PAWEŁ SACHA, PIOTR JAKONIUK, PIOTR WIECZOREK, MARCIN ŻÓRAWSKI

Nowiny Lekarskie 2007, 76, 4, 314-321 PAWEŁ SACHA, PIOTR JAKONIUK, PIOTR WIECZOREK, MARCIN ŻÓRAWSKI MECHANIZMY OPORNOŚCI NA ANTYBIOTYKI β-laktamowe IZOLATÓW ESCHERICHIA COLI, KLEBSIELLA PNEUMONIAE, PROTEUS MIRABILIS I ENTEROBACTER CLOACAE OPORNYCH NA CEFOTAKSYM MECHANISMS OF RESISTANCE TO β-lactam ANTIBIOTICS IN ESCHERICHIA COLI, KLEBSIELLA PNEUMONIAE, PROTEUS MIRABILIS AND ENTEROBACTER CLOACAE ISOLATES RESISTANT TO CEFOTAXIME Zakład Diagnostyki Mikrobiologicznej Akademia Medyczna w Białymstoku Kierownik Zakładu: dr hab. med. Piotr Jakoniuk Streszczenie Wstęp. Wyniki badań naukowych na świecie wskazują na narastanie oporności na antybiotyki wśród pałeczek Enterobacteriaceae. Cel. Ocena występowania mechanizmów oporności na antybiotyki β-laktamowe oraz wrażliwości na antybiotyki wśród szczepów P. mirabilis, E. coli, K. pneumoniae i E. cloacae opornych na cefotaksym. Materiały i metoda. Przebadano 303 szczepy pałeczek Enterobacteriaceae izolowane z różnych materiałów klinicznych. Do badania wrażliwości na antybiotyki stosowano metodę dyfuzyjno-krążkową. Do oceny występujących mechanizmów oporności na antybiotyki β-laktamowe stosowano metodę PCR i MDDT. Wyniki. Wytwarzanie ESBL było najważniejszym mechanizmem warunkującym oporność na antybiotyki β-laktamowe. Zdolność wytwarzania ESBL wykryto u 33,7% izolatów Enterobacteriaceae, głównie u E. cloacae (16,8%) i K. pneumoniae (11,9%). Mechanizm AmpC wykazano u 9,9%, a inne mechanizmy oporności u 7,9% badanych izolatów Enterobacteriaceae. Częstość występowania mechanizmów oporności w grupie szczepów opornych na cefotaksym wynosiła: ESBL 60%, ESBL i AmpC 15,5%, AmpC 6,7% i 17,8% inne. Wnioski. Najważniejszym mechanizmem oporności na antybiotyki β-laktamowe badanych pałeczek Enterobacteriaceae było wytwarzanie ESBL i/lub AmpC enzymów. Nie wykazano obecności enzymów CTX-M wśród szczepów opornych na cefotaksym. SŁOWA KLUCZOWE: mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe, Enterobacteriaceae, wrażliwość na antybiotyki. Summary Introduction. Worldwide scientific data show that there is an increasing level of resistance to antibiotics among Enterobacteriaceae rods. Aim. The aim of this study was to evaluate susceptibility to antibiotics and detection of mechanisms of resistance to β-lactam antibiotics among P. mirabilis, E. coli, K. pneumoniae, and E. cloacae strains resistant to cefotaxime. Material and methods. We studied 303 strains of Enterobacteriaceae rods isolated from different clinical samples. Disk diffusion method was used to study susceptibility to antibiotics. MDDT and PCR methods were used to detect mechanisms of bacterial resistance to β-lactam antibiotics. Results. The major mechanism of resistance to β-lactam antibiotics was production of ESBL. ESBL were detected in 33.7% of Enterobacteriaceae isolates, especially in E.cloacae (16.8%) and K.pneumoniae (11.9%). AmpC mechanism was detected in 9.9% isolates and other mechanisms in 7.9% isolates of Enterobacteriaceae. Occurrence of mechanisms resistance in cefotaxime-resistant group (R-CTX) respectively: ESBL 60%, ESBL and AmpC 15.5%, AmpC 6.7% and other 17.8%. Conclusion. The most important mechanisms of resistance to β-lactam antibiotics in Enterobacteriaceae were production ESBL and/or AmpC enzymes. Strains producing CTX-M enzymes among of cefotaxime-resistant strains were not found. KEY WORDS: mechanisms resistance to β-lactam antibiotics, Enterobacteriaceae, susceptibility to antibiotics. Wstęp cefotaksym, czy ceftazydym często prowadzi do selekcji Wśród wielu antybiotyków stosowanych w leczeniu szczepów opornych na większość antybiotyków β-lakzakażeń wywołanych przez pałeczki Enterobacteriaceae tamowych (oprócz karbapenemów). Najliczniejszą nadal najważniejszą grupę stanowią antybiotyki β-lak- grupę z nabytą opornością na cefalosporyny stanowią tamowe. Szczególnie chętnie w praktyce klinicznej gramm-ujemne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae. korzysta się z cefalosporyn ze względu na ich znakomite Kolonizacja środowiska szpitalnego takimi szczepami właściwości farmakokinetyczne, szerokie spektrum działania może stanowić istotny czynnik ryzyka, wpływający na przeciwbakteryjnego i niewielką toksyczność. Wszystkie te zwiększenie liczby zakażeń szpitalnych stwarzających cechy preferują stosowanie tych leków zarówno u dzieci, jak poważne trudności terapeutyczne [3, 4]. i osób dorosłych do zwalczania zakażeń o różnej lokalizacji Należy pamiętać, że antybiotyki cefalosporynowe [1, 2]. stanowią jeden z czynników mutagennych prowadzący Nadużywanie cefalosporyn III generacji, takich jak do wytwarzania oporności przez bakterie na antybiotyki

Mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe izolatów Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae... 315 β-laktamowe. Wśród wielu mechanizmów odpowiedzialnych za tego typu oporność u pałeczek Enterobacteriaceae, na pierwszym miejscu wymienia się β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL; ang. extended-spectrum β-lactamases) [3]. Geny kodujące ich wytwarzanie mogą być zlokalizowane na chromosomie lub plazmidach. Możliwość transferu plazmidów wśród różnych gatunków Enterobacteriaceae stwarza zagrożenia związane z pojawianiem się szczepów wieloopornych [3 5]. Dynamicznie rozprzestrzeniającą się wśród pałeczek Enterobacteriaceae grupą ESBL są cefotaksymazy (CTX- M) [6, 7]. Dotychczas opisano ponad 60 różnych CTX-M [8] występujących wśród wielu gatunków bakterii. Doniesienia o ich występowaniu napływają z odległych regionów świata: Azja [9], Ameryka Płd. i Płn. [10, 11], Afryka [12]. Również w Europie odnotowuje się istotny wzrost zainteresowania tą grupą ESBL [13 16]. W Polsce, pierwsze enzymy z tej grupy opisali w 1998 roku Gniadkowski i wsp. u Citrobacter freundii (CTX-M-1/MEN-1) i Escherichia coli (CTX-M-3) [17]. Kilka lat później (w 2002 roku), ten sam zespół badawczy opisał obecność CTX-M-3 u innych gatunków pałeczek Enterobacteriaceae (z rodzaju Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Morganella) izolowanych w 15 szpitalach z różnych regionów Polski [18]. Cel badań Ocena częstości występowania różnych mechanizmów warunkujących oporność E. coli, P. mirabilis, E. cloacae i K. pneumoniae na antybiotyki β-laktamowe. Porównanie aktywności różnych antybiotyków wobec szczepów opornych na cefotaksym. Określenie udziału cefotaksymaz (CTX-M) w oporności badanych gatunków pałeczek Enterobacteriaceae na cefalosporyny. Materiał i metody Badania dotyczące występowania mechanizmów oporności na antybiotyki β-laktamowe oraz ocenę wrażliwości na antybiotyki przeprowadzono na 303 pałeczkach Enterobacteriaceae należących do 4 gatunków: Escherichia coli (n = 72), Klebsiella pneumoniae (n = 75), Proteus mirabilis (n = 69) i Enterobacter cloacae (n = 87). Wszystkie szczepy wyizolowano z materiałów klinicznych (wymazy z ran, cewniki, dreny itd.) w Zakładzie Diagnostyki Mikrobiologicznej Akademii Medycznej w Białymstoku w pierwszych dwóch miesiącach kolejnych lat 2004, 2005 i 2006. Badane gatunki dobierano do badań w podobnych proporcjach ilościowych (20 29 szczepów/kolejny rok). Identyfikację do gatunku (po izolacji z materiału klinicznego) przeprowadzono z zastosowaniem karty GNI i automatycznego systemu VITEK 1 (biomérieux, Marcy l Etoile, France). Szczepy po izolacji (z 2004 i 2005 roku) były przechowywane na kriobankach w temperaturze 32 o C. Przed przystąpieniem do badań szczepy rewitalizowano poprzez 3-krotny pasaż na agarze Columbia (biomérieux, Marcy l Etoile, France) i poddawano ponownej identyfikacji przy użyciu ID 32E i systemu ATB (biomérieux, Marcy l Etoile, France). Badanie wrażliwości na antybiotyki wykonano metodą dyfuzyjno-krążkową na podłożu Muller-Hintona agar (Oxoid, Basingstoke, UK) postępując zgodnie z zaleceniami CLSI i Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów [19, 20]. Oceniano wrażliwość na następujące grupy leków: cefalosporyny (cefotaksym, ceftazydym, cefepim, cefazolina, cefuroksym), monobaktamy (aztreonam), karbapenemy (imipenem, meropenem), penicyliny i ich połączenia z inhibitorami (ampicylina, amoksycylina z kwasem klawulanowym, tikarcylina z kwasem klawulanowym, piperacylina z tazobaktamem, ampicylina z sulbaktamem), aminoglikozydy (gentamycyna, netilmycyna, amikacyna) oraz ciprofloksacynę, tetracyklinę i trimetoprim z sulfametoksazolem. W celu kontroli poprawności wykonywanych badań stosowano szczepy referencyjne Escherichia coli ATCC 25922 i Escherichia coli ATCC 35218. Mechanizm oporności na antybiotyki β-laktamowe określano na podstawie uzyskanych wyników w teście MDDT (ang. Modified Double Disk Test) stosując metodykę i kryteria opisane przez Pitout i wsp. [21]. Jako szczepy wzorcowe stosowano Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 (ESBL-dodatni) i Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (AmpC-dodatni). Szczepy, u których stwierdzono oporność na cefotaksym (R-CTX) i wykazano wytwarzanie β-laktamaz z grupy ESBL, badano techniką PCR na obecność genów warunkujących wytwarzanie CTX-M. Jako materiał wykorzystano genomowy DNA, izolowany z 24-godzinnej hodowli (37 o C) bakterii na bulionie TSB (Emmapol, Gdańsk, Polska). Izolację przeprowadzono posługując się zestawem GeneMatrix (EURx, Gdańsk, Polska), postępując zgodnie z procedurą opisaną przez producenta. Do reakcji PCR przygotowywano 25 µl mieszaniny, zawierającej: 25 pmol każdego ze starterów, 1x bufor reakcyjny, 2 mm MgCl 2, 1µl dntss, 0,5U Delta 2 DNA polimerazy (DNA-Gdańsk II, Gdańsk, Polska) i 2 µl genomowego DNA. Mieszaninę składników reakcji uzupełniano do końcowej objętości wodą dejonizowaną. Reakcję PCR przeprowadzono w termocyklerze Cyclone 96 (PEQLAB Biotechnology, GmbH) w następujących warunkach: 1) wstępna denaturacja w 94 o C, 6 minut; 2) denaturacja w 94 o C, 60 sekund; 3) przyłączanie starterów w 50 o C, 40 sekund; 4) wydłużanie nici DNA w 72 o C, 60 sekund; 5) końcowe wydłużanie w 72 o C, 6 minut; 6) schłodzenie do 4 o C. Etapy 2, 3, 4 powtarzano cyklicznie 35 razy. W badaniach zastosowano uniwersalne startery dla rodziny enzymów CTX-M o sekwencji opisanej przez

316 Paweł Sacha i inni Sundsfjord i wsp. [22]. Produkty reakcji PCR rozdzielano w czasie 60 minut (napięcie 5V/cm), w 1,6% żelu agarozowym (MP Biomedicals, France) i barwiono bromkiem etydyny (MP Biomedicals, France) w buforze TBE. Spodziewana wielkość produktów dla genu bla CTX-M wynosiła 585 par zasad (pz). Ich obecność oceniano w transiluminatorze UV (UVP Ltd., UK), a wielkość uzyskanych produktów po rozdziale elektroforetycznym porównywano z markerem MW 100-1000 (DNA-Gdańsk II, Gdańsk, Polska). Wyniki Przeprowadzone badania oceniające oporność pałeczek Enterobacteriaceae na różne antybiotyki przedstawiono w tabeli 1. Wykazały one występowanie oporności wobec antybiotyków β-laktamowych u ponad połowy szczepów K. pneumoniae (52 69,7%) i E. cloacae (65,5 72,4%). Pałeczki E. coli i P. mirabilis były bardziej wrażliwe. Obserwowano niższy odsetek szczepów opornych na cefalosporyny, od 4,2% (cefoperazon) do 43,5% (cefazolina). Najniższą aktywność wśród cefalosporyn III generacji wykazywał cefotaksym (8,3 69,7% szczepów opornych). Za wyjątkiem tikarcyliny z kwasem klawulanowym (TIM), pozostałe badane preparaty antybiotyków β-laktamowych z inhibitorami β-laktamaz (AMC, SAM i TZP), nie wykazywały zadowalającej aktywności przeciwbakteryjnej. Jedynymi antybiotykami β-laktamowymi, wobec których nie występowała oporność wśród badanych pałeczek Enterobacteriaceae były karbapenemy (imipenem, meropenem) i cefepim. W grupie antybiotyków aminoglikozydowych najaktywniejszym preparatem była amikacyna (E. coli 4,2% i P. mirabilis 4,3% szczepów opornych). Oporność na pozostałe (gentamycynę i netylmycynę) wahała się w zakresie od 8,3% do 68% szczepów i zależała od gatunku. Zaobserwowano duże zróżnicowanie oporności na tetracyklinę. Najmniej szczepów opornych wykazano u pałeczek K. pneumoniae (8%), natomiast inne gatunki, tj. E. coli, P. mirabilis i E. cloacae były w większości oporne. Co do pozostałych badanych preparatów (ciprofloksacyny i trimetoprimu z sulfametoksazolem), to najmniej opornych szczepów wykazano u E. coli (16,7% i 25%), a najwięcej (58,6% i 55,2%) u E. cloacae. Na podstawie wyników powyższych badań, stosując jako kryterium wrażliwość na cefotaksym, wyłoniono 2 grupy szczepów: R-CTX (oporne na cefotaksym) i S- CTX (wrażliwe na cefotaksym). Grupę pierwszą (R-CTX) stanowiło 135/303 szczepów (44,6%), a grupę drugą (S-CTX) 168/303 szczepów (55,4%). Wyniki analizy wrażliwości na antybiotyki w obu grupach pałeczek Enterobacteriaceae zestawiono w tabeli 2. Dane te wskazują na znacznie wyższą oporność pałeczek z grupy R-CTX wobec stosowanych w badaniach antybiotyków, a szczególnie aminoglikozydów (wyjątek szczepy E. coli), cefalosporyn (wyjątek wysoka aktywność ceftazydymu wobec K. pneumoniae) i połączeń penicylin z inhibitorami β-laktamaz. Wyniki badań nad mechanizmami warunkującymi oporność na antybiotyki β-laktamowe przedstawiono w tabeli 3. Badaniami objęto szczepy oporne na cefotaksym (R-CTX). Z zastosowaniem testu MDDT stwierdzono występowanie 2 mechanizmów oporności na β-laktamy, takich jak wytwarzanie enzymów z grupy ESBL i/lub AmpC. Zdolność tę wykazano u 75,6% (102/135) R- CTX szczepów. Najliczniejszą grupę stanowiły pałeczki wytwarzające tylko ESBL 81/135 (60%). Większość szczepów ESBL-dodatnich należała do gatunku E. cloacae (36/81 44,4%) i K. pneumoniae (30/81 37%). Jednoczesne występowanie zdolności wytwarzania ESBL i AmpC zidentyfikowano u 15 szczepów E. cloacae i 6 szczepów K. pneumoniae. Z kolei zdolność wytwarzania tylko AmpC wykazano u 9 szczepów z gatunku E. cloacae. U 17,8% pałeczek Enterobacteriaceae występowały mechanizmy oporności o innym charakterze aniżeli ESBL czy AmpC. Badania wykonane techniką PCR na 102 szczepach Enterobacteriaceae (81 szczepów wytwarzających ESBL oraz 21 szczepów, które oprócz zdolności wytwarzania ESBL wytwarzały także AmpC), nie wykazały obecności genów bla (cefotaksymaz) w żadnym z testowanych szczepów. CTX-M Dyskusja Występowanie w środowisku szpitalnym szczepów pałeczek Enterobacteriaceae opornych na antybiotyki β-laktamowe staje się dość powszechnym zjawiskiem. Znaczną rolę w ekspansji oporności wśród różnych gatunków odgrywają antybiotyki należące do cefalosporyn III-generacji. Nadużywanie takich preparatów jak cefotaksym prowokuje bakterie do wytwarzania mechanizmów obronnych. Do najczęściej opisywanych zalicza się obecnie zdolność wytwarzania ESBL [3 5]. Przeprowadzone przez nas badania na puli 303 szczepów Enterobacteriaceae izolowanych z różnych materiałów klinicznych w latach 2004 2006 wykazały występowanie dużej grupy szczepów opornych na cefotaksym (135/303 44,6%). Większość wywodziła się z gatunku K. pneumoniae i E. cloacae ( 69% szczepów). Oporność na inne cefalosporyny u tych gatunków występowała na zbliżonym poziomie (od 64% do 72,4%). Ciekawym faktem był brak występowania szczepów K. pneumoniae opornych na ceftazydym w grupie R- CTX (jedynie 6,3% szczepów średnio wrażliwych). Tego typu szczepy (ESBL-dodatnie) wrażliwe in vitro na ceftazydym (MIC; 2 mg/l) opisywane są również w literaturze [13]. Aktywność poszczególnych antybiotyków w grupie

Mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe izolatów Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae... 317 Tab. 1. Oporność na antybiotyki pałeczek Enterobacteriaceae (N = 303) Table 1. Resistance to antibiotics of Enterobacteriaceae rods (N = 303) Gatunek (liczba szczepów) Szczepy oporne (%) CTX CAZ CFP FEP CZ CXM ATM IPM MEM AM AMC TIM TZP SAM GM NET AN CIP TE SXT Escherichia coli (72) 8,3 8,3 4,2-33,3 25,0 - - - 83,3 58,3-8,3 58,3 16,7 8,3 4,2 16,7 75,0 25,0 Klebsiella pneumoniae (75) 69,7-52,0-64,0 64,0 36,0 - - NB 64,0-52,0 68,0 64,0 64,0 64,0 28,0 8,0 64,0 Proteus mirabilis (69) 26,1 21,7 17,4-43,5 34,8 - - - 52,2 30,4 26,1 17,4 39,1 30,4 26,1 4,3 21,7 91,3 60,9 Enterobacter cloacae (87) 69,0 65,5 69,0 - NB 72,4 69,0 - - NB NB 69,0 69,0 NB 51,7 34,5 48,3 58,6 62,1 55,2 Objaśnienia: NB, nie badano (naturalna oporność) CTX, cefotaksym; CAZ, ceftazydym; CFP, cefoperazon, FEP, cefepim; CZ, cefazolina; CXM, cefuroksym; ATM, aztreonam; IPM, imipenem; MEM, meropenem; AM, ampicylina; AMC, amoksycylina z kwasem klawulanowym; TIM, tikarcylina z kwasem klawulanowym; TZP, piperacylina z tazobaktamem; SAM, ampicylina z sulbaktamem; GM, gentamycyna; NET, netylmycyna; AN, amikacyna; CIP, ciprofloksacyna; TE, tetracyklina; SXT, trimetoprim z sulfametoksazolem

318 Paweł Sacha i inni Tab. 2. Porównanie aktywności antybiotyków wobec pałeczek Enterobacteriaceae wrażliwych (S-CTX) i opornych (R-CTX) na cefotaksym Table 2. Comparison of antibiotics activity between groups Enterobacteriacea rods, susceptible (S-CTX) and resistant (R-CTX) to cefotaxime Gatunek (liczba szczepów) Oporność na cefotaksym Odsetek szczepów wrażliwych (%) CAZ CFP FEP CZ CXM ATM IPM MEM AM AMC TIM TZP SAM GM NET AN CIP TE SXT E. coli (6) (R-CTX) - - 100 - - - 100 100 - - - - - 100 100 100 100 - - K. pneumoniae (48) 93,7 6,2 100 - - - 100 100 NB 6,2-12,5 12,5 - - - 68,7 75,1 - P. mirabilis (18) 16,7-100 - - 100 100 100 - - 16,7 33,3 - - - 83,3 33,3 - - E. cloacae (63) - - 100 NB - - 100 100 NB NB - - NB 30,0 30,0 35,0 25,0 10,0 25,0 E. coli (66) (S-CTX) 100 81,8 100 45,4 81,8 80,9 100 100 18,2 45,5-54,5 54,5 81,8 80,9 80,9 63,3 27,3 63,6 K. pneumoniae (27) 100 100 100 100 100 100 100 100 NB 44,4 100 100 77,8 100 100 100 77,8 55,6 88,9 P. mirabilis (51) 100 100 100 64,7 88,2 100 100 100 64,7 94,1 88,2 94,1 82,4 94,1 100 100 94,1 17,6 52,9 E. cloacae (24) 100 77,8 100 NB 55,6 100 100 100 NB NB 88,9 88,9 NB 88,9 88,9 77,8 77,8-88,9 NB Objaśnienia: (R CTX), izolaty oporne na cefotaksym; (S CTX), izolaty wrażliwe na cefotaksym; NB, nie badano (naturalna oporność) CTX, cefotaksym; CAZ, ceftazydym; CFP, cefoperazon, FEP, cefepim; CZ, cefazolina; CXM, cefuroksym; ATM, aztreonam; IPM, imipenem; MEM, meropenem; AM, ampicylina; AMC, amoksycylina z kwasem klawulanowym; TIM, tikarcylina z kwasem klawulanowym; TZP, piperacylina z tazobaktamem; SAM, ampicylina z sulbaktamem; GM, gentamycyna; NET, netylmycyna; AN, amikacyna; CIP, ciprofloksacyna; TE, tetracyklina; SXT, trimetoprim z sulfametoksazolem

Mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe izolatów Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae... 319 Tab. 3. Mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe wśród szczepów Enterobacteriaceae (opornych na cefotaksym) Table 3. Resistance mechanisms to β-lactam antibiotics were among of Enterobacteriaceae strains (resistant to cefotaxime) Mechanizm oporności liczba szczepów (%) Gatunek Liczba szczepów (R CTX) ESBL Inne** CTX-M* Inne ESBL ESBL+AmpC AmpC Escherichia coli 6-3 (50,0%) - - 3 (50,0%) Klebsiella pneumoniae 48-30 (62,5%) 6 (12,5%) - 12 (25,0%) Proteus mirabilis 18-12 (66,7%) - - 6 (33,3%) Enterobacter cloacae 63-36 (57,1%) 15 (23,8%) 9 (14,3%) 3 (4,8%) Razem: 135-81 (60,0%) 21 (15,5%) 9 (6,7%) 24 (17,8%) Objaśnienia: (R-CTX), izolaty oporne na cefotaksym, ESBL β-laktamazy o szerokim spektrum substratowym; AmpC cefalosporynaza C; * CTX-M (cefotaksymazy) obecność genów warunkujących ich wytwarzanie badano z zastosowaniem techniki PCR; ** - (1) inne β-laktamazy, (2) mutacje receptorów wiążących antybiotyk, (3) spadek zdolności transportu leku do miejsca działania.

320 Paweł Sacha i inni cefalosporyn może być zróżnicowana. Zjawisko to zależy od rodzajów wytwarzanych β-laktamaz (ESBL). Gonlugur i wsp. [23] w swoich badaniach otrzymali wyniki świadczące o wyższej aktywności cefotaksymu (67,9% szczepów opornych) niż ceftazydymu (71,4% szczepów opornych) w grupie szczepów ESBL-dodatnich. W przypadku wykazania zdolności wytwarzania ESBL i tak należy traktować takie szczepy jako oporne na leczenie ceftazydymem (i pozostałymi antybiotykami β-laktamowymi). Wrażliwość na cefotaksym i ceftazydym pozostałych badanych gatunków (E. coli, P. mirabilis, E. cloacae) występowała na zbliżonym poziomie. Antybiotykami, które wykazywały pełną aktywność wobec wszystkich badanych gatunków (S-CTX i R- CTX) były: imipenem, meropenem i cefepim (100%). Zdecydowana większość szczepów opornych na cefotaksym, wykazywała jednocześnie oporność na antybiotyki aminoglikozydowe i połączenia penicylin z inhibitorami. Przeprowadzone przez nas badania wyłoniły liczną grupę szczepów (135/303) prezentujących jeden lub kilka mechanizmów oporności na antybiotyki β-laktamowe. Najczęściej (102/135 75,6%) była to zdolność wytwarzania ESBL. Cechę tą obserwowano wśród 58,6% pałeczek E. cloacae i 48% K. pneumoniae. Pozostałe gatunki wykazywały tę zdolność na znacznie niższym poziomie: P. mirabilis 17,4% i E. coli 8,3%. Z danych literaturowych wynika, że wytwarzanie ESBL przez poszczególne gatunki pałeczek Enterobacteriaceae uzależnione jest od wielu czynników. Luzzaro i wsp. [24] stwierdzili u pacjentów szpitalnych najwięcej szczepów ESBL-dodatnich wśród Providencia > Enterobacter > Klebsiella, natomiast u pacjentów leczonych ambulatoryjnie były to gatunki z rodzaju Proteus i Providencia. Z kolei wyniki badań przeprowadzonych przez Spanu i wsp. wraz z The Italian ESBL Study Group [25] na liczbie 8015 izolatów z rodziny Enterobacteriaceae wykazały najwyższy odsetek szczepów ESBL dodatnich wśród K. pneumoniae (37,1%) i P. mirabilis (25,7%). Rezultaty naszych badań, wskazujące na najczęstszą zdolność wytwarzania ESBL przez E. cloacae i K. pneumoniae, wynikają prawdopodobnie z lokalnej sytuacji epidemiologicznej i zastosowanej w badaniach bardziej wszechstronnej metody detekcji (MDDT) [21] aniżeli klasyczna (tj. DDST; ang. double disk synergy test) [5]. Metoda MDDT pozwala na jednoczesne potwierdzenie zdolności wytwarzania ESBL i/lub AmpC, co z kolei przyczynia się do bardziej dokładnego zdefiniowania tych dwóch mechanizmów oporności na antybiotyki β-laktamowe. Mechanizm oporności, związany z wytwarzaniem AmpC często maskuje obecność ESBL [3, 5]. W grupie 135 szczepów opornych na cefotaksym zdolność wytwarzania AmpC wykazaliśmy jedynie wśród gatunków E. cloacae (24 szczepy) i K. pneumoniae (6 szczepów). Często mechanizm ten występował razem ze zdolnością wytwarzania ESBL (21/30 szczepów). Badania związane z poszukiwaniem obecności cefotaksymaz pomimo zastosowania czułej techniki detekcji (PCR) i uniwersalnych starterów dla rodziny enzymów CTX-M nie dały pozytywnych rezultatów. Świadczy to o braku występowania tego typu enzymów w lokalnej populacji szczepów opornych na cefotaksym (i wytwarzających ESBL). W celu ustalenia udziału CTX- M w oporności na antybiotyki β-laktamowe, należałoby przeprowadzić badania na większej liczbie szczepów. Poprawna interpretacja wyników oceny wrażliwości na antybiotyki (antybiogram) powinna opierać się o informacje uzyskane z rutynowych badań uwzględniających występowanie różnych mechanizmów oporności wśród badanych szczepów bakteryjnych. Ma to kolosalne znaczenie w doborze przez lekarza antybiotyku skutecznego w leczeniu zakażeń szczepami wieloopornymi (np. wytwarzającymi ESBL i/lub AmpC) i eliminacji ich ze środowiska szpitalnego. Wnioski 1. Najczęstszym mechanizmem odpowiedzialnym za oporność na antybiotyki β-laktamowe wśród badanych pałeczek Enterobacteriaceae było wytwarzanie ESBL (33,7%) i/lub AmpC (9,9%). 2. Wśród szczepów ESBL dodatnich opornych na cefotaksym nie wykazano zdolności wytwarzania CTX- M (cefotaksymaz). 3. Najwyższą oporność (i różnorodność występujących mechanizmów oporności) na antybiotyki wykazano u Enterobacter cloacae i Klebsiella pneumoniae. 4. Imipenem i meropenem wykazywały pełną aktywność (100% szczepów wrażliwych) wobec wszystkich badanych szczepów. Piśmiennictwo 1. Christian S.S., Christian J.S.: The cephalosporins antibiotics. Prim. Care Update Ob/Gyns., 1997, 4(5), 168-174. 2. Nicholson K.G.: Cefalosporyny. W: Antybiotyki i chemioterapia. Lambert H.P., O Grady F.W. (red.). Wydawnictwo Medyczne, Warszawa 1994, 93-138. 3. Bradford P.A.: Extended-spectrum β-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important threat. Clin. Microbiol. Rev., 2001, 14(4), 933-951. 4. Suárez C.J., Lolans K., Villegas M.V., Quinn J.P.: Mechanisms of resistance to β-lactams in some gram-negative bacteria causing nosomical infections. Expert Rev. Anti. Infect. Ther., 2005, 3(6), 915-922. 5. Livermoore D.M.: β-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin. Microbiol. Rev., 1995, 8(4) 557-584. 6. Bonnet R.: Growing group of extended-spectrum β-lactamases: the CTX-M enzymes. Antimicrob. Agents Chemother., 2004, 48(1), 1-14. 7. Rasmussen J.W., Høiby N.: Cefotaximases (CTX-M-ases), an expanding family of extended-spectrum β-lactamases. Can. J.

Mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe izolatów Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae... 321 Microbiol., 2004, 50, 137-165. 8. CTX-M-type β-lactamases. http://www.lahey.org/studies/ other.asp#table1 9. Kim J., Lim Y.M., Jeong Y.S., Seol S.Y.: Occurrence of CTX- M-3, CTX-M-15, CTX-M-14 and CTX-M-9 extended-spectrum β-lactamases in Enterobacteriaceae clinical isolates in Korea. Antimicrob. Agents Chemother., 2005, 49(4), 1572-1575. 10. Villegas M.V., Correa A., Perez F., Zuluaga T., Radice M., Gutkind G., Casellas J.M., Ayala J., Lolans K., Quinn J.P. and the Colombian Nosomical Resistance Study Group.: CTX-12 β- lactamase in Klebsiella pneumoniae clinical isolate in Columbia. Antimicrob. Agents Chemother., 2004, 48(2) 629-631. 11. Jones R.N., Jenkins S.G., Hoban D.J., Pfaller M.A., Ramphal R.: In vitro efficacy of six cephalosporins tested against Enterobacteriaceae isolated at 38 North American medical centers participating in the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, 1997-1998. Int. J. Antimicrob. Agents.,2000, 15, 111-118. 12. Al-Agamy M.H.M, Seif El-Din Ashour M., Wiegand I.: First description of CTX-M β-lactamase-producing clinical Escherichia coli isolates from Egypt. Int. J. Antimicrob. Agents, 2006, 27, 545-548. 13. Pagani L., Dell Amico E., Migliavacca R., D Andrea M.M., Giacobone E., Amicosante G., Romero E., Rossolini G.M.: Multiple CTX-M-type extended-spectrum β-lactamases in nosomical isolates of Enterobacteriaceae from a hospital in Northern Italy. J. Clin. Microbiol.,2003, 41(9), 4264-4269. 14. Sabaté M., Miró E., Navarro F., Vergés C., Aliga R., Mirellis B., Prats G.: β-lactamases involved in resistance to broad-spectrum cephalosporins in Escherichia coli and Klebsiella spp. clinical isolates collected between 1994 and 1996, in Barcelona (Spain). J. Antimicrob. Agents Chemother., 2002, 49(6) 989-997. 15. Quentin C., Arpin C., Dubois V., André C., Lagrange I., Fischer I., Brochet J.P., Grobost F., Jullin J., Dutilh B., Larribet G., Noury P.: Antibiotic resistance rates and phenotypes among isolates of Enterobacteriaceae in French extra-hospital practice. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 2004, 23, 185-193. 16. Edelstein M., Pimkin M., Edelstein I., Stratchouski L.: Prevalence and molecular epidemiology of CTX-M extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Russian hospitals. Antimicrob. Agents Chemother., 2003, 47(12), 3724-3732. 17. Gniadkowski M., Scheider I., Pałucha A., Jungwirth R., Mikiewicz B., Bauernfeind A.: Cefotaxime-resistant Enterobacteriaceae isolates from a hospital in Warsaw, Poland: Identification of a new CTX-M-3 cefotaxime-hydrolizing β-lactamase that is closely related to the CTX-M-1/MEN-1 enzyme. Antimicrob. Agents Chemother., 1998, 42(4) 827-832. 18. Baraniak A., Fiett J., Sulikowska A., Hryniewicz W., Gniadkowski M.: Countrywide spread of CTX-M-3 extended-spectrum β-lactamase-producing microorganisms of the family Enterobacteriaceae in Poland. Antimicrob. Agents Chemother., 2002, 46(1), 151-159. 19. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial testing. 16th Informational Supplement. M100-S16.Wayne, PA, CLSI, 2006. 20. Hryniewicz W., Sulikowska A., Szczypa K., Skoczyńska A., Kadłubowska-Łuczak A., Gniadkowski M.: Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego, Warszawa 2006, 1-49. 21. Pitout J.D.D., Reisbig M.D., Venter E.C., Church D.L., Hanson N.D.: Modification of the double-disk tests for detection of Enterobacteriaceae producing extended-spectrum and AmpC β-lactamases. J. Clin. Microbiol., 2003, 41(8), 3933-3935. 22. Sundsfjord A., Simonsen G., Haldorsen B., Haaheim H., Hjelmevoll S.O., Littauer P., Dahl K.H.: Genetic methods for detection of antimicrobial resistance. APMIS, 2004, 815-837. 23. Gonlugur U., Bakici M.Z., Akkurt I., Efeoglu T.: Antibiotic susceptibility patterns among respiratory isolates of gram-negative bacilli in a Turkish university hospital. BMC Microbiology, 2004, 4, 32. 24. Luzzaro F., Mezzatesta M., Mugnaioli C., Perilli M., Stefani S., Amicosante G., Rossolini G.M., Toniolo A.: Trends in production of extended-spectrum β-lactamases among enterobacteria of medical interest: Report of the Second Italian Nationwide Survey. J. Clin. Microbiol., 2006, 44(5), 1659-1664. 25. Spanu T., Luzzaro F., Perilli M., Amicosante G., Toniolo A., Fadda G. and The Italian ESBL Study Group: Occurrence of extended-spectrum β-lactamases in members of the family Enterobacteriaceae in Italy: implications for resistance to β-lactams and other antimicrobial drugs. Antimicrob. Agents Chemother., 2002, 46(1), 196-202. Adres do korespondencji: Zakład Diagnostyki Mikrobiologicznej ul. Waszyngtona 15a 15-276 Białystok