Anna Król Pszczelniczy Zakład Doświadczalny Górna Niwa, Puławy WPROWADZENIE

PSZCZELNICZE ZESZYTY NAUKOWE ROK XXV 1981 FRAKCJE BIAŁKOWE W MLECZKU PSZCZÓŁ RÓZNYCH RAS Anna Król Pszczelniczy Zakład Doświadczalny Górna Niwa, Puławy WPROWADZENIE Determinacja osobników żeńskich w rodzinie pszczelej uwarunkowana rodzajem pożywienia jest powszechnie znana. Dotychczas jednak nie są znane czynniki odpowiedzialne za morfogenetyczne działanie mleczka. G o n t a r s k i 1961 (cyt. 'za M e l n i c e n k o 1963) próbował te zagadnienia związać 'z biopterarni i kwasem pantotenowym. Później B u r- m i s t r o w a i M e l n i c e n k o (1963) z aminokwasami, a następnie Wa w i ł o w (1969) z kwasami nukleinowymi RNA i DNA. W 1967 r. R e m b o l d uzyskał nawet biologicznie aktywną frakcję, którą określa jako substancję determinującą rozwój osobniczy matki pszczelej. Autorowi temu, mimo ścisłych badań, nie udało się jednak określić struktury chemicznej tej frakcji, jak też ostatecznie wyjaśnić tego problemu. Wydaje się, że wiele z tych analiz należałoby powtórzyć w oparciu o nowocze sną aparaturę, a badania rozszerzyć na różne rasy pszczół. Białka w mleczku pszczelim pełnią jak wiadomo szereg bardzo ważnych i specyficznych funkcji biologicznych, dlatego istotnym być może dokładne poznanie ich struktury. Zagadnieniem tym zajmowali się w latach pięćdziesiątych B a m m a n. G o n t a r s k i, A m m o n (cyt. V i t- t e k 1968). Autorzy ci próbowali rozdzielić białko mleczka pszczelego w elektroforezie bibułowej i żelu skrobiowym, ale nie udało im się oddzielić frakcji białkowych od polisaharydów. Niemniej sugerują oni, że znalezione frakcje są to albuliny i globuliny, podobne do białka sera krewiego. Badaniami białek surowicy krwi ludzi oraz zwierząt, ssaków i ptaków, zajmowało się bardzo wielu badaczy. Z najnowszych badań N i e- s p o d z i e w a ń s k i e g o (1979) wynika, że białko surowicy krwi kury mcżna rozdzielić na pięć frakcji - dwa biał!k.az grupy albumin, prealhumina iatbumina i trzy z grupy globulin (a, p, r i globuliny). Celem niniejszej pracy było badanie zawartości białka ogólnego i jego frakcji w mleczku pszczelim 4 ras pszczół. 165

MATERIAŁ I METODY Badano świeże mleczko pszczele, pozyskiwane z mateczników od karmicielek pszczół czterech czystych ras: kaukaska - szara górska (Apis mellijic«caucasica), krainka - Troisek import z Austrii (Apis mell. carnica), włoska - import z Włoch :(Apis mell. ligustica) i krajowa linia mazurska I(Apis mell. L.). Mleczko pobierano z trzydniowych mateczników w ciągu całego sezonu 1979 r., w czterech terminach (maj, czerwiec, lipiec, sierpień) w pasiece PZU GÓl'lI1aNiwa w Puławach. Do tego doświadczenia wytypowano po t'rzy rodziny każdej z 4 ras pszczół. Mateczniki na mleczko poddawano :w ciągu trzech kolejnych dni. Codziennie zakładano mateczniki w innej rodzinie badanej rasy, według wcześniej opisanej metody {K ról 1974). Następnie po upływie trzech dni od założenia 1 serii mateczników, pobierano mleczko do naczyniek wagowych. Pozyskano w ten sposób po trzy próby od każdej rasy. Mleczko przechowywano w zamrażalniku lodówki. Po wymieszaniu mleczka przygotowano jedną średnią próbę dla trzech rodzin danej rasy. W badanych próbach określono procent białka ogólnego metodą L o w r y i inni (1951). Następnie białko poddano analizie elektroforetycznej, stosując rw tym celu elektroforezę dyskową, wykonaną według D a v i s a (1964). Użyto kolumienek żelu poliakrylamidowego o wymiarach 0,5X5,5 cm (7,50f0 akrylamid. O/INo bis akrylamid) w buforze: 'I'ris + glicyna ph = 8,6 przy natężeniu prądu stałego 3 m/a na żelu w temperaturze 4 C. Elektroforezie poddano 100 pg mleczka z dodatkiem 5% sacharozy. Po upływie 2,5 godziny poszczególne kolumienki żelowe umieszczono na 1 godzinę w 10/0 roztworze czerni amidowej, a następnie odbarwiono tłoelektroforetyczne w 70/0 kwasie octowym. Pozyskane kolumienki z frakcjami białkowymi, po 4 z każdej badanej rasy pszczół, poddano pomiarom densytometrycznym. Użyto densytometru TLD-100 z integratorem UR-402 firmy Vitatron. W ten sposób uzyskiwano elektroforegramy i dane liczbowe, które pozwalały określić procentowy udział każdej frakcji w całości rozdzielonego białka. Przez pojęcie "frakcja" rozumiano tu najmniejszą jednostkę elektroforetycznego rozdziału, której odpowiednikiem na densytometrogramie jest wierzchołek (rys. 2). Wyniki 'Opracowano statystycznie metodą analizy wariancji, a ocenę różnic dokonano za pornocą testu Duncana. Wyniki nie różniące się między sobą oznaczono w tabelach tymi samymi literami alfabetu. WYNIKI Nie stwierdzono istotnych różnic w ogólnej zawartości białka w mleczku pszczelim pszczół badanych ras. (tab. 1). Pewna tendencja wyższej nieco zawartości białka w mleczku pszczół włoszek nie została udowodniona statystycznie. Natomiast istotne różnice 166

Tabela Ogólna zawartość białka w mleczku pszczelim czterech ras pszczół VI % Rasy pszczoły miodnej Terminy pozyskiwania mleczka maj czerwiec lipiec sierpień Średnio l Istotność różnicy przy Q. = 0,05 Krajowa 12,40 16,92 15,07 14,77 14,79 al Kaukaska 13,40 16,32 14,04 15,58 14,83 a 2 Krainka 13,10 16,84 15,00 14,98 14,95 a, Włoszka 14,90 16,88 14,80 15,52 15,52 a. Średnio 13,45 16,74 14,73 15,21 15,02 Istotność różnicy przy a = 0,05 a, ba, a 2 a 3 b w zawartości białka wystąpiły w mleczku pozyskiwanym od pszczół w różnych terminach, czyli w różnych okresach sezonu letniego. Największy procent białka zawierało mleczko wyprodukowane w czerwcu i sierpniu, a najmniejszy w maju. Niższa zawartość białka w mleczku majowym mogła być spowodowana nieodpowiednim wiekiem pszczół karmicielek produkujących mleczko, a raczej byłoto wynikiem gorszego odżywiania się pszczół z powodu braku dostatecznej ilości pyłku na wiosnę lub jego małą różnorodnością, co mogło również obniżyć wartość mleczka lipcowego. Wydaje się jednak, że mleczko czerwcowe ze względu na podwyższoną zawartość białka uznać można za najwartościowsze jako pokarm dla larw. Procentowa zawartość białka w mleczku pszczelim u 4 badanych ras stanowiła punkt wyjściowy do badań elektroforetycznych tego produktu. Z analizy kolumienek żelowych (rys. 1) wynika, że zachodzą dwa kieruniki migracji frakcji białkowych. W kierunku anody (-) wędruje jedna frakcja, w kierunku katody (+) wędrują trzy frakcje białkowe. W. mleczku wszystkich badanych ras znaleziono 4 frakcje i określono Je wstępnie jako frakcja I - najbliżej anody, oraz II, III, IV przy katodzie. Przy ocenie wizualnej kolumienek żelowych stwierdzono pewne różnice w natężeniu barwy i grubości poszczególnych fra:kcji. Za najbardziej intensywną uznano frakcję II, a najmniej frakcję I i IV. Oprócz tego można było zauważyć bezpośrednio na kolumienkach żelu w mleczku pozyskanym od pszczół karmicielek rasy :kraińskiej i włoskiej inne natężenie barwy niż u pozostałych ras frakcji II i IV. Nie jest to niestety widoczne na zdjęciach. Analiza densytometryczna potwierdza różną procentową zawartość frakcji białkowych wmlecz:ku wszystkich badanych ras (tab. 2). Najniższy udział stanowi frakcja I, a najwyższy frakcja II. Tylko w mleczku od pszczół rasy kraińskiej i włoskiej uzyskano nieco inne procentowe dane frakcji II i IV. Tak więc mleczko od pszczół krainek charakteryzowało się wyższą zawartością białek frakcji IV (22,12o/a), a mleczko od pszczół włoszek większą w frakcji II (50,55 /1). Jak wynika z densyto- 167

Rys. 1. Frakcje białkowe na żelu poliakrylamidowym w mleczku pszczelim u pszczół 4 ras: a) krajowej, b) kaukaskiej, c) kraińskiej, d) włoskiej Znak + oznacza katodę a - anodę grarnu (TyS. 2b) W mleczku od pszczół włoszek zauważyć można jaxoy przemieszczanie frakcji, gdzie kosztem frakcji IV powiększa się Irakeja II. Odwrotna zależność 'W tych dwu frakcjach zachodzi w mlecz<kuod pszczół 'krai'nek (rys. 2a). Wydaje się, że taki rozdział frakcji nie j2.3t wynikiem przypadku, lecz raczej stanowi cechę dziedziczną związaną z określoną rasą, gdyż dane takie utrzymują się we wszystkich badanych terminach w ciągu całego sezonu, a pozyskane próby stanowią przec ież średnią dla trzech rodzin tej samej rasy. Ciekawe byłoby bliższe określenie z jakiego rodzaju białka skłachją się poszczególne jego frakcje. Według Z e n i s k a (1960) i V i t t k a (1968) dużą część białek w mleczku pszczelim stanowią albuminy i g2.,:::cma globuliny. Według Niespodziewańskiego {1979) z migr s.cji frakcji białkowych wnosić można, że białka, które szybciej wędrują d,!j anody są białkami z grupy albumin,natomiast białka wędrujące wolniej rw kierunku katody są białkami z grupy globulin. Gdybyśmy zatem przyjęli, że w badanym mleczku pszczelim frakcja I zachowuje się podobnie jak albuminy w surowicy krwi kur, natomiast frakcje: II, III i IV 'Vqsalają się podobnie jak globuliny, można by więc przyjąć, że w badanym HiS

Tabela 2 Procentowa zawartość różnych frakcji w całkowitej ilości białka w mleczku pszczelim czterech ras pszczół Terminy pozyskiwanego mleczka Frakcje Rasy pszczoły miodnej Średnio maj czerwiec lipiec sierpień Istotność różnicy przy a = 0,05 Krajowa 15,5 18,2 14,3 15,5 15,87 a. Kaukaska 12,7 18,2 13,7 12,0 14,15 al l. Krainka 14,0 17,8 14,6 13,9 15,07 a, Włoszka 15,0 17,3 16,8 13,3 15,60 a 3 Krajowa 40,6 43,9 47,1 46,9 44,62 alb Kaukaska 41,1 48,1 47,0 48,6 46,20 b, II. Krainka 36,9 42,5 46,1 47,8 43,32 al Włoszka 44,4 50,0 53,9 53,9 50,55 c, Krajowa 23,1 19,2 16,4 17,5 19,05 a, Kaukaska 24,7 17,0 16,9 19,9 19,62 a. III. Krainka 26,1 19,9 15,0 16,9 19,47 3 3 Włoszka 24,6 17,3 13,7 16,4 18,00 31 Krajowa 20,8 18,6 22,1 20,0 20,37 b,c Kaukaska 21,4 16,6 22,4 19,4 19,95 bl IV. Krainka 22,9 19,9 24,4 21,3 22,12 c, Włoszka 15,9 15,4 15,5 16,3 15,77 3, li l h' j l n l b' Rys.a. Rys. b. Rys. 2. Elektroforegram białka mleczka pszczelego u pszczół: a) rasy kraińskiej, b) rasy włoskiej 169

mleczku pszczelim 4 ras pszczół było około 1:;0/0 albuminy (frakcja I) i około 85 /&globuliny (frakcja II, III i IV). Dalej przyjmując dla tych ostatnich klasyczną nomenklaturę a, (:1, i' globuliny określić można w badanym mleczku frakcję II jako a globuliny, frakcję III (:1 globuliny, a frakcję położoną najwyżej jako i' globuliny. Wydaje się, że podział taki może być przyjęty tylko do wstępnego scharalkteryzowania frakcji białkowych w mleczku pszczelim, gdyż wszystkie badane frakcje są od siebie wyraźnie oddzielone, co widoczne jest zarówno na fotografiach, jak i na elektrotoregramach '(rys. 1 i 2). Sciślej scharakteryzować białka w mleczku pszczelim można jedynie przez określenie ich masy cząsteczkowej, przy użyciu detergentów. W 1969 r. V e b e r i O s b o r n w ten sposób scharakteryzowali 40 białek surowicy krwi. Stosowanie analogii w tym przypadku nie jest możliwe, gdyż trzeba określić matrycę białek dla mleczka pszczelego. Badania takie winny być podjęte, gdyż być może pozwoli to na 'ścisłe określenie składu białka, a w szczególności może wyjaśnić różnice frakcji II i IV w mleczku pszczół włoszek i kra inek. Możliwe, że czynniki te mogą mieć wpływ na morfogenetyczne zmiany w budowie poszczególnych osobników żywionych przez karmicielki badanych ras. WNIOSKI Stwierdzono, że mleczko pszczele 4 badanych ras pszczół (krajowe, kaukaskie, kraińskie, włoskie) nie różni się pod względem ogólnej zawartości białka, którego w świeżej jego masie jest około 15%. Pszczoły wszystkich 4 badanych ras w czerwcu 1979 r. w Puławach produkowały mleczko istotnie bogatsze w białko (16,74%) niż w maju (13,45%), a takżei w lipcu (14,78%). Badania elektroforetyczne wykazały, że w ogólnej masie białka zawartego w mleczku pszczelim około 15 11 /0 stanowią albuminy, a około 85~/o globuliny. Zaznaczają się wyraźnie różnice w zawartości niektórych frakcji białek w mleczku badanych ras pszczół: mleczko pszczół kraińskich wykazuje wyraźnie wyższą zawartość frakcji IV (na elektroforegramie - rys. 2a), natomiast mleczko pszczół włoskich więcej frakcji II (na elektroforegramie - rys. 2b). Wydaje się, że należałoby w dalszych badaniach dążyć do bardziej ścisłego scharakteryzowania białek w mleczku pszczelim, gdyż w tym mogą tkwić czynniki decydujące o morfogenetycznych różnicach w budowie pszczół poszczególnych ras. LITERATURA D a v i s G. (1964)- Disc electrophoresis. II. Method and appllcation tohuma.n serum proteins. Ann. N.Y. Acad. Sci. 121: 404-427 170

K ról A. (1979) - Wpływ rasy żywicielek i rasy poddanych larw na efektywność wychowu matek pszczelich. Pszczelno Zesz. Nauk. 18: 135-143 L o w r y O. H., R o s e n b r o u g h N. J., F a r r A. L., R o n d a l R. V. (1951) - Protein measurement with the Folin reagent. J. biol. Chem. 193: 265-275 M e l n i /':en k o A. N., B u r m i s t r o wa N. D. (1963) - Controlled changes in the heredity of colonieś and their bioehemieal bases. Compl. textes of Lect. XIX Congr, of Apimondia in Praque 2: 482-487 M e l n i c e n k o A. H., Wa w i ł o w J U. L. (1969) - O sodierżani nukleinowych kisłot w matocznym mołoczkie. XXII, Mieżdunar. Kongr. po Pczełowodctwu. dokłady: 94-102 N i e s p o d z i e w a ń s kim. (1979) - Białko surowicy krwi, a użytkowość nieśna kur rasy Zielononóżka Kuropatwiana. Wyd. Akad. Rolniczej, Lublin, 62: 3-45 R e m b o l d H. (1979) - Biochemical aspects of queen bee determination. 21. Intern. Beekeeping Congr. Munich, 467 V i t t e k J. (1968) - Vćelia materska kaśićka. Slovenske Vydavat. PodohospodeTskej LiteT. 9-:-382 Web e r K., O s b o r n M. (1969) - The reliability of molekular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroforesis. J. oi bioz Chem. 244(16): 4406-4412 Z e n i s e k A. (1960) - Materia kaśićka a jeji pauz iti koźmin lekarstvi i kosmetica. VcelaHtvi 13(94): 167 BEJIKOBbIE <l>pakiuu1 B MOJIO~KE n~eji PA3HbIX noron A. KpYJl Pe3lOMe B HCCJIe.ąOBaHHHXMaTO'IHOrO MOJIO'łKa, Be.ąeHHbIX B 1979 reny B n.0.3. I'ypxa RHBa, nphhhjih BO BHHMaHHe 4 noponsr n=re,n: KaBKaBcKylO - cepy 10 ropnyto, xpa- HnCKylO - HMnOpT H3 ABCTPHH, HTaJIbHHCKYIO- HMnopT H3 MTaJlHI1 H OTe'łeCTBeH- HylO - nhhhh Ma3YPKa. B HCCJIe.ąoBaHHRx y'łhtbibajih no TpH CeMbl1 KaJKAOH nopo.ąbi. B CBeJKeM MOnO'łKe onpeneneao npouenr oómero 6enKa no Lowry, 3aTeM no MeTO.ąy,lI;eBHca (Da wis) paaneneno 6enoK Ha noju1akphnamh){homrerre Ha cppak~~-i1. He 06IIapyJKeHO paanxu B npol.\ehtliom CO,l1epJKamm fierrxa y rrse.n pa3hbix nopoa. Ha OCHOBalIHI1p.HaJIH3a KOJlOHOKH3 rena 06HapYJKeHO, 'ITO 6eJlOK B MOJlO'IKe acex 4 HCCJIe.ąOBaIIHbIX nopozi pasnenaerca Ha 4 cppaklll111 pa3h0j1 TOJIlLViHOJ111 HHTelICHBHOCTblO uaera. KOHCTaTl1poBaHO, 'ITO y n-ren I1Tanb1lHCKOH 11 xpaaa- CKOJ1rropon BblcTynalOT paanxusr B I1HTeHCHBIIOCTKuaera cppak~j1 II 11 IV.,lI;eHcHToMeTpH'IecKKH ahajlh3 no.ątbep,!\kji n01lbjiehhe pa3hh~ B npollehthom y'lacthh ot.ąejibhblx cppak~h B pa3)\ejlellhom 6eJlKa. MOJlO'IKO H3 n'ieji xpasraox OTJIH'IaJlOCb BblCWI1McO)\epJKalU1eM 6eJlKOB BO cppak- ~HI1 IV (22,1~/o), a MOJIO'łKOn'IeJI KTaJlb1lHOK - BblCWHM BO cppaki.\hh II (50,55'l/0). KOHcTaTHpoBaHo, 'łto B MaTO'łHOMMOJlO'IKe y 3THX nopozr npoi1cxo)\htnepessetnaseae 6eJlKa B GTI1X)\ByX cppakllkhx, B KOTOpblX aa C'IeT O,l1HOJ1cPpaK~HH ybejlh'ihbaet<:łl BTOpa1l cppaki.\hr. KaJKeTC1l, 'ITO paanenenae 3THX cppak~j1 He HBJl1leTC1lpeayns- TajZOM CJly'łBSI, TOJlbKO HaCJle)\CTBeHHOH -reproa, CBH3aHHOJ1c onpeneneauoa nopo- )\OH, TaK KaK TaKHe,!\aHBble COXpaH1lIOTCSIBO acex HCCJIe,!\OBaHHbIXcpoxax B Te'łelI,}{e BCerO ce30ha, a nojly'ielilible npoobl 'ilłbjisliotcsi cpe)\iieh H3 rpex CeMbeJ1 noh :lke noponsr. 171

PROTEIN FR.ACTIONS IN ROYAL JELL y OF VARIOUS HONEY BEE RACES.A. Król Summary In the :studies on Royal Jelly conducted by the Honeybee Experimental Station at Górna Niwa, Pulavy (Poland), in 1979 the fo11owing bees were involved: Caucasian (mountain grey), carniolan (imported from Austria), ltalian (imported from Italy) and the native race of Mazurek's strain. Three hives of each race were used throughout the study. In every portlon of the fresh Royal Je11y -the percentage contents of total proteins were determined according to the Lowry's method. Then the proteins were separated into fractions on poliacrylamide gel columns. No significant differences in the percentagę of protein contents were found arncng the [elly sampies collected from various bee races, Based on the results obtained from gel column analysis, It has been shown that the proteins contamed in Royal Jelly bf a11 bee raees can be separated into protein fractions of different thickness and colour Intensity. Changes in calour intensity were observed in fractions II and IV of ltalian and Carniolan bee races. Results of densitometric analysis confirmed the existence of the differences in percentagę contribution of the individual fractions in the total amount of protein being separated, The Royal Jelly of Carniolan honey bees was characterised by the higher protein contents in fraction IV (22, l~/o) while that of Italian bees being higher in fraction II (50, 55010)only. It has also found that there is a protein migration affeet in these twa fractions of Royal Jelly of the two bee races such that protein concentration in one fraction will increase on the expense of that in the other, IŁ seerns, however, that such protein distribution between the two fr actions in not governed by a r anolorn reason but ii--rather an inherent feature connec'ted with a given bee race since this relationship persisted any exarnination day over the whole season and samples obtained represented the averagę sample taken from three hives of the same bee race. PWR1L,- 'Varszawa 1962 r. Zarz. 52tofzl. Nakład 1000+57 egz. Ark. wyd. 13,30; ark. druk. 10,75. Papier druk. sat. ki. III, 70 g, 70Xl00 ŁÓdzka Drukarnia Dziełowa, Zakład Nr 2 pabianice, zam. 1000f1l01/81.Z-9:;