biorących udział w programie. II tura POLMICRO 2010/SSE Do sprawdzianu przystąpiło 96 laboratoriów mikrobiologicznych stacji sanitarno-epidemiologicznych, z których każde otrzymało zestaw szczepów zakodowanych jako A, B i C. Szczepy Salmonella należały do jednej grupy, według Taksonomii i nazewnictwa rodzaju Salmonella Światowej Organizacji Zdrowia (1).: Grupa O:7 (dawna C 1 ) Salmonella Isangi PM-169 antygen somatyczny O 6,7,14 ; antygen rzeskowy H I faza d ; II faza- 1,5 Salmonella Montevideo PM-170 O 6,7, 14 ; H I faza g,m,[p], s ; II faza- [1,2,7]. Szczep PM-169 otrzymało 66 laboratoriów, a szczep PM- 170-96 laboratoriów. Wyniki identyfikacji przedstawiały się następująco: Salmonella Isangi PM-169 trzydziesci siedem laboratoriów zidentyfikowało jako S. Isangi, trzynaście laboratoriów określiło prawidłowo przynależność do grupy sześć do grupy 0:7, siedem do C 1. Część laboratoriów oznaczyło szczep do grupy CO - dziewięć, a do grupy C - pięć laboratoriów. Dwa laboratoria określiły przynależność do rodzaju - Salmonella spp. Salmonella Montevideo PM-170 sześćdziesiąt trzy laboratoria zidentyfikowały jako S. Montevideo, piętnaście laboratoriów określiło prawidłowo przynależność do grupy sześć do grupy 0:7, dziewięć do C 1. Część laboratoriów oznaczyło 37

Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO 2010... szczep do grupy CO - dziesięć, a do grupy C - sześć laboratoriów. Dwa laboratoria określiły przynależność do rodzaju - Salmonella spp. Szczep Escherichia coli PM-171 otrzymały wszystkie laboratoria (n=96), trzydzieści z nich otrzymało szczep w dwóch powtórzeniach. Sześć laboratoriów zamieściło informację nie wyhodowano pałeczek Salmonella i Shigella. Tylko jedno laboratorium określiło szczep jako Salmonella Montevideo. Pozostali uczestnicy programu nie mieli trudności w identyfikacji szczepu. Wszystkie laboratoria zgodnie z rutynowo prowadzoną diagnostyką poprawnie ustaliły przynależność szczepów Salmonella PM-169 i PM 170 do grupy/serowaru. Przesłany w ramach kontroli szczep E.coli PM-171 wśród uczestników pracujących wyłącznie z pałeczkami Salmonella i Shigella, powinien być potraktowany jako tzw. kontrola negatywna. niektóre laboratoria umieszczały informację, że nie wyhodowano Salmonella i Shigella. W tej sytuacji taki wynik również był uznawany za prawidłowy. Pozytywny wynik II tury sprawdzianu POLMICRO 2010/ SSE uzyskało 95 (99 %) laboratoriów biorących udział w programie. Piśmiennictwo: 1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI, Villanova PA. 2010 2. Grimont Patrick AD, Weill Francois-Xavier. Antigenic formulae of the Salmonella serovars, WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, 2007, 9 th edition. 3. Rekomendacje European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing EUCAST, 2010. Adres do korespondencji: Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej 00-725 Warszawa, ul. Chełmska 30/34 tel. 22 841 58 34, fax: 22 841 29 49 e-mail: polmicro@cls.edu.pl Zaakceptowano do publikacji: 21.03.2011 Podsumowanie Proces przetwarzania danych i przygotowania ocen uległ znacznemu uproszczeniu, a generowane wyniki, zarówno zbiorcze, jak i indywidualne, dostępne są dla laboratoriów uczestniczących w Sprawdzianach na stronie internetowej Centralnego Ośrodka. Analiza przesyłanych do Centralnego Ośrodka Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej wyników możliwa była dzięki zastosowaniu specjalistycznego oprogramowania komputerowego. Jak co roku, główny nacisk położono na prawidłowe oznaczenie fenotypu wrażliwości na leki badanych izolatów bakteryjnych z uwzględnieniem wytwarzanych przez nie mechanizmów oporności. Wiele laboratoriów mikrobiologicznych w procesie diagnostyki wykorzystywało systemy automatyczne do identyfikacji i lekowrażliwości drobnoustrojów. Wzrosła też liczba laboratoriów określających wartości MIC z użyciem E-testów. Z doświadczenia Centralnego Ośrodka wynika, że wciąż niezbędna jest edukacja odnośnie zasad prawidłowego wykonania testów wrażliwości, jak też prawidłowej interpretacji uzyskanych wyników. W celu eliminacji najczęściej popełnianych błędów opracowano Cztery kroki wykrywania karbapenemaz w szczepach Enterobacteriaceae, które zamieszczono w liście do laboratoriów. Ogółem w roku 2010 przyznano 457 świadectw: 370 w edycji ogólnej i 87 w edycji w zakresie schorzeń jelitowych. Wykaz laboratoriów, które otrzymały świadectwa w roku 2010 zamieszczony został na stronie internetowej Centralnego Ośrodka. Przyznawane laboratoriom świadectwa posiadają indywidualny numer; świadectwo zachowuje ważność w terminie jednego roku od dnia wystawienia. 38