Zasady pobierania prób i interpretacji wyników badań laboratoryjnych Serologia. Interpretacja wyników badań W badaniach serologicznych laboratoria posługują się przede wszystkim komercyjnymi testami ELISA. Na rynku dostępnych jest co najmniej kilka-, kilkanaście testów, każdy z nich przeznaczony do wykrywania konkretnej jednostki chorobowej (np. PRRS u świń czy IB u kur etc). Zasada działania testu ELISA jest bardzo prosta, wykrywa obecność przeciwciał (zwykle klasy IgG, IgY u ptaków) dla jednego antygenu (np. dla wirusa PRRS). Jeżeli w badanej surowicy znajdują się przeciwciała (np. dla wirusa PRRS) to stwierdzimy reakcję barwną. Zwykle natężenie reakcji barwnej jest skorelowane z ilością przeciwciał. Schemat zasady działania testu jest nieskomplikowany jednak nie doceniamy jego możliwości. Ponad 80% zleceń ogranicza się do zlecenia określenia czy są przeciwciała czy też ich nie ma. Mała grupa lekarzy oczekuje określenia wysokości mian a garstka zleca wykonanie tzw. profilów. Sytuacja ta ulega poprawie, mam nadzieję, że także poprzez organizowane przez nas bezpłatne comiesięczne seminaria laboratoryjne. Możliwości interpretacji to przedstawienie wyniku badania. najprostsze 0 1 jedynkowe ujęcie o stwierdzono obecność przeciwciał dla antygenu. 05 wyników dodatnich (05/10) zasadniczo ogranicza się do jednostek gdzie inne dane nie są potrzebne np., PRV, CSF, ASF) choroby zwalczane z urzędu. wynik rozwinięty, tabelaryczny Ryc. 1. o określa wynik badania ( +, -, ewentualnie +/- ) o określa przedział (grupę) wysokości mian. Wartość umowna pozwalająca na łatwe zorientowanie się czy wysokość mian mieści się w wysokich czy niskich przedziałach. o określa wysokość mian. o przyporządkowanie wyników do konkretnego osobnika lub grupy osobników graficzna forma wyniku Ryc. 2 o histogram grupuje wyniki w umowne przedziały (grupy) usystematyzowane wg wielkości mian. Grupa przy osi odciętej i rzędnej przedstawia zbiór wyników ujemnych (w tym przykładzie 9 osobników). Grupa X najdalej w prawo na osi odciętych to zbiór wyników o najwyższych mianach w tym przykładzie 4 osobniki znajdują się w grupie najwyższych poziomów przeciwciał) pozwala na wizualne natychmiastowe zorientowanie się w sytuacji stada, także w doborze próbek ocena rozrzutu wyników
-2- Ryc. 3 o profil wiekowy uporządkowanie i przyporządkowanie wyników do grup wiekowych (technologicznych) pozwala na wizualną ocenę statusu stada w poszczególnych grupach wiekowych pozwala na porównanie grup pozwala na szybką ocenę stanu zagrożenia dla poszczególnych grup pozwala na dokonanie wyboru terminów zabiegów (szczepienia, leczenie wyprzedzające - metafilaktykę) Siłą rzeczy ilość kombinacji wyników badań serologicznych jest olbrzymia, zatem w krótkiej publikacji przedstawić można tylko najbardziej podstawowe zasady. Wyniki badań bakteriologicznych, PCR, biochemicznych, toksykologicznych, parazytologicznych określają stan obecny. Znajdujemy w nich odpowiedź czy wykryto obecność bakterii, materiału genetycznego, pasożytów lub czynników toksycznych etc.. Wyniki badań serologicznych przedstawiają także obecny stan odpowiedzi immunologicznej organizmu. Jednak odpowiedź immunologiczna pojawia się po pewnym czasie od infekcji. Pierwsze przeciwciała (klasa IgM) pojawiają się wprawdzie już po kilku dniach od zakażenia, jednak klasa IgG nieco później. W diagnostyce laboratoryjnej komercyjne testy wykrywają przeciwciała IgG. Aby zmniejszyć ilość reakcji niespecyficznych firmy produkujące testy ELISA przyjmują wysokie progi przeciwciał jako wyniki dodatnie, co w konsekwencji powoduje dalsze opóźnienie wykrywania osobników seropozytywnych. Zjawisko to znane jest wszystkim lekarzom weterynarii, mimo to często dochodzi do błędów interpretacyjnych. Kilka przykładów: Ryc. 4 histogram. W badaniu serologicznym otrzymano 10 wyników ujemnych Interpretacja: przed zinterpretowaniem należy wiedzieć: wielkość stada!!. 10 próbek jest wystarczająca przy około 23% prewalencji. czy jest to badanie monitoringowe czy jest to badanie rozpoznawcze o historia choroby jeżeli proces trwa > 3 tyg można wykluczyć schorzenie jeżeli proces trwa krócej wymagane jest badanie uzupełniające po 2-3 tyg (pary surowic) o sposób doboru próbek losowy (jeżeli proces trwa > 3 tyg wykluczenie podejrzenia, jeżeli krócej badanie par surowic) od sztuk chorych (konieczne powtórne badanie sztuk po przechorowaniu) od sztuk po przechorowaniu (wykluczone podejrzenie) od sztuk młodych z przeciwciałami biernymi (tu brak, w konsekwencji wnioski dotyczące zabezpieczenia stada podstawowego) 2
-3- określenie skuteczności szczepienia (ważny odstęp próbkowania od ostatniego szczepienia) Ryc. 5 histogram otrzymano 38 wyników dodatnich Interpretacja: przed zinterpretowaniem należy wiedzieć: wielkość stada tu około 7% prewalencji. czy jest to badanie monitoringowe czy jest to badanie rozpoznawcze o historia choroby jeżeli proces trwa > 3 tyg schorzenia nie można wykluczyć. Do infekcji dojść mogło jednak i kilka miesięcy wcześniej. jeżeli proces trwa krócej podejrzenie w zasadzie wykluczone. W tak krótkim czasie nie dojdzie do wytworzenia przeciwciał u wszystkich osobników i to na tak wysokim poziomie. o sposób doboru próbek losowy (jeżeli proces trwa >~ 3-5 tyg schorzenia nie można wykluczyć. od sztuk chorych (wykluczone podejrzenie) od sztuk po przechorowaniu (schorzenia nie można wykluczyć. Do infekcji dojść mogło jednak i kilka miesięcy wcześniej) określenie skuteczności szczepienia (ważny odstęp próbkowania od ostatniego szczepienia) Prześledźmy kolejne fazy schorzenia. Pierwszą fazę prezentuje Ryc. 4. Pomimo objawów chorobowych organizm nie zdołał jeszcze wytworzyć przeciwciał. (do nawet > 3 tyg po infekcji) Założenie: Materiał pobrano od jednorodnej grupy zwierząt, dobór losowy. Ryc. 6 W początkowych (ale nie bardzo wczesnych) fazach choroby część stawki zwierząt wykształciła już przeciwciała inne nie zetknęły się jeszcze z patogenem. Otrzymujemy wyniki ujemne oraz dodatnie Histogram to nic innego jak zwierzęta uporządkowane od tych mających najmniej przeciwciał (te po lewej stronie histogramu) po te z najwyższym ich poziomem (w kierunku do prawej). Ryc. 7 po pewnym czasie trwania choroby większość wyników znajdzie się po stronie dodatniej, by po ustabilizowaniu się osiągnąć obraz zbliżony do przedstawionego na ryc. 5. Powrót do takiego obrazu możliwy jest także po stopniowym zmniejszaniu się miana (schorzenia w których po chorobie dochodzi do zaniku przeciwciał np. IB, ILT, PRRS, Mhp etc). W przypadku niektórych jednostek przeciwciała utrzymują się przez całe życie (np. MD, IBR, BVD, EA, PRV 3
-4- Ryc.8 typowa klasyczna a może raczej pożądana reakcja po szczepieniu. Jest to obraz typowej krzywej Gaussa. Średnia reakcja mieści się w V grupie. Jak wszędzie część osobników reagować będzie nieco słabiej a inna część będzie bardziej reaktywna. Im więcej osobników mieści się w grupie średniej (tu V) tym lepiej, tym stado jest bardziej jednorodne, podobny obraz może pojawić się podczas trwania schorzenia, jednak zwykle przy bardzo szybkim i krótkim przebiegu (np. Gumboro) Ryc. 9 obraz badania dwóch grup łącznie np. po zakupie np. dwóch grup wiekowych np. po szczepieniu/przed szczepieniem np. z dwóch obiektów Profil serologiczny dość często unikany z uwagi na subiektywne odczucie jego skomplikowania. Tymczasem jest to prosta układanka elementów. Elementem podstawowym jest porównanie dwóch grup. Ryc. 10 najprostszym przykładem profilu jest porównanie wartości poziomów przeciwciał w dwóch grupach wiekowych technologicznych w przykładzie pokazano serokonwersję ujemną (czyli spadek przeciwciał). Jeżeli badanie miało charakter diagnostyczny to taki wynik wskazuje za dawnym zakażeniem (lub szczepieniem). Przyjmuje się w badaniu par surowic, że > 30% wzrost poziomu przeciwciał (odstęp badania 2-3 tyg), świadczy o aktywnym procesie chorobowym. Łączenie elementów po kilka daje profil złożony. Porównujemy w nim kolejne następujące po sobie grupy (zwykle wiekowe) oceniając charakter zmian oraz dynamikę tych zmian. Wizualizacja ułatwia interpretację i nawet przy małym doświadczeniu łatwiej o prawidłową ocenę sytuacji stada. 4
-5- Ryc. 11 w tym przykładzie badano grupy wiekowe pod kątem PRRS 2 tydz. przeciwciała matczyne 4-6 tydz spadek do zera przeciwciał matcznych o okres podatności na zachorowania o termin optymalnych szczepień 9 tydz gwałtowne pojawienie się przeciwciał w wyniku zakażenia 17 tydz spadek poziomu przeciwciał po ustabilizowaniu się sytuacji w chlewni maciory średnie wartości mian u macior Po wyjaśnieniu zasady tworzenia profilu złożonego łatwiej już o interpretację profili polietiologicznych. W tym przypadku nakłada się na siebie kilka elementów jednocześnie np. poziomów witamin w surowicy, poziom przeciwciał dla np. antygenu PRRS, Lawsonia, zawartości mikotoksyn w surowicy etc. Jeżeli na taki profil nałożymy sytuację w chlewni (zabiegi technologiczne, przerzuty, wreszcie pojawianie się schorzeń) to bardzo efektywnie znajdziemy element krytyczny w wieloczynnikowych tłach schorzeń. Ryc. 12. 5