Lekowrażliwość szczepów Escherichia coli z antygenem K1 izolowanych od kobiet ciężarnych i noworodków

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 121-130 Agnieszka Kaczmarek, Anna Budzyńska, Eugenia Gospodarek Lekowrażliwość szczepów Escherichia coli z antygenem K1 izolowanych od kobiet ciężarnych i noworodków Katedra i Zakład Mikrobiologii, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: dr hab. E. Gospodarek, prof. UMK Oceniono lekowrażliwość szczepów E. coli z antygenem K1 oraz bez tego antygenu. Stwierdzono, że szczepy te istotnie różniły się wrażliwością na ampicylinę z sulbaktamem (85,1% vs 95,5%) (p=0,041), cefalotynę (70,1% vs 85,1%) (p=0,038) i tetracyklinę (91,0% vs 74,6%) (p=0,012). Wśród badanych pałeczek E. coli K1+ i K1- nie wykryto szczepów zdolnych do wytwarzania beta-laktamaz typu ESBL. Pałeczki E. coli do 1920 roku były uważane wyłącznie za komensale przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt stałocieplnych. Erę badań nad patogennymi szczepami E. coli rozpoczęło wyizolowanie ich z kału od dziecka z biegunką (19). Chorobotwórcze szczepy E. coli mogą przejściowo występować na skórze i błonach śluzowych jamy ustnej, przewodu pokarmowego, układu oddechowego, cewki moczowej i pochwy. Szczepy te zwykle posiadają szereg czynników wirulencji, dzięki którym mają zdolność wywołania zakażenia. Istotnym czynnikiem ułatwiającym E. coli kolonizację, jak i szerzenie się zakażenia jest antygen K1. Szczepy E. coli wytwarzające otoczkowy antygen K1 mogą powodować zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych (ang. Neonatal Meningitis Associated E. coli, NEMEC) u noworodków, bakteriemie (ang. Sepsis Associated E. coli, SEPEC) oraz zakażenia układu moczowego (ang. Uropathogenic E. coli, UPEC) u noworodków i osób dorosłych (2). Celem pracy było porównanie wrażliwości na antybiotyki i chemioterapeutyki szczepów E. coli z antygenem K1 ze szczepami E. coli bez tego antygenu. MATERIAŁ I METODY Materiał. Materiał do badań stanowiło 67 szczepów E. coli z antygenem K1 (E. coli K1+) oraz 67 szczepów bez tego antygenu (E. coli K1-). Szczepy te izolowano z wymazu z pochwy (n=21), odbytu (n=74) i z moczu (n=12) od kobiet ciężarnych oraz z wymazu z przedsionka nosa (n=19), odbytu (n=3) i z moczu (n=5) od noworodków. Badana grupa noworodków była dobrana losowo niezależnie od badanych kobiet. Wszystkie szczepy izolowano w okresie czerwiec-wrzesień 2008 roku od pacjentów Szpitala Uniwersyteckiego

122 A. Kaczmarek, A. Budzyńska, E. Gospodarek Nr 2 nr 2 im. dr. J. Biziela Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu. Identyfikacja szczepów E. coli. Identyfikację szczepów do gatunku przeprowadzono na podstawie morfologii kolonii, zdolności fermentacji laktozy i wytrącania dezoksycholanu sodu na podłożu MacConkey Agar (Becton Dickinson). Ponadto, uwzględniono zdolność wytwarzania indolu, przy jednoczesnym wykluczeniu zdolności wytwarzania ureazy na podłożu z mocznikiem i L-tryptofanem. Badane szczepy wkłuwano w wyżej wymienione podłoże. Wynik odczytywano po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 C. Na brak wytwarzania ureazy wskazywało żółte zabarwienie podłoża. Następnie, po dodaniu odczynnika Jamesa (biomérieux), wykrywano indol. Pojawienie się czerwonego pierścienia na powierzchni podłoża świadczyło o reakcji dodatniej. Przynależność wyhodowanych bakterii do gatunku określano także w oparciu o wyniki reakcji biochemicznych ujętych w testach ID 32E (biomérieux), których odczytu dokonano w systemie komputerowym ATB Expression V 2.8.8 (biomérieux). Oznaczanie obecności antygenu K1. Występowanie antygenu K1 na powierzchni komórek pałeczek E. coli oznaczono techniką PCR, w której jako cel molekularny amplifikacji wybrano gen neuc (676 pz). DNA z badanych szczepów E. coli izolowano przy użyciu zestawu Genomic Mini (A&A Biotechnology). Reakcję PCR wykonano w 25 µl mieszaniny reakcyjnej składającej się z buforu optymalizującego reakcję (1,5x), MgCl 2 (2 mm), dntp Mix (5 nmol każdy), starterów (12,5 pmol każdy), termostabilnej polimerazy GoTaq (1U) (Promega) oraz wyizolowanego DNA (1µl). Startery wykorzystane w badaniach zostały zsyntetyzowane przez Pracownię Sekwencjonowania DNA i Syntezy Oligonukleotydów IBB PAN i charakteryzowały się następującą kolejnością nukleotydów (15): neuc1 5 AGG TGA AAA GCC TGG TAG TGT G 3, neuc2 5 GGT GGT ACA TCC CGG GAT GTC 3. W reakcji PCR używano wody do biologii molekularnej (Eppendorf). Amplifikację DNA prowadzono w termocyklerze GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems), stosując następujące parametry: wstępna denaturacja DNA (94 C, 3 minuty), a następnie 30 cykli o profilu: denaturacja (94 C, 1 minuta), przyłączanie starterów (58 C, 1 minuta), wydłużanie starterów (72 C, 1 minuta) oraz końcowe wydłużanie starterów (72 C, 10 minut). Kontrolę dodatnią reakcji PCR stanowiło DNA izolowane z hodowli w bulionie tryptozowo-sojowym (ang. Trypticase Soy Broth, TSB) (Becton Dickinson) szczepu E. coli BEN2908 (15). Szczep ten otrzymano dzięki uprzejmości Pana Dr Pierre Germon z Unité Infectiologie Animale et Santé Publique, Francja. Jako kontrolę ujemną reakcji PCR stosowano mieszaninę reakcyjną z wodą zamiast DNA. Uzyskane produkty reakcji PCR rozdzielano elektroforetycznie w 1,5% żelu agarozowym (Sigma) w buforze 1x TBE (BioRad) i w obecności wzorca wielkości DNA (GeneRuler TM 100 bp DNA Ladder) (Fermentas). Wyniki badań oceniano i archiwizowano przy użyciu systemu do analizy i dokumentacji obrazów elektroforetycznych (GelDoc 2000) (BioRad). Oznaczanie lekowrażliwości pałeczek E. coli. Wrażliwość szczepów E. coli na antybiotyki i chemioterapeutyki oceniano metodą krążkowo-dyfuzyjną na podłożu Mueller-Hinton 2 Agar (MHA) (Becton Dickinson) według Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (3). W oparciu o wytyczne Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD) (6) stosowano krążki z następującymi antybiotykami i chemioterapeutykami: ampicylina (10 µg), tikarcylina (75 µg), piperacylina (100 µg), ampicylina z sulbaktamem (10/10 µg), tikarcylina z kwasem klawulanowym (75/10

Nr 2 Lekowrażliwość E. coli K1 123 µg), amoksycylina z kwasem klawulanowym (20/10 µg), piperacylina z tazobaktamem (100/10 µg), cefalotyna (30 µg), cefazolina (30 µg), cefoksytyna (30 µg), cefuroksym (30 µg), cefotaksym (30 µg), ceftazydym (30 µg), cefepim (30 µg), aztreonam (30 µg), imipenem (10 µg), gentamicyna (10 µg), tobramycyna (10 µg), amikacyna (30 µg), netilmicyna (30 µg), tetracyklina (30 µg), tigecyklina (15 µg), norfloksacyna (10 µg), ciprofloksacyna (5 µg), chloramfenikol (30 µg), fosfomycyna (200 µg), nitrofurantoina (300 µg), trimetoprim/ sulfametoksazol (1,25/23,75) (Becton Dickinson). Zastosowano także krążki zawierające cefprozil (30 µg), cefoperazon (75 µg), cefoperazon z sulbaktamem (30/75 µg), cefpodoksym (10 µg) (Becton Dickinson). W celu kontroli prawidłowości wykonania oznaczenia lekowrażliwości stosowano szczep E. coli ATCC 25922. Test dwóch krążków. Wytwarzanie beta-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym (ang. Extended Spektrum Beta-Lactamases, ESBL) oznaczono stosując krążki z cefotaksymem (30 µg) i ceftazydymem (30 µg) oraz z amoksycyliną z kwasem klawulanowym (20/10 µg) (Becton Dickinson). W celu zwiększenia czułości testu zastosowano krążek z aztreonamem (30 µg) (Becton Dickinson). Jako kontrolę jakości oznaczenia ESBL stosowano szczep Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 wytwarzający beta-laktamazy typu ESBL oraz szczep E. coli ATCC 25922 nie wytwarzający tego enzymu. Metody statystyczne. W celu wykazania różnic między porównywanymi grupami szczepów E. coli K1+ i K1- we wrażliwości na badane antybiotyki i chemioterapeutyki zastosowano test niezależności χ 2. W analizie statystycznej połączono grupę szczepów średnio wrażliwych i opornych ze względu na ich niską liczebność. Analizie statystycznej poddano wyniki badań wrażliwości szczepów E. coli K1+ i K1- na ampicylinę, ampicylinę z sulbaktamem, piperacylinę, tikarcylinę, tikarcylinę z kwasem klawulanowym, cefalotynę, tetracyklinę, chloramfenikol oraz trimetoprim i sulfametoksazol. Dla pozostałych antybiotyków i chemioterapeutyków przeprowadzenie analizy statystycznej było niemożliwe z powodu niewielkiej liczby szczepów średnio wrażliwych i opornych. WYNIKI Wrażliwość na wszystkie stosowane w badaniach antybiotyki i chemioterapeutyki wykazano u 43 (64,2%) szczepów E. coli K1+ oraz u 36 (53,7%) szczepów E. coli K1-. Występowanie szczepów średniowrażliwych i opornych przynajmniej na jeden stosowany w badaniach antybiotyk/chemioterapeutyk stwierdzono u pozostałych 24 (35,8%) szczepów E. coli K1+ i 31 (46,3%) K1-. Różnice między wyżej wymienionymi odsetkami szczepów nie były statystycznie istotne (p=0,22). Wykazano identyczny odsetek szczepów E. coli K1+ i K1- niewrażliwych na dwa oraz 9 leków. Odsetek szczepów E. coli K1+ i K1- niewrażliwych tylko na jeden, a także na 5 oraz 6 antybiotyków/chemioterapeutyków był porównywalny. Wyjątek stanowiła grupa szczepów niewrażliwych na 3-4 oraz 7 leków, do której należały wyłącznie pałeczki E. coli K1- (Tabela I). Wyniki wrażliwości bakterii E. coli K1+ i K1- na badane antybiotyki i chemioterapeutyki zawarto w tabeli II. Analizując wyniki lekowrażliwości pałeczek E. coli K1+ i K1- stwierdzono, że w obu grupach wszystkie szczepy były wrażliwe na połączenie piperacyliny z tazobaktamem, cefoperazonu z sulbaktamem, cefotaksym, ceftazydym, cefepim, imipenem, amikacynę, netilmicynę i tigecyklinę. Taki sam odsetek szczepów E. coli z obu grup

124 A. Kaczmarek, A. Budzyńska, E. Gospodarek Nr 2 Tabela. I. Występowanie szczepów średniowrażliwych i opornych na antybiotyki/chemioterapeutyki wśród pałeczek E. coli K1+ i K1- Liczba E. coli antybiotyków/ K1+ (n=24) K1- (n=31) chemioterapeutyków n * % n % 1 7 10,5 6 9,0 2 3 4,5 3 4,5 3 0 0,0 6 9,0 4 0 0,0 4 6,0 5 8 11,9 7 10,5 6 5 7,5 3 4,5 7 0 0,0 1 1,5 8 0 0,0 0 0,0 9 1 1,5 1 1,5 n * liczba szczepów średniowrażliwych i opornych wykazywało wrażliwość na cefazolinę, cefoksytynę, cefoperazon i cefpodoksym (98,5%) oraz na cefprozil (97,0%). Wrażliwość na aztreonam, gentamicynę, tobramycynę, norfloksacynę, ciprofloksacynę, fosfomycynę i nitrofurantoinę wykazały wszystkie szczepy E. coli K1+ i 98,5% K1-, a odwrotne wyniki notowano w przypadku połączenia amoksycyliny z kwasem klawulanowym i cefuroksymu. Dla wymienionych antybiotyków i chemioterapeutyków ze względu na niską liczebność grupy szczepów średniowrażliwych i opornych (n<3), przeprowadzenie obliczeń statystycznych nie było możliwe. Statystycznie nieistotne okazały się różnice między grupą szczepów E. coli K1+ i K1- we wrażliwości na ampicylinę (77,6% vs 67,2%) (p=0,18), piperacylinę (80,6% vs 76,1%) (p=0,53), tikarcylinę (82,1% vs 70,1%) (p=0,11), tikarcylinę z kwasem klawulanowym (97,0% vs 94,0%) (p=0,40), chloramfenikol (95,5% vs 97,0%) (0,65) oraz trimetoprim/ sulfametoksazol (95,5% vs 88,1%) (p=0,12). Porównując E. coli K1+ i K1-, stwierdzono statystycznie istotne różnice we wrażliwości szczepów z obu grup na ampicylinę z sulbaktamem (85,1% vs 95,5%) (p=0,041) i cefalotynę (70,1% vs 85,1%) (p=0,038) oraz na tetracyklinę (91,0% vs 74,6%) (p=0,012). Pałeczki E. coli zarówno K1+, jak i K1- były oporne głównie na ampicylinę (20,9% i 31,3%), tikarcylinę (17,9% i 29,9%) i piperacylinę (17,9% i 19,4%). Ponadto, 25,4% szczepów niewrażliwych na tetracyklinę stwierdzono w grupie szczepów E. coli K1-. Na pozostałe stosowane w badaniu antybiotyki i chemioterapeutyki było opornych od 0,0% do 11,9% szczepów E. coli K1+ i K1-. Wśród badanych pałeczek E. coli z grupy K1+ i K1- nie wykryto szczepów zdolnych do wytwarzania beta-laktamaz typu ESBL. DYSKUSJA Analiza wyników badań bakteriologicznych, obejmujących swym zasięgiem szpitale, regiony, czy kraje jest istotna, gdyż pozwala zdobyć wiedzę o oporności bakterii na antybio-

Nr 2 Lekowrażliwość E. coli K1 125 Tabela. II. Porównanie wrażliwości na antybiotyki i chemioterapeutyki szczepów E. coli K1+ i K1- Antybiotyk E. coli K1+ (n=67) E. coli K1- (n=67) W * % S * % O * % W % S % O % Ampicylina 52 77,6 1 1,5 14 20,9 45 67,2 1 1,5 21 31,3 Ampicylina/ Sulbaktam 57 85,1 7 10,4 3 4,5 64 95,5 3 4,5 0 0,0 Piperacylina 54 80,6 1 1,5 12 17,9 51 76,1 3 4,5 13 19,4 Piperacylina/ tazobaktam 67 100,0 0 0,0 0 0,0 67 100,0 0 0,0 0 0,0 Tikarcylina 55 82,1 0 0,0 12 17,9 47 70,1 0 0,0 20 29,9 Tikarcylina/kwas klawulanowy 65 97,0 2 3,0 0 0,0 63 94,0 4 6,0 0 0,0 Amoksycylina/kwas klawulanowy 66 98,5 1 1,5 0 0,0 67 100,0 0 0,0 0 0,0 Cefalotyna 47 70,1 14 21,0 6 8,9 57 85,1 8 11,9 2 3,0 Cefazolina 66 98,5 0 0,0 1 1,5 66 98,5 0 0,0 1 1,5 Cefoksytyna 66 98,5 0 0,0 1 1,5 66 98,5 0 0,0 1 1,5 Cefprozil 65 97,0 2 3,0 0 0,0 65 97,0 2 3,0 0 0,0 Cefuroksym 66 98,5 0 0,0 1 1,5 67 100,0 0 0,0 0 0,0 Cefotaksym 67 100,0 0 0,0 0 0,0 67 100,0 0 0,0 0 0,0 Cefoperazon 66 98,5 1 1,5 0 0,0 66 98,5 1 1,5 0 0,0 Cefoperazon/ sulbaktam 67 100,0 0 0,0 0 0,0 67 100,0 0 0,0 0 0,0 Ceftazydym 67 100,0 0 0,0 0 0,0 67 100,0 0 0,0 0 0,0 Cefpodoksym 66 98,5 1 1,5 0 0,0 66 98,5 1 1,5 0 0,0 Cefepim 67 100,0 0 0,0 0 0,0 67 100,0 0 0,0 0 0,0 Aztreonam 67 100,0 0 0,0 0 0,0 66 98,5 1 1,5 0 0,0 Imipenem 67 100,0 0 0,0 0 0,0 67 100,0 0 0,0 0 0,0 Gentamicyna 67 100,0 0 0,0 0 0,0 66 98,5 0 0,0 1 1,5 Tobramycyna 67 100,0 0 0,0 0 0,0 66 98,5 0 0,0 1 1,5 Amikacyna 67 100,0 0 0,0 0 0,0 67 100,0 0 0,0 0 0,0 Netilmicyna 67 100,0 0 0,0 0 0,0 67 100,0 0 0,0 0 0,0 Tetracyklina 61 91,0 1 1,5 5 7,5 50 74,6 0 0,0 17 25,4 Tigecyklina 67 100,0 0 0,0 0 0,0 67 100,0 0 0,0 0 0,0 Norfloksacyna 67 100,0 0 0,0 0 0,0 66 98,5 1 1,5 0 0,0 Ciprofloksacyna 67 100,0 0 0,0 0 0,0 66 98,5 1 1,5 0 0,0 Chloramfenikol 64 95,5 2 3,0 1 1,5 65 97,0 1 1,5 1 1,5 Fosfomycyna 67 100,0 0 0,0 0 0,0 66 98,5 0 0,0 1 1,5 Nitrofurantoina 67 100,0 0 0,0 0 0,0 66 98,5 0 0,0 1 1,5 Trimetoprim/ sulfametoksazol 64 95,5 0 0,0 3 4,5 59 88,1 0 0,0 8 11,9 W * wrażliwy, S * średniowrażliwy, O * oporny

126 A. Kaczmarek, A. Budzyńska, E. Gospodarek Nr 2 tyki, odpowiedzialnych za to mechanizmach, a następnie wykorzystać ją w empirycznym leczeniu zakażeń. Jednak porównywanie przedstawianych przez różnych autorów wyników dotyczących lekowrażliwości izolowanych szczepów nie jest łatwe. Jednym z powodów jest brak jednej standardowej metody oznaczania wrażliwości szczepów na poszczególne antybiotyki i chemioterapeutyki, która byłaby stosowana na całym świecie. Różnice dotyczą, między innymi, wykorzystywanych podłoży, wielkości inokulum bakteryjnego, a także wartości stężeń granicznych. Ponadto, badacze często informują tylko o odsetku szczepów wrażliwych lub opornych. Natomiast nie podają, do jakiej grupy zaklasyfikowali szczepy średniowrażliwe, co utrudnia interpretację danych. W niniejszej pracy analizowano lekowrażliwość szczepów E. coli K1+ i K1-, porównując te dane z wynikami przedstawionymi przez innych autorów. Biorąc pod uwagę wrażliwość na stosowane penicyliny półsyntetyczne, nie notowano istotnych różnic między badanymi szczepami E. coli K1+ i K1-. Natomiast Cisowska i wsp. (2) wykazali, że różnice między porównywanymi grupami szczepów E. coli K1+ i K1- we wrażliwości na ampicylinę (80,0% vs 48,6%) i piperacylinę (91,4% vs 54,3%) są statystycznie istotne. Podobnie, Fujita i wsp. (5) odnotowali znaczne różnice między szczepami E. coli K1+ i K1- we wrażliwości na ampicylinę (81,0% vs 55,0%). Dane otrzymane przez polskich (1, 4, 8, 14), jak i zagranicznych (7, 11, 16, 21, 23, 24) autorów wskazują na niższy niż otrzymany w badaniach własnych odsetek szczepów E. coli wrażliwych na penicyliny półsyntetyczne. Jedynie Nolewajka-Lasak i wsp. (17) notowali podobny do otrzymanego w niniejszej pracy odsetek szczepów E. coli wrażliwych na ampicylinę (78,2%), izolowanych z tylnej ściany pochwy i kanału szyjki macicy. Wyjątek stanowią także wyniki otrzymane przez Jamie i wsp. (9) i Kang i wsp. (10). Jamie i wsp. (9) którzy izolowali z moczu od kobiet ciężarnych z bezobjawową bakteriurią i zapaleniem pęcherza moczowego 75,0% szczepów wrażliwych na ampicylinę. Natomiast Kang i wsp. (10) wyosobnili z kału zdrowych ludzi 83,2% szczepów wrażliwych na piperacylinę. W niniejszej pracy odnotowano także wysoki odsetek szczepów E. coli wrażliwych na połączenia penicylin i cefoperazonu z inhibitorami beta-laktamaz. Istotne różnice między szczepami E. coli K1+ a K1- stwierdzono tylko w przypadku ampicyliny z sulbaktamem. Ponadto, notowano 97,0-100,0% pałeczek z obu grup wrażliwych na badane cefalosporyny, co znalazło potwierdzenie także w pracach innych autorów (4, 7, 13, 17, 22). Niższy odsetek (70,1-85,1%) szczepów wrażliwych wykazano tylko na cefalotynę. Podobne wyniki notowali inni badacze (2, 8, 21, 23, 25). Cisowska i wsp. (2) przeciwnie niż w badaniach własnych, nie wykazali istotnych statystycznie różnic między E. coli K1+ a K1- we wrażliwości na cefalotynę. Natomiast badane przez tych autorów szczepy znacznie różniły się wrażliwością na cefamandol i cefoperazon. W przedstawionej pracy wszystkie szczepy E. coli K1+ i K1- były wrażliwe na imipenem, co także stwierdziła Cisowska i wsp. (2). Tak wysoki odsetek szczepów E. coli wrażliwych na imipenem wykazali również inni autorzy (1, 14). Porównywalne wyniki otrzymano w Szwecji (13), Tajwanie (23) i Pakistanie (16) dla szczepów wyosobnionych z kału (13, 23) oraz pochwy (16). Dane dotyczące wrażliwości E. coli K1+ i K1- na aztreonam były prawie identyczne z wynikami przedstawionymi przez Cisowską i wsp. (2). W obu pracach wrażliwość na aztreonam wykazały wszystkie szczepy E. coli K1+ i ponad 90% K1-. Podobny odsetek szczepów wrażliwych notowano także w innych ośrodkach w naszym kraju (1, 4, 14), a znacznie niższy w Pakistanie (16).

Nr 2 Lekowrażliwość E. coli K1 127 Stwierdzono wysoki odsetek szczepów, zarówno E. coli K1+, jak i K1-, wrażliwych na gentamicynę, tobramycynę, amikacynę i netilmicynę. Wysoki odsetek szczepów z obu grup wrażliwych na gentamicynę, amikacynę oraz netilmicynę wykazała również Cisowska i wsp. (2). Pałeczki E. coli wyosobnione z przypadków zakażeń układu moczowego (4, 25) oraz od chorych na zapalenie pochwy i szyjki macicy (17) były także w wysokim odsetku wrażliwe na aminoglikozydy. Kronvall i wsp. (13) stwierdzili brak oporności na gentamicynę i amikacynę wśród szczepów izolowanych z kału. Natomiast znacznie niższy niż uzyskany w badaniach własnych odsetek szczepów E. coli wrażliwych na gentamicynę odnotowali Małafiej i wsp. (14) w Polsce, Yilmaz i wsp. (24) w Turcji, Mumtaz i wsp. (16) w Pakistanie i Olowe i wsp. (18) w Nigerii. W niniejszej pracy wszystkie badane szczepy E. coli były wrażliwe na tigecyklinę. Natomiast w przypadku oceny wrażliwości na tetracyklinę stwierdzono, że porównywane grupy bakterii różniły się. Odsetek szczepów wrażliwych na ten antybiotyk okazał się istotnie wyższy wśród E. coli K1+. W Korei (10), Nigerii (18) i Szwecji (13) izolowano więcej niż w badaniach własnych szczepów opornych na ten antybiotyk. W oparciu o uzyskane wyniki, odnotowano wysoki odsetek szczepów E. coli K1+ i K1-wrażliwych na badane fluorochinolony, co wykazały także badania przeprowadzone przez innych autorów (2, 7, 11, 13, 14, 22). Niższą częstość występowania szczepów E. coli wrażliwych na ciprofloksacynę stwierdzono w Polsce w 1999 roku (78,0-80,0%) (20) i w 2000 roku (80,0%) (12). Niższy niż w badaniach własnych odsetek szczepów wrażliwych na ciprofloksacynę i/lub norfloksacynę odnotowali Mumtaz i wsp. (16) oraz Yilmaz i wsp. (24). Na podstawie przeprowadzonych badań wrażliwość na chloramfenikol stwierdzono u ponad 95% szczepów E. coli K1+ i K1-. Porównywalny odsetek szczepów wrażliwych na ten antybiotyk izolowali z kału od zdrowych ludzi Kang i wsp. (10). Natomiast w przypadku szczepów wyosobnionych od chorych osób odsetek ten był niższy, podobny do uzyskanego przez Yang i wsp. (23). Z kolei Fujita i wsp. (5) izolowali z płynu mózgowo-rdzeniowego, krwi i innego materiału klinicznego od niemowląt 79,0% szczepów E. coli zarówno K1+, jak i K1- wrażliwych na chloramfenikol. W badaniach własnych stwierdzono wysoki odsetek szczepów E. coli K1+ i K1- wrażliwych na fosfomycynę. Wysoki procent wrażliwych na ten lek szczepów E. coli wyosobnionych z wymazów z pochwy oraz z moczu notowali również inni autorzy (16, 21). W uzyskanych w niniejszej pracy wynikach, podobnie jak inni badacze (2, 4, 7, 8, 9, 11, 13, 14, 21, 22) odnotowano wysoki odsetek szczepów E. coli K1+ i K1- wrażliwych na nitrofurantoinę. Jedynie w Warszawie izolowano tylko 12,4% szczepów wrażliwych na ten chemioterapeutyk (14). W przypadku trimetoprimu/sulfametoksazolu, wyższy odsetek szczepów wrażliwych stwierdzono wśród bakterii E. coli K1+ niż K1- (95,5% vs 88,1%), jednak wykazana różnica nie była statystycznie istotna. Natomiast statystycznie istotną różnicę między porównywanymi grupami szczepów E. coli K1+ i K1- we wrażliwości na kotrimoksazol odnotowała Cisowska i wsp. (100,0% vs 71,4%) (2). Porównując wyniki przedstawione przez innych autorów można stwierdzić duże ich zróżnicowanie. Odsetek szczepów E. coli wrażliwych na trimetoprim-sulfametoksazol w granicach 70,0-95,0% notowano w wielu ośrodkach w Polsce (4, 8, 14), jak i za granicą (7, 9, 11, 13, 22). Natomiast niższy, nieprzekraczający

128 A. Kaczmarek, A. Budzyńska, E. Gospodarek Nr 2 66,5%, odsetek wrażliwych bakterii wyosobniono w Warszawie (14), Lublinie (25) oraz w Turcji (24), Pakistanie (16), Nigerii (18) i Senegalu (21). W przedstawionej pracy wrażliwość na wszystkie badane antybiotyki i chemioterapeutyki wykazano u 64,2% szczepów E. coli K1+. Podobny wynik (60,0%) dla E. coli K1+ izolowanych z zakażeń układu moczowego otrzymała Cisowska i wsp. (2). Natomiast wśród E. coli K1- zidentyfikowano 53,7% takich szczepów, co odbiega od danych przedstawionych przez wymienionych autorów. Cisowska i wsp. (2) w grupie E. coli K1- wykryli tylko 14,3% szczepów wrażliwych na wszystkie użyte w badaniach antybiotyki i chemioterapeutyki. W badaniach własnych, porównując szczepy E. coli K1+ i K1-, które okazały się niewrażliwe przynajmniej na jeden antybiotyk, czy chemioterapeutyk, nie stwierdzono znacznych różnic między badanymi grupami szczepów. Wyjątek stanowiły szczepy niewrażliwe na 3-4 oraz 7 leków, do których należały wyłącznie pałeczki E. coli K1-. Z kolei Cisowska i wsp. (2) notowali porównywalny odsetek E. coli K1+ i K1- niewrażliwych na 2-3 i 5 leków. Częstsze występowanie oporności tylko na jeden oraz jednocześnie na 6-9, a nawet 16-17 antybiotyków/chemioterapeutyków autorzy stwierdzili wśród pałeczek E. coli K1-. Jednym z mechanizmów oporności pałeczek E. coli na antybiotyki beta-laktamowe jest wytwarzanie beta-laktamaz typu ESBL. Szczepy o ekspresji ESBL stanowią poważny problem terapeutyczny, gdyż są oporne na wszystkie penicyliny (bez połączeń z inhibitorami), cefalosporyny (z wyjątkiem cefamycyn) i aztreonam (6). Wśród badanych 134 szczepów nie odnotowano pojawienia się powiększenia strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół krążków z cefalosporynami, czy aztreonamem od strony krążka zawierającego inhibitor beta-laktamazy. Świadczyło to o braku zdolności tych szczepów do wytwarzania ESBL. Podobnie, Cisowska i wsp. (2) wśród badanych pałeczek E. coli K1+ i K1- nie wykryli takich szczepów. WNIOSKI 1. Ponad 50% szczepów E. coli K1+ i K1- było wrażliwych na wszystkie badane antybiotyki i chemioterapeutyki. 2. Stwierdzono statystycznie istotne różnice we wrażliwości szczepów z obu badanych grup na ampicylinę z sulbaktamem, cefalotynę i tetracyklinę. 3. Częstsze występowanie szczepów średniowrażliwych i opornych przynajmniej na jeden lek przeciwbakteryjny stwierdzono wśród pałeczek E. coli K1-. 4. Wśród badanych pałeczek E. coli K1+ i K1- nie wykryto szczepów zdolnych do wytwarzania beta-laktamaz typu ESBL. Dziękujemy prof. dr hab. Wiesławowi Szymańskiemu i Pracownikom Katedry i Kliniki Położnictwa, Chorób Kobiecych i Ginekologii Onkologicznej, dr Piotrowi Korbalowi i Pracownikom Oddziału Klinicznego Noworodków, Wcześniaków z Intensywną Terapią Noworodka za pobieranie wymazów od kobiet ciężarnych i noworodków, a także mgr Jolancie Kochanowskiej Kierownikowi Zakładu Mikrobiologii Szpitala Uniwersyteckiego nr 2 im. dr. J. Biziela w Bydgoszczy za udostępnienie niezbędnych do przeprowadzenia badań szczepów E. coli izolowanych od ciężarnych kobiet.

Nr 2 Lekowrażliwość E. coli K1 129 A. Kaczmarek, A. Budzyńska, E. Gospodarek Antimicrobial sensitivity of Escherichia coli strains with K1 antigen isolated from pregnant women and newborns SUMMARY The aim of this study was comparison of the susceptibility to antibiotics of E. coli strains with K1 antigen (E. coli K1+) and non-k1 E. coli strains (E. coli K1-). This study included 67 of E. coli K1+ and 67 of E. coli K1- strains isolated in the time period from June to September of 2008 from pregnant women and newborns hospitalized at dr. J. Biziel University Hospital number 2 L. Rydygier Collegium Medicum in Bydgoszcz Nicolaus Copernicus University in Toruń. Antimicrobial susceptibility of E. coli strains was tested by the disc-diffusion method, on the Mueller Hinton 2 Agar (Becton Dickinson). It was found that 64,2% of E. coli K1+ strains and 53,7% of E. coli K1- strains were susceptible to all tested antibiotics and chemioterapeutics. E. coli K1- strains were more often than E. coli K1+ nonsusceptible to at least one antimicrobial agent. The obtained results indicate that E. coli K1+ strains significant differed in the susceptibility to ampicillin/sulbactam (85,1% versus 95,5%) (p=0,041), cephalothin (70,1% versus 85,1%) (p=0,038) and tetracycline (91,0% versus 74,6%) (p=0,012) from E. coli K1- strains. All tested E. coli K1+ and K1- strains were sensitive to piperacillin/tazobactam, cefoperazone/sulbactam, cefotaxime, ceftazidime, cefepime, imipenem, amikacin, netilmicin and tigecycline. There weren t the ESBL-producing strains among tested E. coli K1+ and K1- rods. PIŚMIENNICTWO 1. Andrzejewska E, Szkaradkiewicz A, Kaniasty M. Wrażliwość na wybrane antybiotyki β-laktamowe klinicznych szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae. Med Dośw Mikrobiol 1998; 50: 197-205 2. Cisowska A, Ruczkowska J, Doroszkiewicz W. Wrażliwość na antybiotyki szczepów Escherichia coli z otoczkowym antygenem K1 izolowanych z zakażeń układu moczowego. Med Dośw Mikrobiol 2001; 53: 345-55 3. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standard for antimicrobial susceptibility testing; seventeenth informational supplement. Document M100-S17. Wayne, PA: CLSI (2007). 4. Drulis-Kawa Z, Lewczyk E, Jankowski S, Doroszkiewicz W. Występowanie i wrażliwość na leki uropatogennych pałeczek Gram-ujemnych. Med Dośw Mikrobiol 2000; 52: 119-27 5. Fujita K, Yoshioka H, Sakata H i inni. K1 antigen, serotype and antibiotic susceptibility of Escherichia coli isolated from cerebrospinal fluid, blood and other specimens from Japanese infants. Acta Paediatr Jpn 1990; 32: 610-4 6. Gniadkowski M, Żabicka D, Hryniewicz W. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki 2009. Oznaczanie wrażliwości pałeczek Gram- -ujemnych. Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwosci Drobnoustrojów, Narodowy Instytut Leków, Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej. 7. Hilbert DW, Paulish TE, Mordechai E i inni. Antimicrobial non-susceptibility of cervico-vaginal and rectal Escherichia coli isolates is associated with phylogeny and plasmid carriage. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2009; 28: 1399-40 8. Jackowska T, Pawlik K, Załęska-Ponganis J, Kłyszewska M. Etiologia zakażeń układu moczowego i profil lekowrażliwości: badania przeprowadzone na populacji dzieci hospitalizowanych w Klinicznym Oddziale Dziecięcym Szpitala Bielańskiego 2004-2006. Med Wieku Rozw 2008; 12: 705-12

130 A. Kaczmarek, A. Budzyńska, E. Gospodarek Nr 2 9. Jamie WE, Edwards RK, Duff P. Antimicrobial susceptibility of Gram-negative uropathogens isolated from obstetric patients. Infect Dis Obstet Gynecol 2002; 10: 123-6 10. Kang HY, Jeong YS, Oh JY i inni. Characterization of antimicrobial resistance and class 1 integrons found in Escherichia coli isolates from humans and animals in Korea. J Antimicrob Chemother 2005; 55: 639-44 11. Karlowsky JA, Kelly LJ, Thornsberry C i inni. Trends in antimicrobial resistance among urinary tract infection isolates of Escherichia coli from female outpatients in the United States. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 2540-5 12. Krajka K, Maruszak H, Szkarłat K, Perkowski D. Bezpieczeństwo i skuteczność stosowania preparatu Cipronex w zapobieganiu i leczeniu zakażeń układu moczowo-płciowego. Med Dypl 2000; 5: 19-27 13. Kronvall G, Larsson M, Borén C i inni. Extended antimicrobial resistance screening of the dominant faecal Escherichia coli and of rare resistant clones. Int J Antimicrob Agents 2005; 26: 473-8 14. Małafiej E. Racjonalna antybiotykoterapia w zakażeniach narządów płciowych i moczowych. Mikrobiologia Medycyna 1998; 4: 39-46 15. Moulin-Schouleur M, Répérant M, Laurent S i inni. Extraintestinal pathogenic Escherichia coli strains of avian and human origin: link between phylogenetic relationships and common virulence patterns. J Clin Microbiol 2007; 45: 3366-76. 16. Mumtaz S, Ahmad M, Aftab I i inni. Aerobic vaginal pathogens and their sensitivity pattern. J Ayub Med Coll Abbottabad 2008; 20: 113-7 17. Nolewajka-Lasak I, Rajca M, Kamiński K i inni. Wrażliwość na antybiotyki pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae izolowanych z pochwy i szyjki macicy kobiet. Med Dośw Mikrobiol 2003; 55: 351-6 18. Olowe OA, Okanlawon BM, Olowe RA, Olayemi AB. Antimicrobial resistant pattern of Escherichia coli from human clinical samples in Osogbo, south western Nigeria. Afr J Microbiol Res 2008; 2: 001-11 19. Puzanowska B, Prokopowicz D. Zakażenia Escherichia coli w praktyce lekarskiej. Lekarz 2005; 7/8: 44-9 20. Samet A, Bronk M, Naumiuk Ł i inni. Wieloośrodkowe badanie wrażliwości bakterii na preparat Cipronex (ciprofloksacyna) firmy Polpharma S. A. Klin Chor Zakaź Zak Szpit 2000; 4: 39-48 21. Sire JM, Nabeth P, Perrier-Gros-Claude JD i inni. Antimicrobial resistance in outpatient Escherichia coli urinary isolates in Dakar, Senegal. J Infect Dev Ctries 2007; 1: 263-8 22. Thibaut S, Caillon J, Huart C i inni. Susceptibility to the main antibiotics of Escherichia coli and Staphylococcus aureus strains identified in community acquired infections in France (MedQual, 2004-2007). Med Mal Infect 2010; 40: 74-80 23. Yang CM, Lin MF, Lin CH i inni. Characterization of antimicrobial resistance patterns and integrons in human fecal Escherichia coli in Taiwan. Jpn J Infect Dis 2009; 62: 177-81 24. Yilmaz N, Agus N, Yurtsever SG i inni. Prevalence and antimicrobial susceptibility of Escherichia coli in outpatient urinary isolates in Izmir, Turkey. Med Sci Monit 2009; 15: PI61-5 25. Zajączkowska M, Zinkiewicz Z, Bieniaś B i inni. Ocena wrażliwości na leki drobnoustrojów chorobotwórczych izolowanych w zakażeniach układu moczowego u dzieci. Pol Merk Lek 2002; 12: 420-4 Otrzymano: 22 IV 2011 r. Adres Autora: 85-094 Bydgoszcz, ul. M. Curie-Skłodowskiej 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii, Collegium Medicum im. Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet M. Kopernika w Toruniu