Kwart. Ortop. 2011, 3, str. 223, ISSN 2083-8697 - - - - - WYBRANE ELEMENTY RÓWNOWAGI OKSYDACYJNO-REDUKCYJNEJ U PACJENTÓW Z CHOROBĄ ZWYRODNIENIOWĄ STAWÓW BIODROWYCH Część II WYBRANE ELEMENTY RÓWNOWAGI OKSYDACYJNO-REDUKCYJNEJ U PACJENTÓW OPEROWANYCH Z POWODU CHOROBY ZWYRODNIENIOWEJ STAWÓW SELECTED ELEMENTS OF OXIDATION-REDUCTION BALANCE IN PATIENTS WITH DEGENERATIVE DISEASE IN HIP JOINTS Part II SELECTED ELEMENTS OF OXIDATION-REDUCTION BALANCE IN PATIENTS OPERATED ON FOR DEGENERATIVE DISEASE OF HIP JOINTS Sławomir Goc 1, Jan Błaszczyk 2, Julita Ciećwierz 3, Edward Kowalczyk 3 1 Klinika Ortopedii; 2 Zakład Fizjologii Człowieka; 3 Zakład Farmakologii i Toksykologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. *Praca finansowana z środków własnych. Streszczenie: Autorzy przeanalizowali wybrane elementy równowagi oksydacyjno- redukcyjnej u 49 pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów biodrowych, poddanych operacji protezoplastyki całkowitej. Stwierdzili po zabiegu zmniejszenie wskaźników stanu zapalnego i redukcję równowagi oksydacyjno- redukcyjnej. Summary: The authors analyzed selected elements of oxidation-reduction equilibrium in 49 patients with osteoarthritis of the hip who underwent total arthroplasty. After surgery they found decrease in inflammation rates and reduction of oxidation-reduction equilibrium. Słowa kluczowe: Choroba zwyrodnieniowa stawów biodrowych, protezoplastyka całkowita Key words: Osteoarthritis of the hip, total arthroplasty Wstęp Dokonany niedawno przez Pelletiera i wsp. (1) przegląd wiedzy na temat patofizjologii choroby zwyrodnieniowej stawów podtrzymuje pogląd, że jest to choroba zapalna. Autorzy artykułu sugerują, że integralną rolę w degradacji chrząstki stawowej odgrywają cytokiny prozapalne. Trwają badania na modelach zwierzęcych i u ludzi nad agonistami tkanki chrzęstnej w rodzaju rekombinowanych ludzkich czynników wzrostu i terapią genową pobudzającą chondrocyty (2,3,4). Rozwijają się również metody ortopedyczne, w tym regeneracja chrząstki i technik odbudowy powierzchni stawowej za pomocą biomateriałów. 223
Kwart. Ortop. 2011, 3, str. 224, ISSN 2083-8697 - - - - - Znaczny postęp genetyki i biologii molekularnej przyczynił się między innymi do odkrywania coraz liczniejszych defektów kolagenu i poszukiwania nowych metod terapeutycznych. Niestety pomimo licznych prób, prowadzonych już zgodnie z zasadami EMB medycyna oparta na faktach (evidence based medicine), nie udało się jak dotychczas uzyskać skutecznego leku. Zaproponowano, by za parametr oceny odpowiedzi na leczenie preparatami modyfikującymi przebieg choroby uznawać odroczenie lub rezygnację z zabiegu całkowitej endoprotezo plastyki stawu (5). Niestety zróżnicowanie wskazań zależne od charakterystyki pacjenta, regionu, akceptacji zabiegu przez pacjenta i ryzyka, wiedzy i entuzjazmu lekarza oraz czynników ekonomicznych sprawia, że taki punkt końcowy podlegałby zbyt dużej zmienności i nie nadaje się do zastosowania w praktyce. Z drugiej strony sugeruje się, żeby zastępczo stosować takie parametry jak nasilenie bólu, ograniczenie ruchomości i stopień niepełnosprawności i na nich opierać wskazania do totalnej plastyki stawu, ponieważ są łatwiejsze do wystandaryzowania i do wykorzystania w praktyce. Biorąc pod uwagę ograniczone możliwości regeneracji chrząstki, leki modyfikujące przebieg choroby są prawdopodobnie skuteczniejsze w opóźnianiu postępu choroby lub jej zapobieganiu niż w usuwaniu już istniejących zmian chorobowych. Stąd wielu pacjentów po nieskutecznym leczeniu zachowawczym poddanych jest zabiegowi operacyjnemu. W materiale naszej Kliniki są zarówno pacjenci młodzi jak i starzy ze wskazaniami do operacji, u których odnotowano zwiększenie wskaźników wybranych biomarkerów stresu oksydacyjnego (Część I pracy) w stosunku do grupy odniesienia. Stres oksydacyjny towarzyszy chorobie zwyrodnieniowej stawów biodrowych. Rodzi się pytanie czy parametry stresu oksydacyjnego będą również podwyższone po zabiegu wymiany stawu biodrowego czyli po usunięciu potencjalnego źródła zapalenia. Cel pracy Celem pracy jest ocena wybranych parametrów równowagi oksydacyjno-redukcyjnej u pacjentów operowanych z powodu choroby zwyrodnieniowej stawów. Materiał i metody Badania przeprowadzono u 49 pacjentów zakwalifikowanych do zabiegu operacyjnego - endoprotezoplastyki stawu biodrowego. Wyniki badań podzielono dla trzech momentów czasu, dzień przed zabiegiem, po 10 dniach i po 6 tygodniach od zabiegu tworząc nierównomierny szereg czasowy, określonych w celu pracy, liczbowych wyników parametrów równowagi oksydacyjno-redukcyjnej. Wyniki laboratoryjnej analizy dotyczyły tych samych pacjentów co umożliwia stosowanie sparowanych testów statystycznych dla badanych cech w kolejnych momentach czasu od zabiegu. Dzień przed zabiegiem operacyjnym, 10 dni i 6 tygodni po zabiegu pobierano krew z żyły łokciowej na podstawowe badania laboratoryjne oraz na analizę wybranych parametrów oksydacyjno-redukcyjnych. Krew do badania wybranych elementów równowagi oksydacyjno-redukcyjnej wirowano w temp. +4º C z przyspieszeniem 1400 x G. Zbierano osocze, a masę krwiakową przemywano 3-krotnie roztworem 150 nanomolowym NaCl. Przemyte krwinki hemolizowano dodając 4-krotną objętość wody destylowanej roztwór dwukrotnie zamrożono i rozmrożono. Błony krwinek czerwonych usuwano odwirowując roztwór. 224
Kwart. Ortop. 2011, 3, str. 225, ISSN 2083-8697 - - - - - W hemolizatach krwinek czerwonych oznaczono: aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) metodą Misra i Fridovicha [6] aktywność peroksydazy glutationowej (GPx) metodą Sedlaka ilindsay [7] w modyfikacji Littlea i O Briena [8] aktywność katalazy metodą Bersa i Sizera [9] stężenie związków regujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS) metodą Rice-Evans i wsp.[10] W osoczu krwi oznaczono: stężenie związków regulujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS) metodą Rice-Evans i wsp. [10] zawartość grup tiulowych białek za pomocą odczynnika Ellmana według Rice- Evans i wsp. [10]. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Lokalnej Komisji Bioetycznej. Zebrany i uporządkowany materiał badawczy został numerycznie zapisany w formie tabel programu Excel. Omówienie wyników Zgrupowane typologicznie liczbowe wyniki badań laboratoryjnych pozwoliły na wszechstronną analizę w celu wykrycia ewentualnych prawidłowości rządzących badanym zjawiskiem. Liczebność badanych jak i systematyka badań upoważniają do traktowania zastosowanej analizy wybranych cech jako badań dla grup jakościowo jednorodnych. Wartości średnie analizowanych wskaźników aktywności dysmutazy ponadtlenkowej w hemolizie krwinek czerwonych dla kolejnych grup odpowiadających przyjętych w badaniach czasookresom przedstawiono na rys.1. Widoczna jest wyraźna tendencja obniżania się wartości średniej (względnej) o 12,9% po 10 dniach i 6,4% po 6 tygodniach. Skupienie wyników względem wartości średniej maleje wraz z czasem po zabiegu (wartości kurtozy odpowiednio = +0,245, = -0,410, = -1,331). Analizując wartości średnie, parametru aktywności peroksydazy glutationowej w hemolizie krwinek czerwonych, dla kolejnych okresów pooperacyjnych zauważyć trzeba wzrost wartości w 10 dniu po zabiegu (względna wartość przyrostu 27,7%). Pomiar ten charakteryzuje się także leptokurtycznością wyników (skupienie wyników bardziej skoncentrowana niż przy rozkładzie normalnym; wartość kurtozy wynosi +1,650, w porównaniu zarówno do okresu przed jak i pooperacyjnego). 225 3108,1 3320,5 3812,5 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 SOD Rysunek 1. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) w hemolizie krwinek czerwonych. Wartości średnie dla poszczególnych grup.
Kwart. Ortop. 2011, 3, str. 226, ISSN 2083-8697 - - - - - Wykonane testy t średnich dla kolejnych okresów Gr. 1 i Gr. 2 oraz Gr. 2 i Gr. 3 wykazały, że dla przyjętego p<0,05 wyniki z grup pochodzą z populacji o różnych średnich. Grupa 3 Grupa 2 Grupa 1 35,95 36,28 226 40,91 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 GSH-Px Rysunek 2. Aktywność peroksydazy glutationowej GSH-Px w hemolizie krwinek czerwonych. Wartości średnie dla poszczególnych grup. Aktywność katalazy rys. 3 wykazuje 13% skok wartości średniej (względnej) dla grupy badanej po 10 dniach od zabiegu. W następnym okresie 6 tygodni wartości tej cechy powracają do zbliżonych wartości średniej w dniu zabiegu. Analiza istotności różnic pomiędzy średnimi nie wykazała jednoznaczności w ich rozróżnieniu. 21,23 21,94 19,5 20 20,5 21 21,5 22 22,5 23 23,5 24 24,5 Rysunek 3. Aktywność katalazy (CAT) w hemolizie krwinek czerwonych. Wartości średnie dla badanych grup. Stężenie związków reagujących z kwasem triobarbiturowym w hemolizie krwinek czerwonych jak i osoczu krwi wykazują podobne tendencje zmian w analizowanych okresach czasu Rys. 4 i Rys.5.Wartości średnie w 10 dniu po zabiegu wzrastają, a w następnym okresie maleją. Różnica spadku względnej wartości średniej dla Gr. 1 i Gr. 3 wynosi 26,7% w przypadku wyników hemolizy krwinek czerwonych i 11,9% dla osocza krwi. Testy różnic średnich nie wykazują różnic znaczących statystycznie na przyjętym w badaniach poziomie istotności. 24
Kwart. Ortop. 2011, 3, str. 227, ISSN 2083-8697 - - - - - 227 0,1712 0,2383 0,2328 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Rysunek 4. Stężenie związków reagujących z kwasem triobarbiturowym w hemolizie krwinek czerwonych. 0,484471429 0,544892857 0,611914286 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Rysunek 5. Stężenie związków reagujących z kwasem triobarbiturowym w osoczu krwi. Wartości średnie dla poszczególnych grup. Stężenie grup tiolowych białek (-SH) w osoczu krwi wykazuje spadek wartości średniej w okresie pierwszych 10 dni po zabiegu a w późniejszym analizowanym okresie 6 tygodni wartość ta rośnie o 24,1% w stosunku do wartości w dniu zabiegu. Wykonane testy różnic średnich dla badanych grup wykazują różnice istotnie statystycznie na obranym poziomie istotności p<0.05 dla Gr. 1 i Gr. 3. 3,086428571 3,65 4,526428571 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 Rysunek 6. Stężenie grup tiulowych białek m(-sh) w osoczu krwi.
Kwart. Ortop. 2011, 3, str. 228, ISSN 2083-8697 - - - - - Dyskusja W badaniach własnych dokonywano całkowitej alloplastyki stawu biodrowego, która jest skuteczną metodą leczenia ograniczającą ból i poprawiającą sprawność. Jej wykorzystanie należy brać pod uwagę u pacjentów ze zwyrodnieniową chorobą stawów powodującą przewlekły ból i znaczną niesprawność ruchową. Optymalny moment na przeprowadzenie wymiany stawu biodrowego nie jest ustalony. Choć wykonanie zabiegu na ogół odkłada się aż do zaawansowanego stadium choroby, dane kohortowe badania prospektywnego wykazały, że pacjenci o większej sprawności ruchowej przed operacją mieli wyższe prawdopodobieństwo niezależnego funkcjonowania dwa lata po zabiegu niż chorzy, którzy byli mniej sprawni przed zabiegiem. Odkrycia te wskazują, że przeprowadzenie zabiegu wcześniej, nim w przebiegu choroby dojdzie do znacznego upośledzenia sprawności, może być korzystniejsze (11). Zauważono, że stężenie związków reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS) w osoczu krwi i hemolizacie krwinek czerwonych zwłaszcza po 6 tygodniach od zabiegu operacyjnego było istotnie mniejsze niż w grupie odniesienia. Stężenie TBARS jest powszechnie przyjętym markerem peroksydacji lipidów, ze względu na to, że głównym składnikiem związków reagujących z kwasem tiobarbiturowym jest dialdehyd malonowy (MDA), podstawowy wskaźnik peroksydacji lipidów (12,13), ale obserwowane przez nas w osoczu krwi zmniejszenie wartości grup tiolowych białek w dziesiątym dniu po zabiegu może sugerować również wzrost utleniania białek w tym okresie. Obniżenie stężenia TBARS w hemolizacie krwinek czerwonych mogło być związana z aktywnością katalazy (CAT), której wartości po 6 tygodniach od zabiegu były najwyższe (chociaż różnice nie były znamienne statystycznie pomiędzy badanymi przedziałami czasowymi). Katalaza obok peroksydazy glutationowej rozkłada nadtlenek wodoru ale w przeciwieństwie do peroksydazy jej aktywność jest największa przy dużych stężeniach nadtlenku wodoru (12). Zapewne źródłem dużego stężenia nadtlenku wodoru tuż po zabiegu była duża aktywność dysmutazy ponadtlenkowej, która katalizuje reakcję dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego do nadtlenku wodoru. Co prawda w naszych badaniach aktywność SOD stopniowa obniżała się od czasu zabiegu operacyjnego i była najmniejsza po 6 tygodniach od zabiegu ale nie dokonywaliśmy oznaczeń we wcześniejszych przedziałach czasowych. Można domniemywać, że aktywność tego enzymu była najwyższa tuż po zabiegu a z chwilą wygenerowania dużych ilości nadtlenku wodoru uległa zmniejszeniu pod wpływem produktów katalizowanej przez nią reakcji. W analizowanych przedziałach czasowych aktywność peroksydazy glutationowej ulegała natomiast stopniowemu obniżeniu. Szkopuł w tym, że stan zapalny jest nie tylko oznaką uszkodzenia, ale też koniecznym etapem gojenia (14). Czy chorą tkanką jest więzadło, ścięgno, czy mięsień, organizm reaguje na uszkodzenie sekwencją zdarzeń, która rozpoczyna się od napływu krwi i komórek zapalnych. W miejscu uszkodzenia komórki zapalne usuwają resztki tkankowe i uwalniają cytokiny i inne czynniki wzrostu. Faza zapalna jest w dużej części zależna od samych prostaglandyn. W naturalnym procesie gojenia po fazie zapalnej następuje faza proliferacyjna, w której uczestniczy mieszanina komórek zapalnych i fibroblastów. Fibroblasty tworzą nową macierz zewnątrzkomórkową i rolę tę spełniają aż do końca fazy procesu naprawczego- fazy dojrzewania, kiedy to, jeśli wszytko idzie pomyślnie, powstaje funkcjonalna tkanka. W naszych badaniach zabieg operacyjny miał wpływ na wybrane biomarkery stresu oksydacyjnego. 228
Kwart. Ortop. 2011, 3, str. 229, ISSN 2083-8697 - - - - - Po 6 tygodniach od zabiegu operacyjnego większość analizowanych przez nas parametrów równowagi oksydacyjno-redukcyjnej zdecydowanie były mniejsze niż przed zabiegiem co może sugerować, że została usunięta przyczyna stresu oksydacyjnego. Czy zmiany te mają korzystny wpływ na stan układu kostnostawowego wyjaśnią być może nasze dalsze badania. Podsumowanie Alloplastyka stawów biodrowych prowadzi do zmniejszenia wskaźników stanu zapalnego i przesunięcia równowagi oksydacyjno-redukcyjnej w kierunku redukcji. Piśmiennictwo 1. Pelletier JP, Martel-Pelletier J., Abramson SB: Osteoarthritis, an inflammatory disease: potential implication for the selection of how therapeutic targets. Arthritis Rheum 2001;44: 1237-1247. 2. Dougados M., Nguyen M., Berdah L., et al. Effestsof diacerin on the radiological progression of hip osteoarthritis: a three-year placebo-controlled study. Abstract. Arthritis Rheum 2000; 43: S336-1619 3. Caldwell JR., Offenberg HL., Ramanatham-Girish S., Yoshizawa C., Seely L. A safety, tolerability and pharmaco-kinetic study of intra-articular recombinant human insulin-like growth factor I (rhigf-1) in patients with severe osteoarthritis (OA) of the knee. Abstract Arthritis Rheum. 2000,43: S 223-941 4. Torrance G.W., Raynauld J.P., Walker V., Goldsmith C.H., Bellamy N.A., Band P.A., Schultz M., Tugwell P.: A prospective, randomized, pragmatic, health outcomes trial evaluating the incorporation of Hylan G-F 20 into the treatment paradigm for patients with knee osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2002,10:506-17. 5. Maillefert JF., Dougados M: Is time to joint replacement a valid outcome measure in clinical trials of drugs for osteoarthritis? Rheum Dis Clin North Am 2003,29: 831-845 6. Misra HP., Fridovich J.: The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a simple assay superoxide dismutase. J. Biol. Chem. 1972;247:3170-5. 7. Sedlak J.,Lindsay RH., Estimation of total proteinbound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman s reagent. Anal. Biochem.1968; 25: 192-205. 8. Little C., O Brien P.: An intracellular GSH peroxidase with a lipid peroxide substrate. Biochem. Biphys. Res. Commun. 1968, 31: 145-150. 9. Beers RF Jr., Sizer IW.: A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J. Biol. Chem. 1952;195:133-140. 10. Rice Evans CA., Diplock AT., Symons MCR.: Techniques in free radicals research. Ed Burdon RH., Knippenberg PH., Elsevier, Amsterdam, London, New York, Tokyo 1991. 11. Fortin PR, Penrod JR., Clarke AE.: Timing of total joint replacement affects clinical outcomes among patients with osteoarthritis of the hip or knee. Arthritis Rheum.2002, 463327-30 229
Kwart. Ortop. 2011, 3, str. 230, ISSN 2083-8697 - - - - - 12. De Zwart LL., Meerman JHN., Commandeur JN., Vermeulen NP.: Biomarkers of free radical damage applications in experimental animals and in humans. Free Radic. Biol. Med. 1999;26;202-226 13. Bartosz G.: Druga twarz tlenu. PWN Warszawa.2003 14. Leadbetter W.B. Anti inflammatory therapy in sports injury: the role of nonsteroidal drugs and corticosteroid injections. Clin. Sport. Med. 1995; 14(2):353-410. 230 Adres do korespondencji: Sławomir Goc Katedra Ortopedii, Traumatologii i Rehabilitacji Pourazowej Uniwersytecki Szpital Kliniczny im. WAM Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Centralny Szpital Weteranów Żeromskiego 113, 90-549 Łódź e.mail:slawmoir.goc@umed.lodz.pl