WPŁYW CYTOKININ NA MIKROPROPAGACJĘ Arnica montana L.

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: 289-296 WPŁYW CYTOKININ NA MIKROPROPAGACJĘ Arnica montana L. Alina Trejgell, Magdalena Michalska, Andrzej Tretyn Zakład Biotechnologii, Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Wstęp Arnica montana jest byliną (hemikryptofitem) posiadającą krótkie, grube kłącze i pęd nadziemny osiągający 60 cm wysokości, u podstawy którego znajduje się rozeta liści. W górnej części łodyga rozgałęzia się, a odgałęzienia w liczbie od 1 do kilku zakończone są pojedynczymi koszyczkami o średnicy 5-8 cm. Kwiaty brzeŝne (języczkowate) są Ŝeńskie, a środkowe (rurkowate) są obupłciowe. Wszystkie kwiaty w koszyczku są barwy złocisto-ŝółtej. Gatunek kwitnie od czerwca do sierpnia i zapylany jest przez owady, ale występuje teŝ samozapylenie [PIĘKOŚ-MIRKOWA, MIREK 2003]. Owocem jest niełupka z wieńcem Ŝółtych włosków puchu kielichowego na szczycie, ułatwiającym rozsiewanie nasion przez wiatr [POLAKOWSKI 1995]. A. montana występuje w zachodniej i środkowej części Europy, na północ sięga aŝ do Skandynawii, a na południu do Półwyspu Iberyjskiego, północnych części Półwyspu Bałkańskiego i Apenińskiego. W Polsce najliczniej występuje w Sudetach, natomiast rozproszone stanowiska zlokalizowano w Karpatach, na WyŜynie Małopolskiej, w Górach Świętokrzyskich, na Nizinie Sandomierskiej, w Wielkopolsce i na Pomorzu Zachodnim [PIĘKOŚ-MIRKOWA, MIREK 2003]. A. montana jest gatunkiem o właściwościach leczniczych. Zawiera liczne związki chemiczne: garbniki, aminy, fitosterole, kwasy organiczne, karetonoidy, flawonoidy, olejek eteryczny (0,15%) i glikozyd arnicynę. Do celów leczniczych stosowane są kwiatostany zbierane na początku okresu kwitnienia. Preparaty otrzymane z arniki górskiej stosowane są zewnętrznie: na stłuczenia, obrzęki pourazowe, krwiaki, oparzenia, owrzodzenia jamy ustnej i dziąseł [ANTKOWIAK 1998; KOO i in. 2000]. Stosowane są równieŝ doustnie w zaburzeniach wieńcowego i mózgowego krąŝenia krwi. Mają działanie przeciwzapalne, wzmagają wydzielanie Ŝółci, soku Ŝołądkowego i produkcję moczu [WEREMCZUK-JEśYNA i in. 2006]. Przyczyn tendencji regresywnych A. montana moŝemy doszukiwać się w naturalnych zjawiskach sukcesji ekologicznej. Ponadto zmniejszenie liczby stanowisk i wielkości populacji tego gatunku wynika z pozyskiwania duŝej ilości materiału zielarskiego z naturalnych stanowisk. Oprócz objęcia A. montana ścisłą ochroną gatunkową prowadzi się prace nad wprowadzeniem tego gatunku do uprawy [LUIJTEN i in. 1996] oraz namnaŝaniem w kulturach in vitro [BUTIUC-KEUL, DELIU 2001]. Celem przedstawionej pracy było opracowanie efektywnego systemu regeneracji dla A. montana ze sterylnych 10-dniowych siewek.

290 A. Trejgell, M. Michalska, A. Tretyn Materiały i metody Materiałem wyjściowym do badań były 10-dniowe sterylne siewki Arnica montana L. Nasiona sterylizowano w 70% (v/v) EtOH przez 30 s, a następnie 20% (v/v) NaOCl (Domestos) przez 20 min, po czym płukano sterylną wodą destylowaną. Wysterylizowane powierzchniowo nasiona kiełkowano na zmodyfikowanej poŝywce MURASHIGE i SKOOG [1962] z dodatkiem kwasu giberelinowego (GA 3 ) w stęŝeniu 1 mg dm -3 i zestalonej 0,7% (w/v) agarem. Eksplanty siewek: wierzchołki wzrostu z węzłem liścieniowym, fragmenty liścieni (długości 3-4 mm), hypokotyli (1 mm) i korzeni (3-4 mm) izolowano i wykładano na poŝywki MS uzupełnione 3% (w/v) sacharozą, 0,7% (w/v) agarem i róŝnymi cytokininami: 6-benzyloaminopuryną (BA) w stęŝeniach: 0,5; 1,0 i 3,0 mg dm -3, zeatyną (Zea) w stęŝeniu 1,0 i 3,0 mg dm -3 i kinetyną (Kn) w stęŝeniu 1,0 i 3,0 mg dm -3 w kombinacji z kwasem naftalenooctowym (NAA) w stęŝeniu 0,1 mg dm -3 lub 0,05 mg dm -3 (dla BA w stęŝeniu 0,5 mg dm -3 ), ph poŝywki doprowadzono do 5,7 przed autoklawowaniem. Kulturę prowadzono w temperaturze 26 ±1 C na ciągłym świetle o natęŝeniu 40 µm m-2 s -1. Po 4 tygodniach hodowli dokonano oceny zdolności morfogenetycznej eksplantów. Analizowano następujące parametry: procent eksplantów zdolnych do organogenezy pędów/korzeni, liczbę pędów/korzeni na eksplant oraz długość pędów. Uzyskane pędy rozdzielano i pasaŝowano na świeŝe poŝywki co 4 tygodnie. Uzyskane w kolejnych pasaŝach pędy ukorzeniano na po- Ŝywkach bez dodatku auksyn z pełną (MS) lub ze zmniejszoną do połowy ilością soli mineralnych ( MS), po 4 tygodniach przenoszono regeneranty do warunków ex vitro. Ukorzenione rośliny posadzono w doniczkach wypełnionych sterylną mieszaniną wermikulitu i piasku (1:1, v/v) i aklimatyzowano przez 2 tygodnie, a następnie przesadzono do ziemi z poletka doświadczalnego (odczyn obojętny) lub ziemi z domieszką kwaśnego torfu w proporcji 2:1 (v/v), poniewaŝ gatunek preferuje podłoŝe o odczynie kwaśnym. Uprawę prowadzono w szklarni przez 4 tygodnie, po tym czasie rośliny przeniesiono do gruntu. Po sześciu tygodniach od przeniesienia regenerantów do warunków ex vitro oraz po pierwszym roku wzrostu w gruncie zanalizowano wskaźnik przeŝywalności. Doświadczenia przeprowadzono trzykrotnie, 30 eksplantów/pędów stanowiło kaŝdy wariant doświadczenia. Uzyskane wyniki zanalizowano przy uŝyciu metody ANOVA dla P < 0,05. Wyniki i dyskusja Organogenezę pędów i korzeni obserwowano wyłącznie na wierzchołkach pędu na wszystkich zastosowanych poŝywkach regeneracyjnych. Pozostałe typy eksplantów nie dawały odpowiedzi morfogenetycznej na Ŝadnym z podłoŝy, obserwowano jedynie nieznaczną indukcję kalusa. U wielu gatunków roślin wierzchołki pędów stanowią najlepszy materiał do regeneracji zarówno u Asteraceae np. Eclipta alba [DHAKA, KOTHARI 2005], Echinacea purpurea [ZHAO i in. 2006], jak i gatunków naleŝących do innych rodzin: Myrtus communis [SCARPA i in. 2000], czy Saccharum sp. hybrids [GARCIA i in. 2007]. Ponadto w badaniach nad Arnica chamissonis wierzchołki pędu stanowiły materiał donorowy do uzyskania roślin w warunkach in vitro poprzez pobudzenie do rozwoju pąków bocznych na podłoŝach z dodatkiem GA 3 [CASSELLS i in. 1999]. Największą frekwencję organogenezy pędów (83%) obserwowano na poŝywkach z BA w stęŝeniu 3 mg dm -3 oraz NAA w stęŝeniu 0,1 mg dm -3 i uzyskiwano średnio 2,5 pędu

WPŁYW CYTOKININ NA MIKROPROPAGACJĘ Arnica montana L. 291 na eksplant (tab. 1). W wielu badaniach nad mikronamnaŝaniem wykazano, Ŝe zastosowanie BA w poŝywkach regeneracyjnych daje najlepszą odpowiedź morfogenetyczną. W przypadku Anthemis nobilis [ECHEVERRIGARAY i in. 2000], Echinacea purpurea [KORACH i in. 2002], Eclipa alba [BASKARAN, JAYABALAN 2005] czy Carlina acaulis [TREJGELL i in. 2009] na podłoŝu z dodatkiem BA uzyskano najwyŝszą frekwencję organogenezy i wskaźnik namnaŝania. Natomiast BUTIUC-KEUL i DELIU [2001] donoszą, Ŝe zeatyna i 2iP w stęŝeniu 1 mg dm -3 były najefektywniejszymi cytokininami podczas mikropropagacji pędów A. montana z węzłów izolowanych z 4-tygodniowych roślin. W naszych badaniach nie potwierdziliśmy stymulującego efektu działania zeatyny (tab. 1). Cytokinina Cytokinin Wpływ stęŝenia i rodzaju cytokininy na organogenezę pędów i korzeni A. montana The effect of concentration and type of cytokinin on the shoot and root organogenesis from the explants of A. montana StęŜenie Concentration (mg dm -3 ) % eksplantów; % of explants Organogeneza pędów Shoot organogenesis liczba/eksplant*; number/explant* długość (mm)* length (mm)* Tabela 1; Table 1 Organogeneza korzeni Root organogenesis % eksplantów % of explants liczba/eksplant* number/explant* BA 0,5 76 1,5 ± 0,3 ab 19,1 ± 1,0 bc 17 0,3 ± 0,1 b 1 52 1,4 ± 0,4 ab 17,4 ± 1,7 c 15 0,2 ± 0,1 b 3 83 2,5 ± 0,4 a 12,4 ± 0,8 d 0 0 b Zea 1 54 1,1 ± 0,2 b 26,1 ± 1,7 a 72 2,4 ± 0,4 a 3 80 1,9 ± 0,5 ab 17,8 ± 1,8 c 60 0,6 ± 0,2 ab Kn 1 57 1,2 ± 0,3 ab 21,2 ± 1,3 ab 64 1,8 ± 0,3 a 3 67 1,4 ± 0,3 ab 24,8 ± 1,7 a 24 0,3 ± 0,1 b * wartość średnia, ± błąd standardowy, róŝne litery oznaczają róŝnice statystycznie istotne przy P<0,05; means, ± standard error, means with the different letters indicate significant differences at P<0.05 Obecność BA w podłoŝu regeneracyjnym znacząco hamowała wzrost elongacyjny pędu, rozwój blaszki liściowej oraz proces ryzogenezy w porównaniu do zeatyny i kinetyny (tab. 1, fot. 1A i B). Hamowanie tych procesów było wprost proporcjonalne do stęŝenia BA w podłoŝu i róŝnice utrzymywały się w kolejnych pasaŝach. ObniŜenie stęŝenia BA (0,5 mg dm -3 ), zachowując stosunek cytokinin do auksyn 10:1, ograniczyło hamujący wpływ BA na wzrost pędów (tab. 1). Podobne zjawisko obserwowano takŝe podczas mikropropagacji u innych gatunków zarówno naleŝących do rodziny Asteraceae, np. Saussurea obvallata [JOSHI, DHAR 2003], jak i innych Ricinus communis [SUJATHA, REDDY 1998] czy Rotula aquatica [MARTIN 2003]. POONAWALA i in. [1999] sugeruje, Ŝe ta cytokinina moŝe być inhibitorem ryzogenezy. Tabela 2; Table 2 Wpływ zawartości soli mineralnych w poŝywce na ukorzenianie pędów A. montana

292 A. Trejgell, M. Michalska, A. Tretyn po 4 tygodniach kultury The effect of mineral salt content in the medium on the rooting of A. montana shoots after 4 weeks of culture Rodzaj podłoŝa Type of medium % ukorzenionych pędów % rooted shoots Liczba korzeni/pęd* Number of roots/shoot* Długość korzenia (mm)* Length of root (mm)* MS 47,3 3,1 ±0,4 a 37,4 ±5,0 b MS 63,3 3,8 ±0,7 a 53,2 ±3,8 a * wartość średnia, ± błąd standardowy, róŝne litery oznaczają róŝnice statystycznie istotne przy P<0,05; means, ± standard error, means with the different letters indicate significant differences at P<0.05 Fot. 1. Photo 1. Mikropropagacja Arnica montana, proliferacja pędów na poŝywce z 1 mg dm -3 BA (A) i 1 mg dm -3 Zea (B) po 4 tygodniach hodowli, mikropędy ukorzenione in vitro na poŝywce MS (C), (odcinek = 10 mm) Micropropagation of Arnica montana, shoot proliferation on the medium supplemented with 1 mg dm -3 BA (A) and 1 mg dm -3 Zea (B) after 4 week of culture, microshoots rooted in vitro on MS medium (C), (bar = 10 mm) Nieukorzenione pędy uzyskane w kolejnych pasaŝach rozdzielano i przenoszono na poŝywkę ukorzeniającą bez dodatku auksyny, zawierającą standardową (MS) lub zmniejszoną do połowy ilość soli mineralnych ( MS). Zastosowanie poŝywki MS stymulowało proces ukorzeniania pędów w porównaniu do podłoŝa z pełną ilością soli mineralnych. Zaobserwowano zarówno większy odsetek ukorzenionych pędów (ponad 63%), jak i nieznacznie większą liczbę korzeni indukowanych na jednym pędzie, która jednak nie przekraczała średnio 4 korzeni na pęd (tab. 2). Ponadto ograniczenie soli mineralnych w poŝywce istotnie stymulowało wzrost elongacyjny korzenia (tab. 2, fot. 1C). Redukcja ilości soli mineralnych w poŝywce silnie stymulowała powstawanie korzeni i ich wzrost elongacyjny takŝe u wielu innych gatunków: Saussurea obvallata

WPŁYW CYTOKININ NA MIKROPROPAGACJĘ Arnica montana L. 293 [JOSHI, DHAR 2003], Bauhinia vahlii [BHATT, DHAR 2000], Tylophora indica [FAISAL i in. 2005], Mucuna pruriens [FAISAL i in. 2006] oraz Teucrium stocksianum [BOUHOUCHE, KSIKSI 2007]. Ostatnim poddanym analizie etapem mikronamnaŝania była aklimatyzacja A. montana do warunków uprawy gruntowej. Aklimatyzacja jest bardzo waŝnym etapem mikrorozmnaŝania w warunkach in vitro, bowiem regeneranty uzyskane w kulturach in vitro rozwijają się w specyficznym mikroklimacie : duŝa wilgotność, mniejsze natęŝenia światła i sterylne podłoŝe wzbogacone w cukry. Te czynniki indukują rozwój fenotypu, który uniemoŝliwia lub znacząco ogranicza roślinom przeŝycie w warunkach ex vitro, gdy są bezpośrednio przeniesione do szklarni lub do uprawy w gruncie [HAZARIKA 2003]. Uzyskane regeneranty A. montana poddano procesowi aklimatyzacji, który początkowo przebiegał w doniczkach wypełnionych sterylnym podłoŝem (mieszanka wermikulitu z piaskiem w proporcji 1:1), przykrywanych przezroczystymi osłonami. Po 2-tygodniowym okresie aklimatyzacji rośliny przeniesiono do doniczek z ziemią ogrodniczą o odczynie obojętnym lub z domieszką kwaśnego torfu. Wskaźnik przeŝywalności po 6 tygodniach hodowli w warunkach ex vitro wynosił odpowiednio 45% i 63,6%. Rośliny uprawiane na podłoŝu o odczynie obojętnym rozwijały się wolniej, obserwowano chlorozę liści, a wskaźnik przeŝywalności po roku od aklimatyzacji wynosił 5,6%. Rośliny rosnące na podłoŝu wzbogaconym w torf rozwijały się prawidłowo, a wskaźnik przeŝywalności wynosił 58,3%. W warunkach naturalnych A. montana występuje na kwaśnych lub bardzo kwaśnych podłoŝach, takich jak: wrzosowiska, kwaśne gleby brunatne, gleby bielicowe, brzegi lasów oraz śródleśne polany [PIĘKOŚ-MIRKOWA, MIREK 2003], dlatego teŝ dodatek kwaśnego torfu okazał się niezbędnym składnikiem podłoŝa juŝ na wczesnym etapie aklimatyzacji. Wnioski 1. Wierzchołki wzrostu 10-dniowych siewek A. montana są dobrym materiałem inicjalnym do namnaŝania pędów. 2. Benzyloaminopuryna stymuluje proliferację pędów A. montana, ale hamuje ich wzrost elongacyjny i ukorzenianie. 3. ObniŜenie zawartości soli mineralnych w poŝywce MS stymuluje ukorzenianie pędów A. montana, uzyskanych w warunkach in vitro. 4. Dodatek kwaśnego torfu do podłoŝa lub jego zakwaszenie jest niezbędnym zabiegiem podczas aklimatyzacji i uprawy w gruncie regenerantów A. montana. Literatura ANTKOWIAK L. 1998. Rośliny lecznicze. Wydawnictwo AR im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu, Poznań: 126-127. BASKARAN P., JAYABALAN N. 2005. An efficient micropropagation system for Eclipta alba - a valuable medicinal herb. In Vitro Cell Dev. Biol. - Plant 41: 532 539. BHATT I.D., DHAR U. 2000. Combined effect of cytokinins on multiple shoot production from cotyledonary node explants of Bauhinia vahlii. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 62: 79 83. BOUHOUCHE N., KSIKSI T. 2007. An efficient in vitro plant regeneration system for the medicinal plant Teucrium stocksinum Boiss. Plant Biotechnol. Rep. 1: 179 184.

294 A. Trejgell, M. Michalska, A. Tretyn BUTIUC-KEUL A.L., DELIU C. 2001. Clonal propagation of Arnica montana L., a medical plant. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 37: 581 585. CASSELLS A.C., WALSH C., BELIN M., CAMBORNAC M., ROBIN J.R., LUBRANO C. 1999. Establishment of plantation from micropropagated Arnica chamissonis a pharmaceutical substitute for the endagered A. montana. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 56: 139 144. DHAKA N., KOTHARI S.L. 2005. Micropropagation of Eclipta alba (L.) Hassk an important medicinal plant. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 41: 658 661. ECHEVERRIGARAY S., FRACARO F., ANDRADE L.B., BIASIO S., ATTI-SERAFINI L. 2000. In vitro shoot regeneration from leaf explants of Roman Chamomile. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 60: 1 4. FAISAL M., SIDDIQUE I., ANIS M. 2006. An efficient plant regeneration system for Mucuna pruriens L. (DC.) using cotyledonary node explants. In Vitro Cell Dev. Biol. - Plant. 42: 59 64. FAISAL M., SINGH S., ANIS M. 2005. In vitro regeneration and plant establishment of Tylophora indica (Burm. F.) Merrill: petiole callus culture. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 41: 511 515. GARCIA R., CIDADE D., CASTELLAR A., LIPS A., MARIOLI C., CALLADO C., MENSUR E. 2007. In vitro morphogenesis patterns from shoot apices of sugar cane are determined by light and type of growth regulator. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 90: 181 190. HAZARIKA B.N. 2003. Acclimatization of tissue-cultured plants. Curr. Sci. 85: 1704 1712. JOSHI M., DHAR U. 2003. In vitro propagation of Saussurea obvallata (DC.) Edgew. an endangered ethnoreligious medicinal herb of Himalaya. Plant Cell Rep. 21: 933 939. KOO H., GOMES B.P.F.A., ROSALEN P.L., AMBROSANO G.M.B., PARK Y.K., CURY J.A. 2000. In vitro antimicrobial activity of propolis and Arnica montana against oral pathogenes. Arch. Oral Biol. 45: 141-148. KORACH A., JULIANI H.R., KAPTEYN J., SIMON J.E. 2002. In vitro regeneration of Echinacea purpurea from leaf explants. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 69: 79-83. LUIJTEN S.H., OOSTERMEIJER J.G.B., VAN LEEUWEN N.C., DEN NIJS H.C.M. 1996. Reproductive success and clonal genetic structure of the rare Arnica montana (Compositae) in Netherlands. Plant System Evol. 201: 15-30. MARTIN K.P. 2003. Rapid in vitro multiplication and ex vitro rooting of Rotula aquatica Lour., a rare rhoeophytic woody medicinal plant. Plant Cell Rep. 21: 415-420. MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473 497. PIĘKOŚ-MIRKOWA H., MIREK Z. 2003. Atlas roślin chronionych. Multiko Oficyna Wydawnicza, Warszawa: 58 59. POLAKOWSKI B. 1995. Rośliny chronione. Atlas. PWN, Warszawa: 51-164. POONAWALA I.S., JANA M.M., NADGAUDA R.S. 1999. Factors influencing bud break and rooting and mass-scale micropropagation of three Phragmites species: P. karka, P. communis and P. australis. Plant Cell Rep. 18: 696 700. SCARPA G.M., MILIA M., SATTA M. 2000. The influence of growth regulators on proliferation and rooting of in vitro propagated myrtle. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 62: 175 179. SUJATHA M., REDDY T.P. 1998. Different cytokinin effects on the stimulation of in vitro shoot proliferation from meristematic explants of castor (Ricinus communis L.). Plant Cell Rep. 17: 561 566. TREJGELL A., DĄBROWSKA G., TRETYN A. 2009. In vitro regeneration of Carlina acaulis

WPŁYW CYTOKININ NA MIKROPROPAGACJĘ Arnica montana L. 295 subsp. simplex from seedling explants. Acta Physiol. Plant. 31: 445-453. WEREMCZUK-JEśYNA I., KISIEL W., WYSOKIŃSKA H. 2006. Tymol derivatives from hairy roots of Arnica montana. Plant Cell Rep. 25: 993 996. ZHAO F.C., NILANTHI D., YANG Y.S., WU H. 2006. Anther culture and haploid plant regeneration in purple coneflower (Echinacea purpurea L.). Plant Cell Tiss. Organ Cult. 86: 55 62. Słowa kluczowe: Arnica, cytokininy, mikrorozmnaŝanie, wierzchołki pędów Streszczenie Opracowano efektywy system regeneracji dla Arnica montana. Materiałem donorowym były 10-dniowe siewki. Wysterylizowane powierzchniowo nasiona kiełkowano na poŝywce MS wzbogaconej GA 3 (1 mg dm -3 ). Eksplanty siewek (wierzchołki wzrostu pędów, fragmenty liścieni, hypokotyli i korzeni) izolowano i wykładano na poŝywki regeneracyjne uzupełnione róŝnymi cytokininami: BA (w stęŝeniach: 0,5; 1,0 i 3,0 mg dm -3 ), zeatyną (1,0 i 3,0 mg dm -3 ) i kinetyną (1,0 i 3,0 mg dm -3 ) w kombinacji z NAA w stęŝeniu 0,1 mg dm -3 lub 0,05 mg dm -3 (dla BA w stęŝeniu 0,5 mg dm -3 ). Odpowiedź morfogenetyczną wykazywały jedynie wierzchołki wzrostu pędów. Największą frekwencję organogenezy pędów (83%) obserwowano na eksplantach traktowanych BA w stęŝeniu 3 mg dm -3 i uzyskiwano średnio 2,5 pędu na eksplant. Obecność BA w poŝywkach regeneracyjnych hamowała wzrost elongacyjny pędu, rozwój blaszki liściowej oraz proces ryzogenezy. Pędy były ukorzeniane na poŝywkach MS i MS bez dodatku auksyn, zmniejszenie ilości soli mineralnych stymulowało proces ryzogenezy. Regeneranty po aklimatyzacji były przenoszone do gruntu, dodanie do ziemi kwaśnego torfu w proporcji 2:1 zwiększyło 10-krotnie wskaźnik przeŝywalności. EFFECT OF CYTOKININS ON THE MIKROPROPAGATION OF Arnica montana L. Alina Trejgell, Magdalena Michalska, Andrzej Tretyn Department of Biotechnology, Institute of General and Molecular Biology, Nicolaus Copernicus University, Toruń Key words: Arnica, cytokinins, mikropropagation, shoot tips Summary The aim of the study was to obtain an efficient method of Arnica montana regeneration. The donor material comprised 10-day-old seedlings. Surface sterilized seeds were germinated on MS medium supplemented with GA 3 (1 mg dm -3 ). Seedling explants (shoot tips, fragments of cotyledons, hypocotyls and roots) were excised and transferred on the proliferation medium supplemented with different concentrations of cytokinins: BA (0.5; 1.0 and 3.0 mg dm -3 ), zeatin (1.0 and 3.0 mg dm -3 ) and kinetin (1.0 and 3.0 mg dm -3 ) in combination with NAA (0.1 mg dm -3 ) or 0.05 mg dm -3 (for BA at

296 A. Trejgell, M. Michalska, A. Tretyn the concentration 0.5 mg dm -3 ). It was observed that only shoot tips exhibited morphogenetical responses. The highest frequency of shoot organogenesis (83%) was observed in the explants cultured on the medium supplemented with 3.0 mg dm -3 BA. On the average 2.5 shoots from one explants were obtained under these conditions. The presence of BA in the proliferation medium inhibited the elongation growth, development of leaf lamina and rhizogenesis. The individual shoots were rooted on MS and MS medium without auxin. Decreasing the amount of mineral salts in the rooting medium stimulated rhizogenesis process. Plantlets after acclimatization were transferred to the soil. Addition of the acid peat into the soil, in the ratio of 2:1, increased the survival rate by 10-times. Dr Alina Trejgell Zakład Biotechnologii Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej Uniwersytet Mikołaja Kopernika ul. Gagarina 9 87-100 TORUŃ e-mail: trejgell@biol.uni.torun.pl