Monografia naukowa ISBN:

Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach ROBERT KRZYŻANOWSKI Wpływ lotnych związków orzecha włoskiego Juglans regia L. na zachowanie mszyc Panaphis juglandis (Goeze, 1778) i Chromaphis juglandicola (Kaltenbach, 1843) MONOGRAFIA NAUKOWA Siedlce 2016

Autor: dr Robert Krzyżanowski Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach, Wydział Przyrodniczy Siedlce University of Natural Sciences and Humanities, Faculty of Natural Sciences Recenzenci: prof. dr hab. Beata Gabryś, Uniwersytet Zielonogórski dr hab. Grażyna Soika, prof. IO, Instytut Ogrodnictwa w Skierniewicach Komitet Wydawniczy: Andrzej Barczak, Tadeusz Boruta, Janusz Chruściel, Beata Gałek, Leszek Kania, Jarosław Stanisław Kardas, Rafał Kozak, Krzysztof Lewandowski, Violetta Machnicka (przewodnicząca), Aneta Niewęgłowska, Robert Piętek, Janina Skrzyczyńska, Stanisław Socha, Andrzej Walendziak, Paweł Żarkowski Żaden fragment tej publikacji nie może być reprodukowany, umieszczany w systemach przechowywania informacji lub przekazywany w jakiejkolwiek formie elektronicznej, mechanicznej, fotokopii czy innych reprodukcji bez zgody posiadacza praw autorskich. Copyright by Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach, Siedlce 2016 Monografia naukowa ISBN: 978-83-7051-801-1 Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczo-Humanistycznego w Siedlcach 08-110 Siedlce, ul. Żytnia 17/19, tel. 25 643 15 20 wydawnicwo@uph.edu.pl www.wydawnictwo.uph.edu.pl Wyd. I., Ark. wyd. 18,3. Ark. druk. 17,8. Druk i oprawa: ZAPOL, Szczecin

SPIS TREŚCI 1. Wstęp i cel pracy 5 2. Przegląd piśmiennictwa 7 2.1. Występowanie mszyc na orzechu włoskim 7 2.1.1. Skutki żerowania mszyc na drzewach i krzewach 8 2.2. Reakcja mszyc na właściwości fizykochemiczne roślin żywicielskich 11 2.2.1. Bodźce wizualne 11 2.2.2. Bodźce zapachowe 13 2.3. Reakcje obronne roślin na atak roślinożernych owadów 14 2.3.1. Odpowiedzi na uszkodzenia tkanek 16 2.3.1.1. Uwalnianie substancji lotnych 16 2.3.1.2. Uwalnianie innych metabolitów 18 2.3.2. Mechanizmy przekazywania informacji chemicznej 19 3. Materiał i metody 22 3.1. Charakterystyka badanych drzew i pobieranie prób 22 3.1.1. Określenie zawartości chlorofilu w badanych listkach w liściu złożonym orzecha włoskiego 22 3.1.2. Pomiar listków w liściu złożonym orzecha włoskiego 23 3.2. Określenie dynamiki liczebności populacji zdobniczki orzechowej Panaphis juglandis i zdobniczki podliściowej Chromaphis juglandicola 23 3.3. Mikroekstrakcja i rozdział chromatograficzny mieszanin VOCs 24 3.4. Olfaktometryczne badania zachowania mszyc 24 3.4.1. Badane substancje lotne 24 3.4.2. Opis eksperymentu 25 3.4.3. Modele zachowania się mszyc 26 3.4.4. Analiza statystyczna walidacja 29 4. Wyniki 32 4.1. Dynamika rozwoju populacji mszyc na liściach złożonych orzecha włoskiego 32 4.1.1. Dynamika rozwoju populacji zdobniczki orzechowej 32 4.1.2. Dynamika rozwoju populacji zdobniczki podliściowej 34 4.2. Struktura populacji mszyc na liściach złożonych orzecha włoskiego 36 4.3. Rozmieszczenie populacji mszyc na liściach złożonych orzecha włoskiego 39 4.4. Charakterystyka badanych liści złożonych orzecha włoskiego 45 4.5. Emisja lotnych związków przez liście złożone orzecha włoskiego niezasiedlone przez mszyce 46 4.6. Wpływ żerowania mszyc na emisję lotnych związków z liści złożonych orzecha włoskiego 52 4.7. Wpływ lotnych substancji wydzielanych przez liście złożone orzecha włoskiego na czas przebywania mszyc w obrębie bodźca 53 4.8. Wpływ lotnych związków emitowanych przez orzech włoski na zachowanie mszyc oraz długość drogi przebytej przez te mszyce 57

5. Dyskusja 65 6. Wnioski 73 7. Piśmiennictwo 75 Aneks / Annex 91 Streszczenie 139 Summary 141 133

STRESZCZENIE Lotne związki organiczne (ang. Volatile Organic Compounds; VOCs) mogą pełnić rolę atraktantów, repelentów bądź innych komunikatorów chemicznych dla roślinożernych owadów. Niektóre emitowane VOCs działają odstraszająco lub są indukowanymi sygnałami, przyciągającymi drapieżniki lub parazytoidy szkodliwych owadów. Podczas ataku roślinożerców sygnały indukowane w wyniku uszkodzeń tkanek mogą pojawiać się lokalnie lub rozprzestrzeniać się w całej roślinie systemicznie w taki sposób, że nieuszkadzane organy emitują specyficzne VOCs. Lotne związki są wtedy generowane de novo, w różnym czasie od momentu uszkodzenia tkanek. Na te indukowane emisje zwraca się coraz większą uwagę, ponieważ są one łączone z odpowiedzią roślin na atak roślinożerców. Obecnie wiadomo, że w systemie obronnym roślin zasadniczą rolę pełnią GLV (ang. Green Leaf Volatiles) oraz alkohole, aldehydy i octany. Monoterpeny i seskwiterpeny wydzielane są przez rośliny jako specyficzne reakcje na określony gatunek roślinożercy, a nawet sposób jego żerowania. Przekazywanie informacji chemicznej podczas interakcji zachodzących pomiędzy rośliną zaatakowaną a szkodnikiem jest złożonym procesem. Dlatego zrozumienie ich mechanizmów pozwala na rozwinięcie i wprowadzenie zasad integrowanej ochrony roślin do praktyki. Stąd sterowanie emisją VOCs może być wartościową strategią prowadzącą do ograniczenia do minimum środków chemicznych w ochronie orzecha włoskiego przed mszycami. Liście złożone orzecha włoskiego są zasiedlane przez dwa gatunki mszyc: zdobniczka orzechowa Panaphis juglandis (Goeze, 1778) żerująca w zwartych koloniach wzdłuż nerwu głównego, na górnej stronie blaszki liściowej i zdobniczka podliściowa Chromaphis juglandicola (Kaltenbach, 1843) występująca na spodniej stronie liści złożonych w znacznym rozproszeniu. W latach 2010-2012 pierwsze osobniki zdobniczki orzechowej zaobserwowano na przełomie trzeciej dekady kwietnia i pierwszej dekady maja, po czym zawsze szczyt liczebności występował w drugiej/trzeciej dekadzie czerwca. W latach 2011-2012 odnotowano wystąpienie drugiego wzrostu liczebności populacji na przełomie drugiej/trzeciej dekady sierpnia, a w trzeciej dekadzie września obserwowano zanik występowania szkodnika na badanych drzewach. W przypadku zdobniczki podliściowej, w latach 2010-2012 pierwsze mszyce pojawiały się na liściach złożonych orzecha włoskiego w trzeciej dekadzie maja i rozwijały się do przełomu czerwca i lipca. Po okresie maksymalnej liczebności populacji we wszystkich badanych sezonach wegetacyjnych obserwowano załamanie występowania Ch. juglandicola i całkowity zanik tej populacji na badanych drzewach orzecha włoskiego (D1, D2 i D3). Spośród badanych sezonów wegetacyjnych rok 2011 charakteryzował się szczególnie licznym występowaniem zdobniczki podliściowej. Na podstawie przeprowadzonych obserwacji rozmieszczenia badanych morf P. juglandis stwierdzono, że proces zasiedlania złożonych liści orzecha włoskiego rozpoczynał się od zewnętrznych, najbardziej wysuniętych listków, które były zasiedlane przez formy uskrzydlone, a następnie obserwowano wzrost liczebności larw I-III stadiów. Dopiero po tym okresie populacja P. juglandis rozprzestrzeniała się, zajmując dwa kolejne listki zewnętrzne. Wraz z rozwojem liści złożonych orzecha włoskiego (w lipcu i sierpniu) populacja P. juglandis zaczęła zasiedlanie dalszych listków (LD1 i LE1), przemieszczając się w trakcie sezonu z listków zewnętrznych w kierunku wnętrza korony drzewa. Badając rozmieszczenie przestrzenne populacji Ch. juglandicola stwierdzono, że na początku mszyca zasiedlała zewnętrzne, najbardziej wysunięte listki, jeden lub wszystkie trzy, a następnie, w drugiej dekadzie czerwca, szybko rozprzestrzeniała się. Rozwój populacji zdobniczki podliściowej odbywał się przy równomiernym rozmieszczeniu tego gatunku na całym liściu złożonym orzecha włoskiego. 139

Wyniki badań w zakresie emitowanych VOCs z liści złożonych orzecha włoskiego wykazały, że w obrębie monoterpenów szczególnie istotne były cztery VOCs: (+)-/(-)-β-pinen, (+)-/(-)-α-pinen, limonen i santolina. Dwa z nich (+)-/(-)-α-pinen oraz limonen emitowane były przez liście złożone orzecha włoskiego na tym samym poziomie, podczas gdy emisja (+)-/(-)-β-pinenu ulegała zmniejszeniu, a od drugiej dekady czerwca do pierwszej dekady lipca następowała synteza santoliny. Wykazano, że α-pinen i β-pinen były dominującymi monoterpenami emitowanymi przez liście złożone orzecha włoskiego niezasiedlone przez badane mszyce. W liściach złożonych, na których żerowały mszyce P. juglandis i Ch. juglandicola, zidentyfikowano 13 różnych VOCs: (+)-α-pinen, (+)-β-pinen, (-)-β-pinen, ß-myrcen, octan (Z)-3-heksen-1-olu, limonen, (Z)-β-terpineol, santolina, farnezol, (E)-β-farnezen, γ-kadin i (Z,E)-α-farnezen. Pod wpływem żerowania mszyc wzrastał poziom (+)-α-pinenu, (+)-β-pinenu, (-)-β-pinenu, β-myrcenu, limonenu, santoliny, farnezolu, (Z)-β-terpineolu i (Z,E)-α-farnezenu, podczas gdy zmniejszał się poziom (E)-β-farnezenu, γ-kadinu i octanu (Z)-3-heksen-1-olu, a zawartość seskwiterpenów oraz GLV zmniejszyła się w badanym profilu. Największy procent przyrostu emisji odnotowano dla VOCs z grupy monoterpenów (β-myrcen, limonen, santolina, (+)-α-pinen, (-)-β-pinen), a najmniejszy dla alkoholi, takich jak (Z)-β-terpineol i farnezol. Największy ubytek dotyczył natomiast węglowodorów alifatycznych (octan (Z)-3-heksen-1-olu). Seskwiterpeny, takie jak (E)-ß-farnezen i γ-kadin, również zmniejszyły obecność w profilu, a w ogóle w emisji z zaatakowanych liści nie stwierdzono γ-murolenu, α-(e)-bergamotenu i eucalyptolu. W testach olfaktometrycznych wykazano, że larwy IV stadium i samice uskrzydlone P. juglandis i Ch. juglandicola akceptowały wszystkie formy (-)- i (+)-α-pinenu i (-)- i (+)-β-pinenu, podczas gdy larwy I-III stadium wykazywały niską akceptację związków. W przypadku zastosowania (-)-limonenu stwierdzono brak akceptacji przez wszystkie morfy P. juglandis i Ch. juglandicola. W przypadku (+)-limonenu nie stwierdzono akceptacji tego VOC przez larwy I-III stadium. Ważnym parametrem okazała się przebyta przez obserwowane morfy droga; pod wpływem (-)- i (+)-limonenu najdłuższą drogę pokonały morfy uskrzydlone, a larwy I-III stadium pokonały drogę najkrótszą, co wskazuje na reakcję ucieczki, a więc działanie repelentne wobec badanych mszyc. Związki seskwiterpenowe były akceptowane przez larwy IV stadium i samice uskrzydlone, podczas gdy larwy I-III stadiów w przypadku EßF i α-farnezenu nie wykazywały akceptacji tych związków. Badania behawioralne octanu (Z)-3-heksen-1-olu wykazały, że związek ten bardziej akceptowany był przez samice uskrzydlone, natomiast larwy akceptowały ten związek w mniejszym stopniu. 140

SUMMARY Effect of volatile compounds of Juglans regia L. on behavior of the aphids Panaphis juglandis (Goeze, 1778) and Chromaphis juglandicola (Kaltenbach, 1843) In interactions between plants and aphids the Volatile Organic Compounds (VOCs) might been attractant, repellent and other group of chemical compounds. Some of the emitted VOCs work as deterrents or they act as induced signals attracting the aphids predators or parasitoids.under the herbivore feeding the inducted signals due to tissue damage were emitted locally or systemicaly by plant tissues, then non-feeding organs emitted VOCs. VOCs are then generated de novo, at different times and level after the tissue damages. The induced emissions are connected with response of plants to attack by herbivores. Plants emit a vast range of volatiles. Some of these are so-called green leaf volatiles are ubiquitous. However, other biomolecules such as alcohols, aldehydes or acetate are also emitted by plants at the same time. Monoterpenes and sesquiterpenes are emitted by plants as a specific response to specific type of herbivores, and even the way of feeding. The studied VOCs provide a transfer of chemical information between plants and pests, thus understanding of this process allows to incorporate it into integrated pest management method. Thus the emission of volatile compounds by the walnut might be used in the modern walnut trees protection that minimalizes application of synthetic pesticides. The occurrence of two aphid species Panaphis juglandis (Goeze, 1778) and Chromaphis juglandicola (Kaltenbach, 1843) on walnut was studied. The aphid P. juglandis colonized only top side of the walnut leaves, and located its colonies along the main nerve. Ch. juglandicola was observed on the bottom part of the leaf blade. During 2010-2012 the first, single specimens of P. juglandis appeared in the third decade of April and the first decade of May. The peak of abudance of the insects occured in the second and the third decade of June. In the third decade of September no one aphid was observed on the examined trees. The first aphids of Ch. juglandicola were found in the third decade of May. In the third decade of June and the first decade of July relatively numerous aphid were observed on the studied trees. After that time the aphid population systematically decreased, and the largest population of Ch. juglandicola occurred in 2011 season. Based on the conducted observations it was shown that deployment of P. juglandis population on composite leaf began on external leaflets. Then the first I-III instar larvae were observed on the whole leaves. Next the P. juglandis spreads on the all leaflets of the walnut. The Ch. juglandicola morphs at first occupied the external leaflet and then spreads on the all blades of the walnut leaves. The studied walnut leaves emitted mainly (+)-/(-)-β-pinene, (+)-/(-)-α-pinene, limonene and santolina triene. Two compounds, such as (+)-/(-)-α-pinene and limonene were emitted at the same level, but (+)-/(-)-β-pinene was emitted in smaller quantities. Besides, santolina triene was syntetized de novo during second decade June and first decade of July. Unifested walnut leaves emitted 13 different VOCs including: (+)-α-pinene, (+)-β-pinene, (-)-β-pinene, ß-myrcene, (Z)-3-hexen-1-ol acetate, limonene, (Z)-β-terpineole, santolina triene, farnesol, (E)-β-farnesene, γ-cadinene and (Z,E)-α-farnesene. Under the aphids feeding increased levels (+)-α-pinene, (+)-β-pinene, (-)-β-pinene, β-myrcene, limonene, santolina triene, farnesol, (Z)-β-terpineole and 141

(Z,E)-α-farnesene, also decreased level of (E)-β- farnesene, γ-cadinene and (Z)-3-hexen-1-ol acetate were observed. While the aphid feeding the sesquiterpenes and GLV were decreased in the emission profile. Emission of other identified VOCs compounds increased, including β-myrcene, limonene, santolina triene, (+)-α-pinene, (-)-β-pinene), and the smallest for alcohols such as (Z)-β-terpineole and farnesol. The largest decrease in the percentage of the profile we showed for (Z)-3-hexen-1-ol acetate. Results of the olfactory tests showed that IV instar larvae and alatae female P. juglandis and Ch. juglandicola accepted all enantiomers (-)- / (+)-α-pinene and (-)- / (+)-β-pinene. However, I-III instar larvae showed low acceptance of these compounds. In case of application (-)-limonene no acceptance by all morphs of P. juglandis and Ch. juglandicola was revealed, instead (+)-limonene was only not accepted by I-III instar larvae. Analysis of the distance covered by aphidstreated with (-)- and (+)-limonene showed much longer distance in case of alatae females than by I-III instar larvae. Such reaction shows the effect of escaping due tested VOCs and the enantiomers of limonene exhibit repellent activity to P. juglandis and Ch. juglandicola. Sesquiterpenes have been accepted by IV instar larvae and alatae females, instead EßF and α-farnesene was not accepted by I-III instar larvae. In addition, (Z)-3-hexen-1-ol acetate was strongly accepted by alatae female, and less accepted by larvae. 142