UNIWERSYTET JAGIELLOŃSKI WYDZIAŁ CHEMII ul. R. Ingerdena 3, 30-060 KRAKÓW tel. (12) 663-22-15; fax: (12) 634-05-15 Kraków, 26 października 2016 r. Recenzja pracy doktorskiej Pani mgr Katarzyny Zielińskiej pt. Opracowanie procedur analitycznych przeznaczonych do oznaczania substancji halucynogennych w próbkach o złożonym składzie matrycy Przedłożona mi do recenzji rozprawa doktorska Pani mgr Katarzyny Zielińskiej należy do prac z zakresu chemii analitycznej i dotyczy badań analitycznych nad wybranymi substancjami o działaniu halucynogennym. Głównym celem pracy było opracowanie czułej i selektywnej metody oznaczania tego typu związków w próbkach biologicznych (materiał grzybowy, płyny fizjologiczne). Narzędziem badawczym stosowanym przez Doktorantkę była elektroforeza kapilarna z detekcją PDA. Problematyka pracy bardzo ważna z puntu widzenia ochrony zdrowia i życia ludzkiego, Problem nadużywania związków psychoaktywnych działających na ośrodkowy układ nerwowy, potocznie zwanych narkotykami, jest w naszym kraju nie tylko ciągle aktualny, ale nabiera coraz większego znaczenia. Na rynku narkotykowym pojawia się nieustannie olbrzymia ilość nowych środków, o często nieznanym składzie chemicznym i niezbadanym jeszcze mechanizmie i stopniu oddziaływania na organizm. Substancje halucynogenne, którymi zajmuje się Doktorantka w swojej pracy, są szczególnie groźne, bo można je znaleźć w rozmaitych naturalnych produktach roślinnych, a więc są łatwo dostępne, a dodatkowo wiele z nich można stosować całkowicie legalnie. W tej sytuacji opracowywanie nowych metod analitycznych umożliwiających wykrywanie i oznaczanie tego typu substancji jest zadaniem niezwykle ważnym. Tematyka pracy jest także bardzo interesująca od strony analitycznej. Związki chemiczne odpowiedzialne za objawy halucynogenne są obecne w materiałach o złożonej matrycy biochemicznej, co osobie nad nimi pracującej naukowo stwarza możliwość wykazania własnych zdolności badawczych i analitycznych. Są też stosunkowo rzadko badane metodą elektroforezy kapilarnej, dając tym samym pole do osiągnięcia nowatorskich wyników i ich opublikowania w renomowanych czasopismach tematycznych. Sam wybór metody elektroforezy kapilarnej jako narzędzia badawczego jest również bardzo trafny z uwagi na jej rosnące znaczenie i coraz większe
wykorzystanie choć ciągle bez porównania mniejsze od tego, jakim charakteryzują się techniki chromatograficzne do identyfikacji i oznaczania związków organicznych w próbkach o bogatej matrycy. Rozprawa doktorska Pani mgr Katarzyny Zielińskiej została mi przedstawiona w formie broszury liczącej 171 stron i podzielonej na dwie główne części o charakterze literaturowym i doświadczalnym (choć zgodnie z numeracją zastosowaną przez Autorkę na pracę składa się, formalnie rzecz biorąc, aż 11 jej części). Tekst literaturowy jest poprzedzony spisem skrótów stosowanych w pracy, a na końcu rozprawy Autorka zamieściła streszczenie badań w języku polskim i angielskim oraz zebrała informacje składające się na jej dorobek naukowy. Rozprawa została oparta na 138 pozycjach literaturowych, na które składają się głównie artykuły zamieszczone w fachowych czasopismach naukowych. Zasadnicza część rozprawy rozpoczyna się bardzo krótkim wprowadzeniem, w którym Autorka ogólnie zapoznaje czytelnika z przedmiotem swoich badań, zarysowuje ich genezę i potrzebę realizacji, a także krótko przedstawia tematykę pracy. W następnym rozdziale dokonuje charakterystyki i podziału substancji halucynogennych zgodnie z ich strukturą chemiczną, a w kolejnym szeroko zajmuje się metodą elektroforezy kapilarnej, najpierw opisując jej podstawy teoretyczne i doświadczalne z uwzględnieniem różnych jej wersji technicznych, a następnie przedstawiając jej możliwości w zakresie zatężania próbek w kapilarze i poza kapilarą. Na końcu tej części pracy Autorka opisuje zastosowanie metody elektroforezy kapilarnej do oznaczania substancji halucynogennych. Opracowanie literaturowe dokonane przez Autorkę robi bardzo dobre wrażenie. Jego układ i zakres w zasadzie nie budzą większych zastrzeżeń (choć w miejsce np. teoretycznego opisu zasady działania elektroforezy kapilarnej, którą można znaleźć w podręcznikach, wolałbym przeczytać o oznaczaniu substancji halucynogennych innymi metodami analitycznymi ale jest to sprawa jak najbardziej dyskusyjna). Poruszane zagadnienia są opisane jasno i rzeczowo, będąc dowodem dużej wiedzy Autorki w zakresie tematyki pracy (jestem jedynie ciekawy, dlaczego na str. 32 uważa metodę elektroforezy kapilarnej za komplementarną, a nie alternatywną w stosunku do metody chromatograficznej). Na podkreślenie zasługuje bogaty materiał źródłowy, z jakim Doktorantka zdołała się zapoznać i go przestudiować. Na uwagę zwraca też fachowość i wnikliwość, jaką wykazała w opisie technik elektroforetycznych i zatężania próbek w kapilarze. Całość części literaturowej tematycznie bardzo dobrze nawiązuje do planowanych badań eksperymentalnych. Część doświadczalna jest poprzedzona krótkim opisem tez i celu pracy. Doceniając treściwość i lakoniczność tego tak ważnego fragmentu pracy, uważam, że Autorka niepotrzebnie go poszerzyła opisem wykonanych zadań badawczych, który przecież powinien znaleźć się na końcu rozprawy, a nie w tym miejscu. W części doświadczalnej rozprawy Doktorantka po zebraniu używanej bazy odczynnikowej i aparaturowej oraz przedstawieniu listy zebranych próbek i opisie ich przygotowania do analizy 2
przedstawiła i skomentowała wyniki swoich badań wykonane w trzech etapach. W pierwszym etapie stosuje technikę strefowej elektroforezy kapilarnej do identyfikacji i oznaczania wybranych substancji halucynogennych (kwasu ibotenowego, muscymolu, tryptaminy, kynureniny i tryptofanu) w próbkach gzrybów, W drugim te same substancje i kilka innych (melatoninę, indol, kwas kynureinowy, indolilo-3-acetamid) bada techniką micelarnej elektrokinetycznej chromatografii również w próbkach grzybów, a w trzecim skupia się na dostosowaniu techniki mikroekstrakcji do pojedynczej kropli do identyfikacji i oznaczania muscymolu, psylocyny i kwasu ibotenowego w próbkach moczu. Każdy etap badań zawiera doświadczenia optymalizacyjne, walidację opracowywanej metody i jej zastosowanie do analizy próbek rzeczywistych. Część doświadczalną pracy Autorka kończy podsumowaniem badań. Doświadczenia zostały przedstawione w sposób dość staranny i klarowny, pozwalający na dokładne śledzenie kolejnych etapów badań i uzyskiwane postępy. Opis ten w pełni ujawnia logikę i systematyczność wykonywanych badań. Trzeci etap badań wygląda w moim odczuciu za niedokończony, bo przecież mógłby też konsekwentnie dotyczyć analizy ekstraktów z próbek grzybów i oznaczania w nich większej gamy analitów, ale nie stanowi to zasadniczego zarzutu (w końcu pracę doktorską trzeba w jakimś momencie zakończyć). Praca jest zredagowana starannie. Zamieszczone rysunki i tabele są dość czytelne, opatrzone poprawnymi i wyczerpującymi podpisami. Całość napisana jest bez tak często spotykanych w tego typu pracach niepotrzebnie używanych zwrotów anglojęzycznych i pseudofachowych. Rozprawa, jako praca naukowa, ma sporą wartość, co decyduje o pozytywnej jej ocenie. Na ocenę tę wpływają następujące aspekty: Praca dotyczy (jak wspomniano wyżej) bardzo ważnej i interesującej tematyki badawczej, co udało się Autorce nie tyko dostrzec i zaanonsować, ale przede wszystkim udowodnić i udokumentować zarówno studiami literaturowymi, jak i przebiegiem badań i ich wynikami. Badania doświadczalne mają szeroki zakres zarówno w odniesieniu do liczby i rodzaju oznaczanych substancji halucynogennych, jak i liczby analizowanych próbek grzybów. Duże wrażenie robi nakład pracy i skrupulatność, jaką Autorka wykazała na etapach optymalizacji warunków instrumentalnych i chemicznych. Dotyczy to w szczególności eksperymentalnego dostosowania warunków rozdzielania elektroforetycznego, popartego logicznym rozumowaniem wynikającym z dużej wiedzy Autorki. Na podkreślenie zasługuje również ciekawość naukowa i wnikliwość Autorki, jaką wykazała w interpretacji wyników analitycznych, np. podczas próby znalezienia korelacji między rodzajem podłoża, w jaki znaleziono grzyby, a stężeniem wykrytych i oznaczonych w nich substancji halucynogennych. Niestety, obok bardzo jasnych fragmentów pracy można znaleźć dużo gorsze, a czasem wręcz zaskakująco negatywne. Smucą zwłaszcza te, które odnoszą się do czysto analitycznej strony 3
pracy, bo przecież Doktorantka jest specjalistką w zakresie chemii analitycznej, a praca ma charakter analityczny. Największe zastrzeżenia budzi etap walidacji wyników, w szczególności: Autorka nie podaje w jaki dokładnie sposób wyznaczała granice wykrywalności, za pomocą jakich roztworów (syntetycznych, dotowanych?) i o jakich stężeniach analitów wyznaczała precyzję metody, jaka była liczba powtórzeń pomiarów dokonywanych w okreslonych warunkach doświadczalnych. Doktorantka nie podejmuje żadnej próby oszacowania podstawowego parametru analizy ilościowej, jakim jest dokładność wyników. Jeżeli nie dysponowała odpowiednimi materiałami odniesienia, to mogła przecież w tym celu zastosować metodę odzysku. Mogła też by dać chociaż ogólny obraz stopnia rzetelności opracowanych metod porównać wyniki oznaczenia bodaj jednego wybranego analitu w tej samej próbce dwiema zastosowanymi w pracy technikami elektroforetycznymi. Brak jest w pracy uwag o ewentualnych, choćby potencjalnych efektach interferencyjnych, nie mówiąc już o jakichkolwiek próbach doświadczalnego badania tych efektów. Wyznaczone wartości stężeń analitów podawane w jednostkach µg/g mogłyby być uważane za miarodajne tylko w przypadku 100%-wej wydajności ekstrakcji, a tego nie udowodniono. W świetle powyższych uwag wyniki analizy ilościowej otrzymane przez Doktorantkę należy traktować jedynie jako orientacyjne, co najwyżej półilościowe, a przecież tytuł pracy, cel pracy i sposób komentowania otrzymanych wyników świadczą o traktowaniu tych wyników jako w pełni ilościowych. Stwierdzenie krzywe kalibracyjne cechowały się dużą liniowością (m.in. str. 102) Autorka błędnie udowadnia stosunkowo dużą wartością współczynnika determinacji (który, zresztą, błędnie nazywa współczynnikiem regresji). Zapewne zapomniała, że współczynnik regresji (czy determinacji) nie jest miarą liniowości wykresu kalibracyjnego, a jedynie stopnia rozrzutu punktów doświadczalnych względem tego wykresu. Najlepiej byłoby, gdyby Autorka po prostu przedstawiła na rysunku przykłady jednego lub dwóch wykresów kalibracyjnych, co dałoby najlepsze wyobrażenie o ich liniowości. Poza tym zakres kalibracyjny 2,5 7000 µg/ml (str. 102) jest zaskakująco szeroki; powstaje pytanie, czy był on objęty pojedynczym liniowym wykresem, czy kilkoma o różnych stopniach nachylenia. Autorka, co bardzo przykre, zbyt często posługuje się nieprawidłowym językiem analitycznym. I tak, nagminnie pisze o zatężaniu substancji (np. w tytule rozdziału 3.1 i wielu innych miejscach), gdy tymczasem zatężanie, jako proces odwrotny do rozcieńczania, odnosi się do roztworów (np. próbek). W tytule rozdziału 3.3 (i w innych miejscach) używa zwrotu analiza substancji halucynogennych, gdy tymczasem anality identyfikuje się lub oznacza, a nie analizuje. Gdzie indziej pisze o oznaczaniu ilości analitu (m.in. str. 105), podczas gdy pojęcie oznaczanie w języku analitycznym odnosi się bezpośrednio do analitu. Na str. 105 stwierdza, że anality oznaczono w sposób jakościowy, zapominając, że oznaczenie wiąże się tylko z analizą 4
ilościową. Poza tym, niejednoznacznie stosuje terminy oznaczenie i identyfikacja sprawiając wrażenie, jakby różnica między tymi dwoma pojęciami była nieistotna (np. na str. 102 pisze o identyfikacji tryptofanu w każdym z grzybów, gdy tymczasem analit nie tylko zidentyfikowano, ale również oznaczono). Spośród zauważonych nieanalitycznych błędów językowych najbardziej razi mnie kilkukrotnie pojawiające się (m.in. już we Wprowadzeniu na str. 13) sformułowanie wydaje się być, które jest bezkrytycznie zaczerpnięte z języka angielskiego (i nagminnie stosowane w różnych innych opracowaniach naukowych, co jednak nie powinno usprawiedliwiać Doktorantki). Osobny zarzut stanowi brak wniosków wypływających ze wszystkich przeprowadzonych badań. Rozdział pt. Podsumowanie i wnioski zawiera niemal wyłącznie listę rezultatów badawczych uzyskanych w pracy, a za pewnego rodzaju konkluzję można uznać jedynie ostatnie zdanie tego rozdziału. Wnioski to zawsze ten fragment pracy naukowej, który w największym stopniu odkrywa osobistą, autorską ocenę uzyskanych wyników, a także znaczenia wykonanych badań i możliwości ich wykorzystania. Szkoda więc, że takiego osobistego odniesienia nie znalazłem w pracy Autorki. Pomimo tych uwag krytycznych uważam, że ze względu na szereg ważnych i wartościowych aspektów naukowych (wyżej wymienionych) rozprawa zasługuje na pozytywną ocenę. Świadczy ona o dużej pracowitości i samodzielności badawczej Autorki oraz o swobodzie poruszania się tak w sensie teoretycznym, jak i praktycznym w zagadnieniach mieszczących się w tematycznym zakresie pracy. Stwierdzam zatem, że rozprawa doktorska Pani mgr Katarzyny Zielińskiej spełnia wymagania stawiane pracom doktorskim (ustawa a dnia 14 marca 2003 r., Dz. Ustaw Nr 65, poz. 595) i stawiam wniosek o dopuszczenie Doktorantki do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Prof. dr hab. Paweł Kościelniak 5