Testy ekotoksykologiczne, czyli nowe trendy w monitoringu jakości wód powierzchniowych i podziemnych

ALICJA KRZEMINSKA zanieczyszczeniami W artykule przedstawiono ważniejsze metody ekotoksykologiczne (bioindykacyjne), stosowane w badaniach jakości wód na świecie i w Polsce. Przedstawiono również ich krótką charakterystykę i możliwości zastosowania w realiach polskich. Akademia Rolnicza we Wrocławiu Instytut Kształtowania i Ochrony Środowiska Testy ekotoksykologiczne, czyli nowe trendy w monitoringu jakości wód powierzchniowych i podziemnych Nadgorliwość, czy konieczność? e współczesnym świecie techniki analityczne pozwalają na uzyskanie wiarygodnych danych określających w sposób ilościowy i jakościowy skład chemiczny wody. Analityka chemiczna pozwala na ocenę parametrów fizycznych takich, jak: barwa, zapach, temperatura, jak również chemicznych -do których można zaliczyć m.in.: ph, CHZT - chemiczne zapotrzebowanie na tlen, twardość wody, stężenia niektórych substancji. Stosowanie tych metod jest często praco- i czasochłonne, jak wszyscy wiemy - również bardzo kosztowne (szczególnie w wypadku oznaczeń metali ciężkich, związków organicznych i składników specyficznych). Co równie ważne stosowanie tych metod wymaga wysoko wykwalifikowanego personelu i dużego zaplecza laboratoryjnego, l nie ma w tym nic złego i niepokojącego, ale w codziennej praktyce monitoringowej wód powierzchniowych, podziemnych, jak również w badaniu jakości ścieków, odczuwana jest potrzeba stosowania szybkich, bardziej specyficznych, mobilnych" (tj. możliwych do zastosowania w pomiarach polowych) form analiz toksyczności wody in situ i w układzie on linę. Pomimo bardzo rozbudowanego systemu analiz chemicznych na podstawie dokładnej analizy chemicznej nie potrafimy jeszcze określić faktycznej toksyczności związków chemicznych dla organizmów żywych, a jedynie możemy wnioskować o potencjalnej toksyczności. Jak do tej pory nie skonstruowano takiej aparatury. Jedynie żywe organizmy, na różnym poziomie organizacji, pozwalają na taką ocenę [1, 3, 21]. W rutynowej analizie chemicznej ogromna większość zanieczyszczeń przechodzi przez sito analityczne i uwzględniona jest tylko w ogólnych parametrach chemicznych wody. Dość trudno jest w ten sposób wychwycić trucizny działające już w minimalnych stężeniach (pestycydy). Postępująca chemizacja współczesnego życia powoduje zaniepokojenie odległymi skutkami działania różnych powszechnie stosowanych substancji. Odbija się to oczywiście na jakości wód zarówno powierzchniowych, jak i podziemnych. Przemysł chemiczny wytwarza rocznie tysiące, a nawet miliony produktów o nieznanym działaniu na człowieka i środowisko przyrodnicze. Związki te w wyniku awarii, mogą przedostać się do zbiorników wody pitnej, bądź też największego zagrożenia ostatnich lat-ataków terrorystycznych i bioterrorystycznych. Ataki te, wbrew mniemaniu wielu ludzi, nie są niczym nowym w naszym świecie. Już w czasach biblijnych często dochodziło do skażenia wód, co w konsekwencji powodowało masowe zgony zarówno ludzi, jak i zwierząt. W VI wieku p.n.e. Asyryjczycy zatruwali żywność swoich wrogów żytem, które wcześniej zanieczyścili sporyszem (sporysz zawiera m.in. ergotaminę), Solon w Atenach zatruł wodę z akweduktów ciemiernikiem. Jedna z wypraw krzyżowych w 1228 r. zakończyła się fiaskiem, ponieważ rycerzy zdziesiątkowała epidemia czerwonki [4]. Charakterystycznym zjawiskiem w wiekach średnich były różne epidemie wywołane złym stanem sanitarnym wód i brakiem higieny. Współcześnie również Polska znalazła się w centrum epidemiologicznym. Po 1945 r. na Ziemiach Odzyskanych wybuchła największa w historii Polski epidemia duru brzusznego - prawie 82 000 zachorowań i ok. 5000 zgonów. Epidemia ta zebrała największe żniwo na Dolnym Śląsku, szczególnie we Wrocławiu. Masowe zatrucie, znane jako choroba itai-itai w Japonii (1948 r.) zdziesiątkowało ludność mieszkającą w pobliżu kopalń rud miedzi, cynku i kadmu. Skażone zostały wówczas pola ryżowe wodami odpływowymi z tych obiektów [18]. Przykłady można by mnożyć. Niestety, przy współczesnej technice akty terrorystyczne są bardziej niebezpieczne, ze względu na możliwość oddziaływania terrorystów na większą skalę. Terroryzm chemiczny i bioterroryzm staje się bronią szaleńców, przed którymi trudno się obronić. Nie możemy wykluczyć również możliwości ataku terrorystycznego na ujęcia wód pitnych, które stanowią cele strategiczne. Są to oczywiście sytuacje ekstremalne, które jednak mogą się zdarzyć. Skażenie wód jest zazwyczaj wyłapane" podczas analizy chemicznej, ale oczywiście możemy sobie zadać pytanie: A co się stanie w momencie, gdy do skażenia wody zostanie wykorzystany nowy, nieznany, silnie toksyczny zwią- Gospodarka Wodna nr 1/2004 19

Wykorzystuje substancje chemiczne np. zmiana barwy związku Chemiczny skład ilościowy i jakościowy Analiza bioindykacyjna Wykorzystuje żywy organizm obserwowane symptomy, np.: choroba, zmiany morfologiczne ciała jak również śmierć organizmu Określenie w jakim stopniu układ jest toksyczny Rys. 1. Schemat obrazujący różnice pomiędzy analizą bioindykacyjną a chemiczną zek chemiczny? Czy zostanie dostatecznie szybko zidentyfikowany i oznaczony? Czy też co się stanie, gdy w wodzie znajdzie się, w ogromnym stężeniu, związek chemiczny potencjalnie toksyczny, którego akurat w danej analizie nie oznaczano? Czy istnieje skuteczna metoda wychwycenia obecności tych związków bez dużych nakładów kosztów? Odpowiedź znaleźć można we współczesnych metodach bioindykacyjnych środowiska wodnego. W naszych rozważaniach należy również zwrócić uwagę na to, że ekspozycja populacji ludzkiej na mikrozanieczyszczenia wody jest długotrwała, jak też często niemożliwy jest do wyodrębnienia spośród innych czynników ich wpływ na zdrowie ludzi. Stwarza to konieczność ścisłego monitorowania, także w aspekcie potencjalnej genotoksyczności surowca pobieranego przez wodociągi. W ramach monitoringu prowadzi się głównie analizę chemicznąwody, niestety rzadko bioindykacyjną, a metoda ta pozwala (zarówno in situ, jak i on linę), na uzyskanie pierwszego sygnału, że próba jest skażona i wymaga dokładniejszej analizy chemicznej bez wykorzystania większych kosztów, co w dzisiejszych, niebezpiecznych czasach powinno mieć szczególne i priorytetowe znaczenie. Czym jest bioindykacja? Bioindykacja jest metodą, która wykorzystuje jako wskaźnik żywy organizm. Reakcja organizmu może być podstawą do oceny ogólnej aktywności biologicznej badanego układu. Pozwolić to może na poznanie sumarycznej toksyczności wszystkich toksycznych substancji znajdujących się w wodzie, również w przypadku substancji działających ze sobą na zasadzie synergizmu. Obie omawiane metody opierają się na tej samej zasadzie, ale mają do spełnienia różne cele. W analizie chemicznej wykorzystuje się substancje, które łącząc się podczas reakcji z substancjami badanymi dają charakterystyczne efekty ilościowe i jakościowe, np. efekty barwne. W metodach bioindykacyjnych to żywy organizm jest swoistym odczynnikiem", wewnątrz którego zachodzą procesy biochemiczne. Wynikiem tego są obserwowane symptomy, np.: zmiany morfologiczne ciała, choroba, a w konsekwencji śmierć organizmu. Cel obu metod jest odmienny. Analiza chemiczna daje nam obraz ilościowy związków chemicznych występujących w danej próbie wody, natomiast analiza bioindykacyjna ocenia ogólną toksyczność badanego układu, bez wskazywania, który ze związków jest toksyczny [13]. Schemat obrazujący różnice pomiędzy analiząchemiczną i bioindykacyjną pokazuje rys. 1. Metody bioindykacyjne w różnych kulturach są znane od tysiącleci. Dzięki obserwacji fauny i flory zapewne nie raz w odpowiednim momencie ostrzeżono ludność przed zatruciem i niebezpieczeństwem. Naukowy rozkwit metod bioindykacyjnych (ekotoksykologicznych) obserwowano na początku dwudziestego wieku. W latach sześćdziesiątych próbowano opisowo określić wpływ wszystkich szkodliwych substancji na podstawowe grupy organizmów żywych, szczególnie na skorupiaki i ryby, ze względu na ich ważne miejsce w łańcuchu troficznym [1]. Opracowano pierwsze standardowe procedury wykorzystujące ryby - standardy ASTM (American Society for Testing and Materials). W latach siedemdziesiątych prawodawstwo międzynarodowe i krajowe zaakceptowało wiele nowych metod bioindykacyjnych. W latach osiemdziesiątych i dziewięćdziesiątych powstało wiele prac przeglądowych dotyczących bioindykacji sensu stricto i całej gamy bioindykatorów, jak również postępującej internacjonalizacji metod badawczych. W końcu z okresu badań opisowych bioindykacja wkroczyła w okres opracowań statystycznych, jak również modnych dziś prób modelowania ekosystemów, przewidywania działania nowych związków na podstawie istniejących wyników, etc. [9]. Od wielu lat poruszany jest również problem toksycznego oddziaływania ścieków na ekosystemy wodne i jakość wód zarówno powierzchniowych, jak i podziemnych. W ostatnim dwudziestoleciu, szczególnie w USA i Kanadzie, rozpoczęto wprowadzanie zezwoleń na odprowadzanie ścieków do wód z uwzględnieniem wielkości ich toksycznego ładunku. Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska opracowała metodę wyznaczania bezpiecznych ładunków ścieków dla ochrony jakości wody na podstawie badań toksykologicznych [20, 22]. W Kanadzie opracowano indeks PEEP (Potential Ecotoxic Effects Próbę) służący do określenia i porównywania potencjału toksycznego ścieków przemysłowych. W krajach Unii ten problem jest jeszcze dyskutowany, natomiast w Polsce badania toksykologiczne z użyciem testów bioindykacyjnych są rzadko prowadzone, szczególnie w odniesieniu do wód powierzchniowych i podziemnych. Nowe rozporządzenie dotyczące jakości wody do picia [Rozporządzenie, 2002] wprowadziło znacznie rozszerzoną listę oznaczanych w wodzie związków organicznych, w tym pestycydów, co w konsekwencji prowadzi do automatycznego wzrostu poziomu analityki chemicznej. Niestety, nie ma tam wzmianki na temat biotestowania, a szkoda, ponieważ równocześnie z rozwojem metod analitycznych powinien się rozwijać blok metod ekotoksykologicznych. Metody bioindykacyjne są również z powodzeniem stosowane do badania toksyczności wody w wodociągach. Przykładem może być Zakład Wodociągu Centralnego w Warszawie, gdzie od wielu lat jako bioin- 20 Gospodarka Wodna nr 1/2004

dykator stosowany jest pierwotniak Spirostomum ambiguum [13], czy też badania toksyczności wody pitnej, oparte na krajowych małżach słodkowodnych [5]. Bioindykatorem może być jeden organizm żywy, bądź też układ organizmów na różnym poziomie organizacji. Obecnie stosuje się z różnym powodzeniem kilkaset organizmów testowych na różnych szczeblach rozwojowych [2,16, 19]. Do najbardziej znanych i najszerzej stosowanych organizmów należą ryby - w literaturze można spotkać ponad 150 gatunków ryb proponowanych do testów toksyczności przez ważniejsze amerykańskie organizacje: APHA (American Public Health Association), USEPA (US Environmental Protection Agency) i ASTM (American Society Testing and Materials), a Europejskie Centrum Ekotoksykologii w swej bazie danych zamieściło aż 60 gatunków ryb [9]. Niestety stosowanie ich jako bioindykatorów jest dość kosztowne i wymaga dobrze zorganizowanego laboratorium. W analizie bioindykacyjnej z użyciem ryb prowadzi się obserwację zależności pomiędzy specyficznymi odruchami oraz reakcjami fizjologicznymi a poziomem stężenia zanieczyszczeń w środowisku. Wśród gatunków ryb stosowanych w analizie bioindykacyjnej należy wymienić: Lepomis macrochirus (reakcja testowa dotyczy obserwacji ruchliwości i zachowania ryb w wodzie), Oncorchynchus myksis (reakcja testowa dotyczy oddychania -częstotliwości wentylacji), Leuciscus idus (zdolność pływania pod prąd). Spośród bezkręgowców najszerzej omawianymi w literaturze międzynarodowej organizmami testowymi są dafnie. Badania nad tymi organizmami prowadzono już w latach czterdziestych zeszłego stulecia [16]. Powód jest prozaiczny - dafnie są łatwo dostępne w środowisku wodnym, a ich fizjologia jest bardzo dobrze poznana. Fakt ten ułatwia ich hodowlę laboratoryjną, jak również pozwala na prowadzenie długoterminowych testów chronicznych. Poza tym dafnie wykazujądużąwrażliwość na szerokie spektrum zanieczyszczeń Środowiskowych, a ich małe rozmiary powodują, że testy z ich użyciem nie wymagają dużych objętości badanych próbek, jak również dużej przestrzeni w laboratorium - i to zarówno do prowadzenia hodowli, jak i do wykonywania samych testów, co w sumie z ekonomicznego punktu widzenia jest bardzo pożądane, ponieważ powoduje cięcie kosztów analiz. Również ciekawym przykładem bioindykatora jest racicznica zmienna (Dreissena polymorpha Pali), która jest bardzo Fot. 1. Tetrahymena thermophila - pierwotniak wykorzystywany w zestawie PROTO- XKIT F łatwa w hodowli (szybko się namnaża). Małż ten wykazuje dużą czułość na zmiany stężeń metali ciężkich w wodzie. Co ciekawe jego reakcja jest widoczna gołym okiem, ponieważ pod wpływem nagłych zmian stężeń metali ciężkich szybko zamyka muszlę. Jest on używany na terenach wielu wodociągów w krajach europejskich. Po katastrofie w Czernobylu [17] małże również wykorzystywano do badania globalnego natężenia promieniowania beta i gamma elektrowni jądrowej. Do analizy bioindykacyjnej wykorzystywane są również inne małże, takie jak: Gnathonemus petersc, Apteronatus albifrons, Corbicala fluminea, Scrorbicularia piana [21]. Ciekawym przykładem jest również rozdętka (Physa acuta Drap.), którą zaleca Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska (EPA) w testach toksyczności ostrej przy wykorzystaniu kryterium zmian w oddychaniu i produkcji jaj [19], a dobrze znaną nam błotniarkę stawową (Limnea Staginalis) stosuje się w analizie bioindykacyjnej w formie krótkotrwałego testu fizjologicznego obejmującego rozwój embrionalny tego organizmu z uwzględnieniem zakłóceń jego rozwoju [19]. Wśród glonów należy wymienić Chlorella sp., Scenedesmus subspicatus lub Selenastrum capricornutum [11, 15], które pozwalają na wykrycie nie tylko związków toksycznych (obniżenie tempa wzrostu bądź produkcji biomasy), ale również na ocenę zagrożenia substancjami biogennymi wywołującymi stymulację wzrostu komórek. Ciekawą grupą są również bakterie Fot. 2. Brachionus calyciflorus - wrotek wykorzystywany w zestawie ROTOXKIT CTM - coraz powszechniej i chętniej stosowane ze względu na małe rozmiary i łatwość wykonania biotestu. Organizmami tymi są Vibrio fisheri - bakterie luminescencyjne, jak również Pseudomonas putida i choćby znana od lat pałeczka duru brzusznego Salmonella typhimurium^o, 15]. Bakterie używane są niejako na stałe" w analityce bioindykacyjnej. W świecie, gdzie szybkie tempo i miniaturyzacja jest miernikiem postępu, organizmy testowe przechodzą ogromną selekcję. Do podstawowych wymagań stawianych takim organizmom należą przede wszystkim: dostępność i jednorodność genetyczna bioindykatorów, jak również ich niski koszt hodowli. Nie- Gospodarka Wodna nr 1/2004 21

Fot. 3. Daphnia magna - skorupiak wykorzystywany w zestawie DAPHTOXKIT F stety połączenie wszystkich wymagań jest niemożliwe, ze względu na to, że uzyskanie w ciągłej hodowli jednorodności genetycznej powoduje drastyczne zwiększenie kosztów biotestów. Tę sytuację wykorzystały firmy, które wyspecjalizowały się w produkcji gotowych pakietów testowych zawierających najczęściej organizmy testowe w postaci form kryptobiotycznych. Zaletą takich testów jest przede wszystkim fakt, że pochodzą one ze standardowej hodowli i mogą być Fot. 4. Zestaw toxkit do badania toksyczności wód długo przechowywane, by następnie w razie potrzeby w krótkim czasie mogły być przygotowane do testu. Nastąpiła tu swego rodzaju rewolucja w analityce bioindykacyjnej. Testy zminiaturyzowano, jak również wykonano ich dość dobrą standaryzację, co daje możliwość prowadzenia analiz nie tylko w dużych laboratoriach, ale również w małych placówkach analitycznych zarówno do bieżącej oceny toksyczności środowiska, jak i w sytuacjach alarmowych i co ciekawsze - nie tylko w laboratoriach stacjonarnych, ale również terenowych. Ma to szczególne znaczenie w badaniach regionu odległego od laboratorium, a przede wszystkim w wypadku nadzwyczajnych zagrożeń (nie tylko katastrof, ale również ataków terrorystycznych i bioterrorystycznych), jak również i wodociągów gdzie konieczna jest ciągła analiza jakości wód. Wśród prekursorów skryningowych testów bioindykacyjnych należy wymienić Microtox ; powstał on w 1979 r. w USA [3]. Organizmem testowym są bakterie luminescencyjne Vibrio fisheri. Test ten jako jeden z pierwszych łączył w sobie właściwą bioindykację z precyzją analizy instrumentalnej. Nowością było zastosowanie liofilizacji bakterii w celu ich przechowywania. Dodatkowym plusem jest łatwa obsługa systemu, ponieważ nie wymaga specjalistycznego przeszkolenia (mniejsze koszty), jak również większego doświadczenia w pracy z bioindykatorami - i to spowodowało, że jest on prawdopodobnie najczęściej stosowanym testem bioindykacyjnym używanym w ocenie toksyczności wody i ścieków. W Europie opracowano podobne testy oparte na tym samym organizmie o nazwach: Lumistox - w Niemczech, Biotox - w Finlandii i, jak wskazuje praktyka, eliminacja hodowli organizmów testowych znacznie obniżyła koszty analiz. W Belgii zespół prof. Guido Persoone z Uniwersytetu w Ghent stworzył testy zwane Toxkits [6-8], co właściwie stanowi przełom w badaniach bioindykacyjnych, ponieważ dostarczane do laboratorium organizmy znajdują się w formie kryptobiotycznej. Jak to wygląda? Otóż wrotki są sprzedawane w formie cyst, skorupiaki -w formie jaj przetrwalnych, zaś glony-jako komórki unieruchomione w nośniku - kulkach" zabezpieczonych przed rozwojem specjalnym roztworem. Główną zaletą tego rozwiązania jest fakt, że organizmy te mogą być przechowywane w zwykłej lodówce przez okres kilku miesięcy, bez obawy o utratę jakości. Wśród najpopularniejszych, obecnie stosowanych na świecie toxkitów wymienić należy: n Microtox - test wykorzystujący bakterie luminescencyjne Vibrio fischeri. Reakcją testową jest obniżenie luminescencji (świecenia) bakterii. Czas inkubacji jest wyjątkowo krótki - tylko 15 minut [12]. n Spirotox - test wykorzystujący pierwotniaki Spirostomum ambiguum opracowany w Zakładzie Badania Środowiska AM w Warszawie [13, 14]. W teście tym obserwuje się dwa rodzaje reakcji testowych: przyżyciowe defor- 22 Gospodarka Wodna nr 1/2004

macje komórki oraz śmierć komórki. Standardowy czas trwania testu (inkubacji) wynosi 24 godziny, chociaż w wielu wypadkach reakcje testowe występują już po 2 godzinach. n Protoxkit F - Toxkit wykorzystujący pierwotniaka Tetrahymena termophila. Reakcją testową jest inhibicja wzrostu pierwotniaków. Jej miarą jest spadek gęstości pokarmu (bakterii) mierzony spektrofotometrycznie. Jest to test chroniczny pozwalający w ciągu jedynie 24 godzin ocenić wpływ badanej próbki na kilka pokoleń pierwotniaków (fot. 1). n Rotoxkit F - Toxkit wykorzystujący wrotka Brachionus calyciflorus. Reakcją testową jest śmierć organizmu (fot. 2). n Daphtoxkit F magna - Toxkit wykorzystujący skorupiaka Daphnia magna. Standardowy test toksyczności przeprowadzony wg zaleceń OECD. Reakcją testową jest zahamowanie ruchu skorupiaków (immobilizacja) obserwowana po 24 i 48 godzinach inkubacji (fot. 3, 4). n Thamnotoxkit F - Toxkit wykorzystujący skorupiaka Thamnocephalus platyurus. Reakcją testową jest śmierć skorupiaków. Test wykonano przy zastosowaniu organizmów świeżo wylęgłych z jaj przetrwalnych. Test ten polecany jest jako tańsza alternatywa dla testu Daphnia. W wielu przypadkach test ten jest bardziej czuły na obecność substancji toksycznych niż standardowy test Daphnia (fot. 5). Metody bioindykacyjne, jak również skryningowe badania jakości wód przy pomocy prostych organizmów żywych, na całym świecie rozwijają się w postępie geometrycznym, od co najmniej 10 lat. W Polsce jest to stosunkowo nowy kierunek badań, który dopiero od niedawna zaczyna się prężnie rozwijać. Jednak już wiadomo, że w codziennej praktyce analitycznej odczuwa się coraz częściej potrzebę stosowania metod szybkiego określania toksyczności wody w warunkach polowych (in situ) i w układzie on-line. l nie jest to bynajmniej nadgorliwość, ale w obecnych czasach konieczność, ponieważ badania takie mogą w krótkim czasie stanowić bardzo ważną część analityki chemicznej i biologicznej stosowanej do oceny jakości wód pitnych w Polsce, szczególnie w dobie postępującej chemizacji środowiska, licznych awarii, czy też nawet ataków terrorystycznych. Można przypuszczać, że formy kryptobiotyczne organizmów stanowią przyszłość bioindykacji, a stosowanie tych samych organizmów przez wszystkie laboratoria -czyli nic innego jak standaryzacja, umożliwi porównywanie i powtarzalność wyników analiz. A od tego tylko krok do unormowań prawnych. Eliminacja hodowli pozwoliła obniżyć koszty badań, ale Fot 5. Thamnocephalus platyurus - skorupiak wykorzystywany w zestawie toxkit THAMNOTOXKIT F przede wszystkim udostępniła metody bioindykacyjne wszystkim laboratoriom, które wykonują tego typu testy rzadko, bądź też wcale. Umożliwi to stosowanie analityki bioindykacyjnej w rutynowej kontroli jakości wody i ścieków. Wizja możliwości zamawiania bioindykatorów, jak i zwykłych odczynników chemicznych, wydaje się sprawą oczywistą i jej realizacja jest tylko kwestią czasu. LITERATURA 1. APHA, 1989: Standard methods for the examination of water and wastewater. 17" 1 ed. American Public Health Association, American Water Works Association, Water Pollution Control Federation - Washington DC. Rozdz. 8. 2. A.L JR. BUIKEMA, B.R. NIEDERLEHNER, J. JR. CAIRNS, 1982: Biological Monitoring. Part IV. Toxicity testing. Water Res. 16, 239-262. 3. A.A. BULICH, 1982: A practical and reliable method for monitoring the toxicity of aquatic samples. Process. Biochem. 17, 45-47. 4. K. CHOMICZEWSKI, W. GALI, L. GRZYBO- WSKI, 2001: Epidemiologia działań wojennych i katastrof, L-medica press. 5. P. Domek, 2002; System biomonitoringu jakości wody oparty o krajowe małże słodkowodne. V Międzynarodowa Konferencja Naukowo-Techniczna Zaopatrzenie w Wodę i Jakość wód", Poznań-Gdańsk, Poland, 26-28.06., s. 361-364. 6. EC-C2, 1992: Methods for the determination of ecotoxicity. Acute toxicity for Daphnia". Official Journal of the European Communities. L 383 A/172. 7. EC-C1,1992: Methods for the determination of ecotoxicity. Acute toxicity for fish". Official Journal of the European Communities. L 383 A/169. 8. EC-C3,1992: Methods for the determination of ecotoxicity. Algal inhibition test". Official Journal of the Euroepan Communities. L 383 A/179. 9. ECETOK, 1993: Technical Report 56. Aguatic toxicity data evaluation. European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Brussels. 10. ISO 113480. Water quality - Determination of the inhibitory effects of water samples on the light emission of Vibrio fischeri. (Luminescent bacteria test). 11. ISO 8692-1994. Water quality - Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum. 12. Microtox manuał. Microbics Corporation, 1992. 13. G. NAŁĘCZ-JAWECKI, J. SAWICKI, 1996: Microtox - szybki system bioindykacyjny do oceny toksyczności wód i ścieków. Gaz, Woda i Techn. Sanit. nr 2, s. 47-51. 14. G. NAŁĘCZ-JAWECKI, J. SAWICKI: Toxicity of inorganic compounds in the Spirotox test - a miniaturized version of the Spirostomum ambiguum test. A. Environ. Contam. Toxicol. 34, s. 1-5. 15. OECD 201. (1997). Wytyczna OECD do badań substancji chemicznych. Glony, badanie hamowania wzrostu". Instytut Medycyny Pracy i Zdrowia Środowiskowego. Sosnowiec. 16. G. PERSOONE, C.R. JANSSEN, 1993: Freshwater invertebrate toxicity tests. [w:] ed. Calow P. Handbook of Ecotoxicology Vol. 1, Chapter 4, Blackwell Scientific Publ. 17. O. RAYERA, L. GIANNOI, 1995: Sci. Total Environ. 172, 183. 18. B. SEYDA, 1997: Dzieje medycyny w zarysie. PZWL, Warszawa. 19. B. SŁOMCZYŃSKA, 1988: Metody określania toksyczności zanieczyszczeń wprowadzanych do wód. Wiadom. Ekol. 34, s. 307-323. 20. DS EPA, Technical Support Document for Water Ouality-Based Toxics Control, DS EPA- Office of Water, Washington 1991. 21. W. WARDECKI, J. NAMIEŚNIK, 2001: Zastosowanie metod biologicznych w analizie zanieczyszczeń środowiska, Mikrozanieczyszczenia w środowisku człowieka. Wyd. Politechniki Częstochowskiej, Konferencje 44, Częstochowa 2001, s. 101-112. 22. M. ZAŁĘSKA-RADZIWIŁŁ, D. WOJEWÓDKA, 2001: Zastosowanie testów do oceny szkodliwości ścieków, Mikrozanieczyszczenia w środowisku człowieka, Wyd. Politechniki Częstochowskiej, Konferencje 44, s. 256-263. Gospodarka Wodna nr 1/2004 23 D