MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: 111-118 Zastosowanie metod molekularnych w diagnostyce zakażeń Clostridium difficile The use of molecular methods in the diagnosis of Clostridium difficile infections Grażyna Dulny 1,2, Grażyna Nurzyńska 2, Szymon Walter de Walthoffen 3, Agnieszka Kraśnicka 2, Grażyna Młynarczyk 3 Zakład Profilaktyki Zagrożeń Środowiskowych i Alergologii WUM Samodzielny Publiczny Centralny Szpital Kliniczny w Warszawie Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej WUM Założeniem niniejszej pracy było zastosowanie metod molekularnych do szczegółowej identyfikacji wybranych szczepów C. difficile uzyskanych od pacjentów hospitalizowanych w latach 2008 i 2011 w SP CSK w celu potwierdzenia ich toksynotwórczości oraz określenia cech epidemicznych, w tym występowania przypuszczalnego szczepu C. difficile 027/NAP1/B1. Materiałem pierwotnie podlegającym badaniu był świeżo pobrany kał od pacjentów, u których wystąpiła biegunka. Próbki kału były badane na obecność toksyn A i B metodą immunoenzymatyczną oraz na obecność C. difficile metodą posiewu. Szczepy po ich wyizolowaniu przechowywano na podłożach MICROBANK, w temperaturze -70 0 C. Z tak przygotowanej kolekcji, do badań molekularnych wybrano 48 szczepów wyizolowanych w 2008 roku oraz 28 szczepów wyizolowanych w 2011. Wśród izolatów C. difficile poddanych badaniom molekularnym stwierdzono 6 szczepów 027/NAP1/BI wśród 48 badanych szczepów wyizolowanych w 2008 roku co stanowiło 12,5% oraz 24 szczepy 027/NAP1/BI wśród 28 szczepów wyizolowanych w 2011 roku co stanowiło 85,7%. Wykrycie występowania hiperepidemicznego szczepu C. difficile jest kluczowe dla podejmowania działań przeciwepidemicznych w placówkach służby zdrowia, w których te zachorowania występują coraz częściej i są odpowiedzialne za ogniska szpitalne Słowa kluczowe: Clostridium difficile, badania molekularne, zakażenia szpitalne.
112 G. Dulny i inni Nr 2 ABSTRACT Introduction: The aim of this study was to use molecular methods to identify selected strains of C. difficile isolated from patients hospitalized at Independent Public Central Teaching Hospital [SP CSK] between 2008 and 2011 in order to demonstrate their toxigenic character and to determine their epidemic potential, including the incidence of a suspected C. difficile strain 027/NAP1/B1. Material and methods: Originally evaluated material consisted of freshly collected stool samples from patients who had developed diarrhea. Stool samples were assessed for toxins A and B via an immunoenzymatic method and for the presence of C. difficile via the first culture method. The isolated strains were stored on MICROBANK mediums, at 70 0 C. From this sample collection, 48 strains isolated in 2008 and 28 strains isolated in 2011 were selected for molecular analyses. Results: Among the C. difficile isolates that underwent molecular analyses there were 6 strains 027/NAP1/BI out of the 48 evaluated strains isolated in 2008, which constituted 12,5% and 24 strains 027/NAP1/BI out of the 28 strains isolated in 2011, which constituted 85,7%. Conclusions: Identification of a possible hyperepidemic strain of C. difficile is crucial for undertaking any anti-epidemic activities in health care facilities, where such activities are more and more common and are responsible for nosocomial foci of infection. Key words: Clostridium difficile, molecular analysis, nosocomial infections. WSTĘP Laseczki Clostridium difficile występują na całym świecie, zasiedlając przewód pokarmowy zarówno ludzi jak i zwierząt. Można je również znaleźć w środowisku naturalnym, np. w wodzie i glebie (1,2). Najczęściej szacuje się, że około 3% dorosłej populacji ludzi nosi ten drobnoustrój w przewodzie pokarmowym, ale raczej nie jest on uznawany za składnik naturalnej flory. Wśród niemowląt nosicielstwo jest znacznie częstsze i wynosi nawet 66%. Za chorobotwórczość C. difficile odpowiadają wytwarzane przez ten drobnoustrój toksyny, w tym toksyny A, B i toksyna binarna. Około 80% szczepów C. difficile wytwarza co najmniej jedną z tych toksyn (1,2). Obecnie przyjmuje się, że szczepy chorobotwórcze wytwarzają przede wszystkim toksynę B, która jest markerem wirulencji (3). Obecnie wyodrębniono około 300 rybotypów szczepów C. difficile (4,5). Badania mikrobiologiczne w kierunku C. difficile opierają się na wykryciu w kale obecności bakterii albo wyprodukowanych przez nie toksyn, przy czym w przypadku wykrycia bakterii, konieczne jest potwierdzenie ich toksynotwórczości (6). Obecność C. difficile w kale można stwierdzić metodą hodowlaną, wykonując posiew kału na selektywne podłoża lub przy pomocy szybkiego testu wykrywając bezpośrednio w kale dehydrogenazę glutaminianową (GDH) produkowaną przez wszystkie szczepy C. difficile. Wykrycie toksyn przy użyciu testu neutralizacji efektu cytotoksycznego na hodowlach komórkowych, jest stosowane rzadko. W rutynowej diagnostyce do wykrywania toksyn wykorzystuje się na ogół szybkie testy lateksowe i immunoenzymatyczne. Coraz częściej wykorzystuje się również metody molekularne, w których bezpośrednio
Nr 2 Molekularna diagnostyka zakażeń C. difficile 113 w kale wykrywane są geny C. difficile warunkujące produkcję toksyn oraz w niektórych testach dodatkowo inne geny. Stosuje się metody oparte na amplifikacji kwasów nukleinowych, PCR lub Real-Time PCR (7). Obecnie w Polsce są dostępne schematy diagnostyki mikrobiologicznej w kierunku C. difficile zalecane przez Krajowego Konsultanta d/s Mikrobiologii, opracowane na podstawie algorytmu proponowanego przez Amerykańskie Towarzystwo Mikrobiologów (ASM) oraz zaleceń Amerykańskiego Towarzystwa Chorób Zakaźnych (IDSA) ( 8,9,10). W USA już w 1980 roku wyodrębniono szczep, określony później metodą PCR jako rybotyp-027, w metodzie REA typ-bi, w metodzie PFGE pulsotyp NAP1, charakteryzujący się wysoką patogennością i dużym potencjałem epidemicznym. Szczep 027/NAP1/ B1 epidemie zaczął jednak wywoływać dopiero od 2000 roku (11). Od 2003 roku Szczep 027 jest przyczyną zachorowań w postaci ognisk szpitalnych, które miały miejsce w USA i Kandzie, a obecnie są notowane w Europie (12). W okresie epidemicznego wzrostu zachorowań spowodowanych przez C. difficile, rybotyp 027 był odpowiedzialny za 67-82% zachorowań. Najprawdopodobniej szczep 027 został wyselekcjonowany przez wprowadzenie do lecznictwa fluorochonolonów (11). W szczepie 027 w obrębie genu tcdc, (negatywny regulator produkcji toksyn) wykryto delecję o wielkości 18-bp, a także dodatkową delecję pojedynczych par zasad w pozycji 117, co w efekcie powoduje, że szczep ten produkuje 16 razy więcej toksyny A i 23 razy więcej toksyny B, w porównaniu do szczepu wzorcowego należącego do toksynotypu 0 (szczep VPI10463). Co więcej, szczepy rybotypu 027 wykazują większą łatwość przechodzenia w spory niż większość innych tego gatunku, co skutkuje zwiększeniem współczynnika sporulacji tj. odsetka form wegetatywnych przechodzących w spory. Zwiększa on także produkcję spor w obecności środków dezynfekcyjnych, nie posiadających właściwości sporobójczych oraz produkuje toksyny zarówno w fazie logarytmicznego wzrostu jak i w stacjonarnej fazie wzrostu bakterii. W ostatnich latach pojawiły się prace kwestionujące zwiększoną wirulentność rybotypu 027 oraz szczepów posiadających delecję w genie tcdc w pozycji 117 (13). Rybotyp 027 posiada charakterystyczny wzór oporności. Jest on oporny na fluorochinolony (posiada mutacje warunkujące oporność w genach gyra i gyrb) natomiast jest wrażliwy na klindamycynę (szczep nie posiada genu ermb, warunkującego oporność na makrolidy, linkozamidy, i streptograminyb) (11). Szczep ten może wykazywać kliniczną oporność na leczenie metronidazolem i częściej niż inne szczepy powoduje powikłania, między innymi colitis fulminant 11% vs 3%. Podawanie metronidazolu, wankomycyny czy linezolidu w subklinicznych dawkach może stymulować transkrypcję genów i produkcję toksyn. Celem niniejszej pracy było zastosowanie metod molekularnych do diagnostyki wybranych szczepów C. difficile uzyskanych od pacjentów hospitalizowanych w 2008 roku oraz w 2011 roku w SP CSK, w celu potwierdzenia ich toksynotwórczości oraz określenia cech epidemicznych, w tym przypuszczalnej przynależności do klonu C. difficile 027/NAP1/B1. MATERIAŁ I METODY W Samodzielnym Publicznym Centralnym Szpitalu Klinicznym w 2008 i 2011 roku diagnostyka mikrobiologiczna w kierunku C. difficile dla hospitalizowanych chorych była prowadzona w Zakładzie Mikrobiologii WUM. Materiałem podlegającym badaniu był
114 G. Dulny i inni Nr 2 świeżo pobrany kał. Próbki kału były badane na obecność toksyn A i B metodą immunoenzymatyczną oraz na obecność C. difficile metodą posiewu. W 2008 roku nie wszystkie próbki były badane na obecność toksyn, natomiast w roku 2011, postępowano już zgodnie z zaleceniami ASM (9). Posiew kału. Posiew wykonywano niezwłocznie po dostarczeniu materiału do badania. Materiał posiewano na gotowe podłoże CLO (wybiórcze podłoże z dodatkiem antybiotyku i krwi) firmy biomerieux. Posiewy inkubowano w warunkach beztlenowych (85% N, 10% CO 2, 5% H), w komorze do hodowli beztlenowców firmy Heraeus, w T 370 C przez 48-72 godziny. Identyfikacji bakterii dokonywano na podstawie: wzrostu w warunkach beztlenowych, wyglądu koloni (szaro-zielone płaskie, o nieregularnych brzegach), zapachu (intensywny zapach parakrezolu) efektu fluorescencji w lampie Wooda (fluoryzacja na kolor żółtozielony), preparatu barwionego metodą Grama (Gram-dodatnie laseczki). W przypadkach wątpliwych potwierdzenie identyfikacji uzyskiwano przy użyciu testu biochemicznego API 20A firmy biomerieux. Test immunoenzymatyczny. Oznaczanie toksyn w kale prowadzone było przy użyciu testu immunoenzymatycznego EIA C. difficile TOX A/B II firmy TECHLAB Inc. Blacksburg,VA.USA wykrywającego bezpośrednio w kale obecność toksyn A i B produkowanych przez toksynotwórcze szczepy C. difficile. Test wykonywano zgodnie z instrukcją podaną przez producenta, stosując odczynniki dołączone do zestawu. Wynik badania odczytywano wizualnie. Intensywność reakcji, która odzwierciedlała ilość toksyn, odczytywano jako wynik od + do ++++. Szczepy bakteryjne. Materiał stanowiły wybrane szczepy C. difficile wyizolowane od pacjentów hospitalizowanych w SP CSK w 2008 r. i w 2011 r. w Zakładzie Mikrobiologii SP CSK. Każdy szczep pochodził od innego pacjenta. Szczepy po ich wyizolowaniu do czasu badań molekularnych były przechowywane na podłożach MICROBANK, w głębokim zamrożeniu w temperaturze -70 0 C. Z tak przygotowanej kolekcji do badań molekularnych wybrano 48 szczepów C. difficile wyizolowanych w 2008 roku oraz 28 szczepów wyizolowanych w 2011. Badania molekularne. Szczepy poddano badaniom przy użyciu metody Real-TimePCR testem Cepheid Xpert C. difficile, na aparacie GeneXpert, w kierunku posiadania przez szczep genów toksyny TcdB (tcdb) i toksyny binarnej jak również delecji tcdc w pozycji 117. Wszystkie czynności wykonywano zgodnie z zaleceniami producenta. WYNIKI Liczba wykonanych ogółem badań w kierunku C. difficile w SP CSK w przeliczeniu na 1000 osobodni wyniosła 5,19 w 2008 roku i 8,79 w 2011 roku, a odsetek badań dodatnich wyniósł odpowiednio 22% w 2008 roku i 32% w 2011 roku. W badaniach w których zastosowano metodę hodowli, zachowano uzyskane szczepy i stanowiły one przedmiot dalszych badań molekularnych. W tabeli I przedstawiono wyniki oznaczania toksyny w kale metodą immunoenzymatyczną, uzyskane dla próbek kału, z których później wyhodowane szczepy C. difficile zostały użyte do dalszych badań. W przypadku 48 szczepów pochodzących z 2008 roku były to wszystkie dostępne, pochodzące od różnych chorych, u których odnotowano objawy kliniczne sugerujące
Nr 2 Molekularna diagnostyka zakażeń C. difficile 115 Tabela I. Wyniki oznaczania toksyn w próbkach kału, z których pochodziły szczepy C. difficile wyizolowane w 2008 i 2011 roku wybrane do badań molekularnych. Liczba szczepów wybranych do badań wyizolowanych w 2008 roku Oznaczenie toksyn A/B metodą EIA w ZM 2 Toksyny A/B obecne AB+ 4 Toksyny A/B obecne AB++ 5 Toksyny A/B obecne AB+++ 22 Toksyny A/B obecne AB++++ 15 Toksyn A/B nie oznaczono Razem 48 Liczba szczepów wybranych do badań wyizolowanych w 2011 roku Wynik oznaczenia toksyn metodą EIA Oznaczenie toksyn A/B metodą EIA w ZM 28 Toksyny A/B obecne AB++++ Wynik oznaczenia toksyn metodą EIA AB+/AB++/AB+++/AB++++/ Intensywność reakcji, która odzwierciedlała ilość toksyny AB w kale, odczytywana jako wynik od + do ++++ zakażenie C. difficile, w tym również takie szczepy, które pochodziły z próbek kału gdzie nie wykonano wówczas bezpośrednio oznaczenia toksyn metodą immunoenzymatyczną. Badaniom poddano również 28 szczepów izolowanych w 2011 roku. Wybrano tym razem wyłącznie szczepy pochodzące z próbek kału, dla których wyniki uzyskane metodą immunoenzymatyczną były zdecydowanie dodatnie (wszystkie ocenione jako +++). Wszystkie szczepy przebadano przy użyciu metody real-time PCR, w aparacie GeneXpert. W tej metodzie w pojedynczej reakcji multipex PCR wykrywano geny tcdb, cdta i cdtb oraz delecję genu tcdc w pozycji 117. Wyniki przedstawiono w tabeli II. Tabela II. Wyniki uzyskane przy użyciu aparatu GeneXpert dla szczepów C. difficile pochodzących z roku 2008 oraz 2011. Rok Liczba szczepów ogółem cdb + cdta/b - del - cdb - cdta/b + del - Wykryte kombinacje genów cdb cdb + cdta/b + - cdta/b + del - del + cdb + cdta/b + del + cdb - cdta/b - del - 2008 48 41 0 0 0 6 (12,5%) 1 2011 28 4 0 0 0 24 (85,7%) 0 W 2008 roku na 48 przebadanych szczepów C.difficile metodą Real Time PCR przy użyciu GeneXpert szczep typu 027/NAP1/BI został wykryty w 6 przypadkach (12,5%), a w 2011 roku na 28 szczepów przebadanych szczepów C.difficile, szczep typu 027/NAP1/ BI został wykryty w 24 przypadkach (85,7%). Jak należało się spodziewać wyniki dodatnie, uzyskane metodą bezpośredniego poszukiwania toksyny w kale wykazywały dużą zgodność z wynikami określającymi toksynotwórczość metodą molekularną. Jednakże istniały pewne różnice, które zostały przedstawione w tabeli III. W badaniu rozbieżności nie uwzględniono tych szczepów z 2008 roku, w przypadku których wynik bezpośredniego badania próbek kału na obecność toksyn był nieznany. Różnice zostały przedstawione w tabeli III.
116 G. Dulny i inni Nr 2 Tabela III. Różnice wyników dotyczących markerów zakażenia C. difficile, uzyskanych różnymi metodami badań Rok Liczba Pacjentów Wynik testu EIA obecność TcdA i/lub TcdB w kale Real-Time-PCR Obecność tcdb 2008 1 + - 2011 0 0 0 DYSKUSJA Założeniem niniejszej pracy było zastosowanie metod molekularnych do diagnostyki wybranych szczepów C.difficile uzyskanych od pacjentów hospitalizowanych w 2008 roku oraz w 2011 roku w SP CSK w celu określenia cech epidemicznych uzyskanych izolatów w tym występowania szczepów C. difficile 027/NAP1/B1 jak również weryfikacji metod immunoenzymatycznych metodami molekularnymi. W 2008 roku jak również w 2011 roku w SP CSK do diagnostyki zakażeń C.difficile były stosowane metody hodowane jak również test immunoenzymatyczny wykrywający toksyny A i B w kale zgodnie wytycznymi American Society for Microbiology (ASM) z 2010 roku ( 9). Z tym, że stosowany test immunoenzymatyczny EIA firmy TECHLAB nie różnicuje czy jest obecna toksyna A lub B czy obie jednocześnie oraz nie wykazuje obecności toksyny binarnej ani innych właściwości szczepów. Tak więc metoda ta różnicuje wyhodowane szczepy C.difficile tylko w zakresie ich toksynotwórczości, co jest wystarczające dla celów diagnostycznych ale nie wystarczające dla celów epidemiologicznych (5,6). W celu pogłębienia diagnostyki epidemiologicznej poddano wytypowane szczepy badaniom molekularnym przy zastosowaniu metody RealTime PCR. Na 76 weryfikowanych wyników badań tylko w 1 przypadku (1,3%) wynik uzyskany w Zakładzie Mikrobiologii metodą immunoenzymatyczną EIA był niezgodny z wynikiem otrzymanym w metodą molekularną. Brak zgodności wyniku wykonanego w Zakładzie Mikrobiologii z badaniem szczepu metodą molekularną może być spowodowany między innymi tym, że wyniki immunoenzymatycznego testu EIA na obecność toksyny w kale były odczytywane wizualnie i polegały na ocenie zabarwienia. W przypadku słabododatnich wyników testu EIA (słabe wysycenie koloru) wydanie wyniku dodatniego było korelowane z wynikiem posiewu- jeżeli posiew był dodatni to słabo dodatni wynik na obecność toksyny uznawano jako dodatni. Poza tym przy niezgodności testów wykonywanych różnymi metodami należy również wziąć pod uwagę wyniki badań czułości i swoistości poszczególnych testów. Według badań testy immunoenzymatyczne wykrywające obecność toksyny A/B bezpośrednio w kale wykazują czułość i swoistość odpowiednio na poziomie 60% i 95% (8). Najbardziej prawdopodobne jest jednak, że w badanej próbce znajdowały się dwa różne szczepy C. difficile, toksynotwórczy i nietoksynotwórczy, a wyhodowano szczep nietoksynotwórczy. Stąd obecność toksyny w kale, a brak u wyhodowanego szczepu. Przeprowadzone badania szczepów C. difficile metodą Real-Time PCR w aparacie GeneXpert, pozwoliły wykryć obecność w SP CSK hipertoksynogennego i hiperepidemicznego
Nr 2 Molekularna diagnostyka zakażeń C. difficile 117 szczepu 027/NAP1/BI, lub szczepu o podobnych właściwościach (obecność genów toksyny binarnej, delecja tcdc w pozycji 117). Procentowy udział szczepów 027/NAP1/BI wśród ogólnej liczby izolatów C. difficile poddanych badaniom molekularnym wynosił odpowiednio: 6 izolatów wśród 48 badanych szczepów wyizolowanych w 2008 roku, co stanowiło 12,5% oraz 24 szczepy wśród 28 szczepów wyizolowanych w 2011 roku co stanowiło 85,7%. Uzyskane wyniki wskazują na dość znaczny udział ogółem oraz niewątpliwy wzrost udziału szczepu 027/NAP1/BI w wywoływaniu zachorowań o etiologii C. difficile wśród hospitalizowanych pacjentów (12,5% w 2008 roku i 85,7% w 2011 roku ). Odsetek tych szczepów jest znacząco wyższy od średniej europejskiej, która w badaniach przeglądowych przeprowadzonych w 2008 roku wyniosła 5% (5). WNIOSKI Oceniając przydatność analizowanych metod diagnostycznych dla celów prowadzonego nadzoru epidemiologicznego, należy stwierdzić, że najwięcej informacji przydatnych do dalszego wnioskowania epidemiologicznego, dostarcza metoda Real-Time PCR, ponieważ poprzez wykrycie obecności tych trzech genów określa możliwość przynależności do hiperepidemicznego rybotypu szczepu C. difficile 027/NAP1/BI. Wykrycie występowania hiperepidemicznego szczepu C.difficile jest kluczowe dla podejmowania działań przeciwepidemicznych w placówkach służby zdrowia, w których te zachorowania występują coraz częściej i są odpowiedzialne za ogniska szpitalne (14). PIŚMIENNICTWO 1. Jagielski M. Etiologia, obraz kliniczny i diagnostyka ostrych zakażeń i zarażeń przewodu pokarmowego oraz zatruć pokarmowych. Wyd.1. Warszawa: medbook.com.pl. 2010;130-149. 2. Pituch H. Zakażenia Clostridium difficile w Polsce Nowa Epidemiologia. Rozprawa habilitacyjna. Warszawa. Wydawnictwo WUM. 2008. 3. Carter GP, Rood JI, Lyras D. The role of toxin A and toxin B in the virulence of Clostridium difficile. Trends Microbiol. 2012 Jan ; 20 (1) : 21-9. 4. Rupnik M.: http://164.8.68.130/mikro/tox/. August. 2011. 5. Bauer MP, Notermans DW, Benthem BH i inni. Study Group.www.thelancet.com Vol. 377.Januar 1:2011:63-73. 6. Petersom LP, Robicsek A. Does my patient have Clostridium difficile infection. Annuals of Internal Medicine. Vol. 151. No 3. August 2009:176-9. 7. Novak-Weekley SM, Marlowe EM, Miller JM i inni. C. difficile testing in the Clinical Laboratory by Use of Multiple Testing Algorithms. J Clin Microbiol March 2010; 48: 3; 889-93. 8. Hryniewicz W, Martirosian G, Ozorowski T. Zakażenia Clostridium difficile, diagnostyka, profilaktyka, terapia, wyd. Ministerstwo Zdrowia, Warszawa 2011, www.antybiotyki.edu.pl. 9. American Society of Microbiology. A Practical Guidance Document for the Laboratory Detection of Toxigenic C. difficile September 21, 2010, www.asm.org. 10. Cohen SH, Gerding DN, Johnson S i inni. Clinical Practice Guidelines for Clostridium difficile Infection in Adults: 2010 Update by the Society for Healthcare Epidemiology of America (SHEA) and the Infectious Diseases Society of America (IDSA). Infection Control and Hospital Epidemiology 2010.Vol. 31. No. 5; 431-55.
118 G. Dulny i inni Nr 2 11. Barbut F, Mastrantonio P, Delmee M i inni. Prospective study of C. difficile infections in Europe with phenotypic and genotypic characterization of the isolates. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Disease.CMI.2007;13; 1048-57. 12. Kuijper EJ. Emergence of C. difficile associated disease in North America and Europe, ESCMID, Vol. 12, Supp.6;2006;2-18. 13. Walk ST, Micic D, Jain R i inni. Clostridium difficile ribotype does not predict severe infection Clin Infect Dis. 2012 Dec;55(12):1661-8. 14. Olędzka-Orędziak M, Lesiński J, Wiktorowicz M i inni. Clostridium difficile w populacji pacjentów hospitalizowanych - narastający problem terapeutyczny.fam, & Primary Care Reviev 2010;12;769-71. Otrzymano: 13 V 2013 r. Adres Autora: 02-097 Warszawa ul. Banacha 1a, Samodzielny Publiczny Centralny Szpital Kliniczny, Tel./Fax 225992610, e-mail: grazynadulny@wp.pl