Diagnostyka zakażeo w OIT Waleria Hryniewicz Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej Narodowy Instytut Leków, Warszawa
Zakażenia wywoływane są przez: Wirusy Bakterie Grzyby Pasożyty (zarażenia)
Rutynowym zadaniem diagnostyki mikrobiologicznej jest ustalanie : etiologii zakażenia wrażliwości na antybiotyki, prowadzenie regularnej analizy wyników celem dostarczania danych dla terapii empirycznej oraz nadzorowania sytuacji epidemiologicznej w szpitalu
Szybkie ustalenie etiologii oraz antybiotykowrażliwości (bakterie, grzyby) jest szczególnie ważne w sytuacji pacjentów krytycznie chorych (OIT) Opornośd na antybiotyki szczególnie wysoka u patogenów szpitalnych
Najgroźniejsze zakażenia leczone na OIT Pozaszpitalne : zapalenie płuc, zapalenie opon mózgowordzeniowych, bakteriemia/sepsa Szpitalne: zapalenie płuc (respiratorowe), sepsa
Zakażenia pozaszpitalne w OIT drogi oddechowe 148 73 73 97 121 192 976 przewód pokarmowy,w tym otrzewna układ moczowy pierwotne zakażenie krwi skóra i tkanki miękkie OUN Inne Alberti C: Intensive Care Med 2002; 28:108 121
Zakażenia pozaszpitalne leczone na OIT Etiologia zapaleo płuc Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus (CA-MRSA), wirus grypy Etiologia zapaleo opon mózgowo-rdzeniowych ( >1m-ca ż) Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis Etiologia bakteriemii/sepsy - Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli
Pozaszpitalne zakażenia krwi w OIT 5 pierwszych miejsc Klebsiella pneumoniae 11 13 46 55 86 Neisseria menigitidis Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Escherichia coli Valles J., Alvarez-Lerma F., Palomar M: Health-care-Associated Bloodstream Infections at Admission to the ICU, 2011;139:815-20 8
Zakażenia szpitalne - OIT Zapalenie płuc pałeczki Gram-ujemne, Staphylococcus aureus Zapalenie płuc respiratorowe Gram-ujemne pałeczki niefermentujące Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp Bakteriemia/sepsa Staphylococcus aureus (odcewnikowe), Enterococcus spp,
POCT w OIT Ocena makroskopowa materiału Preparat bezpośredni!!! Immunodiagnostyka Diagnostyka molekularna Uwaga: Posiew materiału i oznaczenie lekowrażliwości (bakterie, grzyby) pozostaje złotym standardem.
Zapalenie płuc Klebsiella pneumoniae plwocina galaretka porzeczkowa
Badanie mikroskopowe Mikroskop świetlny Preparaty barwione metoda Grama metody specjalne np. barwienie na obecnośd zarodników Laseczka tężca Clostridium tetani, zarodniki na koocu komórki bakteryjnej nadające kształt pałeczki dobosza
Badanie mikroskopowe Neisseria meningitidis Preparat z osadu płynu mózgowordzeniowego barwiony metodą Grama Cryptococcus neoformans Preparat tuszowy z osadu płynu mózgowordzeniowego
Neisseria meningitidis
Streptococcus pneumoniae - preparat z plwociny
Szybkie testy immunoenzymatyczne Wykrywanie antygenów wirusowych lub bakteryjnych bezpośrednio w materiale pobranym od chorego (np. wymaz z gardła, mocz) wybór odpowiedniej terapii Czas wykonania kilka minut
Diagnostyka meningitis Testy lateksowe wykrywające antygeny drobnoustrojów w płynie mózgowo-rdzeniowym, surowicy i moczu Neisseria meningitidis A,C, Y/W135 Neisseria meningitidis B/E.coli k1 Haemophilus influenzae b Streptococcus pneumoniae Streptococcus agalactiae wykrywanie antygenów krążących w surowicy i płynach ustrojowych!!! (Cryptococcus neoformans)
Bakteryjne zakażenia dolnych dróg oddechowych - szybkie testy diagnostyczne materiał pobierany nieinwazyjnie Testy immunochromatograficzne (IC) Binax NOW Legionella Urinary Antigen Test (materiał biologiczny MOCZ; nie należy stosowad do innych materiałów takich jak plwocina, popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe, krew, materiały środowiskowe) Binax NOW Streptococcus pneumoniae Antigen Test (materiały biologiczne: mocz zakażenie ddo i płyn mózgowo-rdzeniowy zakażenie OUN) Warunki przechowywania testów 15-30ºC (!!!) Antygeny w moczu mogą byd wykrywane w trakcie antybiotykoterapii lub po jej zakooczeniu Postępowanie z materiałem klinicznym: Mocz pobrad standardowo do pojemnika (nie musi byd jałowy) Test do 24 godz. temp. 15-30ºC, do 14 dni 2-8 ºC, powyżej 14 dni zamrożenie (-10)-(-20) ºC MOCZ Czułość - 86% Specyficzność - 94% PMR Czułość - 97% Specyficzność - 99%
Wykrywanie antygenów wirusowych Metody immunochromatograficzne IC (testy paskowe) Szybkie testy 15-30 min. Głównie wirus grypy i syncytialny wirus oddechowy (RSV) Łatwe do wykonania Praktyczne zastosowanie zwłaszcza w POZ, gabinetach lekarzy rodzinnych Czułośd i swoistośd testów dla wirusów A i B 65% i 100% (Ghebremedhin i wsp. JCM. 2009, 58: 365-370) Czułośd i swoistośd testów dla RSV - 90% i 94-100% (Selvarangan i wsp. DMID. 2008, 62: 157-161) Szybkie testy paskowe do diagnostyki zakażenia górnych i dolnych dróg oddechowych wywołanych przez adenowirusy swoistośd 91-100%, czułośd relatywnie niska (54,5-95%) (Levent i wsp. JCV. 2009, 44: 173-175)
Diagnostyka molekularna Wykrywanie czynnika etiologicznego zakażenia bezpośrednio w materiale klinicznym Drobnoustroje typowe np. wykrywanie S. pneumoniae we krwi zapalenie płuc z bakteriemią Drobnoustroje atypowe Mechanizmy oporności na antybiotyki Wykrywanie nosicielstwa np. pałeczek jelitowych wytwarzajacych karbapenemazy Badania epidemiologiczne
Wykrywanie antygenów wirusowych Metody biologii molekularnej metody wykorzystujące amplifikację kwasów nukleinowych NAT (nucleic acid technology) RT-PCR (Real-Time PCR) NASBA metoda oznaczania ilości transkryptu na podstawie sekwencji kwasu nukleinowego Multiplex real-time PCR jednoczesna diagnostyka kilku/kilkunastu wirusów + bakterii atypowych w wydzielinie z nosogardła Połączenia multiplex RT-PCR z nowymi technikami wykorzystującymi mikromacierze i mikrokulki (bead detection formats) Zakażenie ddo ludzkim metapneumowirusem (hmpv) wynik dodatni 33% hodowli, 100% RT-PCR (Ebihar i wsp., JCM., 2004, 42:126-134) (RT-PCR - najbardziej czuła i specyficzna metoda) Potwierdzenie etiologii rhinowirusowej u dzieci z zapaleniem oskrzelików met. molekularne 21,2%, met. hodowlana 2,2% (Paranhos-Baccala i wsp., JCV. 2008: 40(1): S11-S14)
Hodowla i identyfikacja
Hodowla i identyfikacja drobnoustrojów
Hodowla i wstępna identyfikacja drobnoustrojów CPS Podłoża wybiórcze, wybórczo-różnicujące chromogenne i specjalne MacConkey agar S. agalactiae C. perfringens
Systemy automatyczne Systemy automatyczne stosowane są do hodowli drobnoustrojów (np. Bactec, Bact/ALERT, do posiewów krwi) lub do identyfikacji i oznaczenia lekowrażliwości wyhodowanych wcześniej na podłożach stałych drobnoustrojów VITEK 2 Compact BioMerieux Phoenix BD Diagnostic Systems
Spektrometria MALDI-TOF
Automatyzacja Automatyzacja pracy w laboratorium zapewnia: Zwiększenie liczby wykonywanych badao wpływ na wydajnośd pracy Unikanie błędów związanych z manualnym wykonaniem badao Zwiększenie bezpieczeostwa pracy pracowników laboratorium ograniczenie styczności z czynnikami zakaźnymi Zapewnienie jakości wykonywanych badao poprzez: Standaryzację wykonania oznaczeo Powtarzalnośd Spójnośd pomiarową Automatyzacja może obejmowad: określony etap badania (np. posiew na podłoża, etap identyfikacji i/lub oznaczenia lekowrażliwości) kilka etapów badania
Metody molekularne Stosowane głównie metody oparte o reakcje PCR lub realtime PCR Dostępne różne gotowe testy komercyjne w dwóch wariantach Zestaw odczynników do wykrywania bakterii, reakcja w dowolnym aparacie do PCR lub real-time PCR Zestawy odczynników lub zamknięte systemy diagnostyczne przeznaczone do użycia w aparacie określonej firmy Testy zarówno do wykrycia bakterii np. M.tuberculosis jak i identyfikacji ważnych epidemiologicznie bakterii np. MRSA lub wykrycia toksyn bakteryjnych
Oznaczanie lekowrażliwości Oznaczanie mechanizmów oporności na antybiotyki
Patogeny alarmowe ze względu na mechanizmy oporności Gram-dodatnie Staphylococcus aureus oporny na meticylinę (MRSA) Staphylococcus aureus oporny na glikopeptydy (GRSA) Streptococcus pneumoniae oporny na penicylinę i iniekcyjne cefalosporyny III gen.(prp) Enterococcus spp oporny na wankomycynę (VRE)
Patogeny alarmowe ze względu na mechanizmy oporności Gram-ujemne Pałeczki Enterobacteriaceae wytwarzające betalaktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) Pałeczki Enterobacteriaceae oporne na karbapenemy Pałeczki Pseudomonas aeruginosa oporne na karbapenemy Pałeczki Acinetobacter spp. oporne na karbapenemy
Szybkie oznaczenie lekowrażliwości ANTYBIOGRAM: Ma na celu poznanie profilu wrażliwości badanego szczepu bakterii na antybiotyki: zakwalifikowanie szczepu do kategorii wrażliwości (wrażliwy, średniowrażliwy, oporny) wykrycie mechanizmów oporności Umożliwia zmianę leczenia empirycznego na leczenie celowane Terapia deeskalacyjna Zaprzestanie stosowania terapii skojarzonej Umożliwia stwierdzenie zmiany profilu lekowrażliwości drobnoustroju w trakcie leczenia Dostarcza danych do śledzenia trendów lekooporności w szpitalach i w środowisku pozaszpitalnym monitorowania lekowrażliwości
Oznaczenie lekowrażliwości drobnoustrojów Oznaczanie metodą rozcieoczeniową Gotowe testy diagnostyczne do odczytu manualnego Oznaczanie za pomocą systemów automatycznych
Oznaczanie MIC penicyliny (PG) i cefotaksymu (CT) dla Streptococcus pneumoniae metodą dyfuzji z paska nasączonego gradientem antybiotyku MIC penicyliny (PG) = 0,38 mg/l MIC cefotaksymu (CT) = 0,19 mg/l
Etest Amfoterycyna B(0,002-32 mg/l) Flucytozyna (0,002-32 mg/l) Ketokonazol (0,002-32 mg/l) Itrakonazol (0,002-32 mg/l) Flukonazol (0,016-256,0 mg/l) Worykonazol (0,002-32 mg/l) Pozakonazol (0,002-32 mg/l) Kaspofungina (0,002-32 mg/l) Anidulafungina (0,002-32 mg/l)
Oznaczanie mechanizmów oporności na antybiotyki podłoża chromogenne MRSA ESBL VRE
Systemy automatyczne do oznaczanie lekowrażliwości Systemy automatyczne Inkubacja, odczyt, interpretacja i generacja raportu w ramach systemu Systemy pół-automatyczne Inkubacja poza systemem, odczyt, interpretacja i generacja raportu w ramach systemu Interpretacja wyników oznaczeo z zastosowaniem programów kontroli jakości i programów eksperckich, uwzględniających obowiązujące rekomendacje dotyczące interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości Większośd systemów automatycznych ma możliwośd podłączenia do laboratoryjnych sieci informatycznych
Oznaczanie lekowrażliwosci drobnoustrojów - metody Oznaczanie MIC Gotowe testy diagnostyczne do odczytu manualnego lub automatycznego Oznaczanie w systemach automatycznych (najczęściej stężenia w zakresie wartości granicznych) Oznaczanie z użyciem pasków z gradientem antybiotyku
Czy można szybciej? Antybiogram Oznaczanie lekowrażliwości bakterii z zastosowaniem próbki pobranej bezpośrednio z dodatniej butelki z posiewem krwi lub próbki moczu metodą dyfuzyjno-krążkową i metodą z paska z gradientem antybiotyku z zastosowanie Merlin MICRONAUT System z zastosowaniem systemu VITEK z zastosowaniem systemu Phoenix Skrócenie czasu badania o 18-24 godz. (otrzymanie przybliżonego wyniku antybiogramu) ALE UWAGA! Wszystkie wymienione oznaczenia mogą byd zastosowane jako badanie wstępne, zawsze należy wykonad oznaczenie lekowrażliwości dla czystej hodowli
Czy można szybciej? Wykrycie mechanizmów oporności Szybkie testy Szybkie testy lateksowe np. wykrywanie produktu genu meca białka PBP2 u S.aureus Szybkie testy kolorymetryczne test β LACTA TM do wykrywania oporności na trzecią generację cefalosporyn u pałeczek Enterobacteriaceae; test NP do wykrywania karbapenemaz u pałeczek Gram-ujemnych Test NP Roztwór A Roztwór A + imipenem K KPC+ MBL+
Wykrywanie genów oporności na antybiotyki - metoda PCR Zastosowanie do wykrywania opisanych genów oporności na antybiotyki: karbapenemaz KPC, NDM, OXA-48, genów oporności na wankomycynę vana, vanb, genów oporności na metycyline meca, mecc Izolacja DNA reakcja PCR elektroforeza
Wykrywanie genów oporności na antybiotyki - mikromacierze Zastosowanie np. testy wykrywające geny oporności na antybiotyki β-laktamowe: karbapenemazy, ESBL, AmpC firmy Check-Points np. Check-MDR 103 Hodowla Izolacja DNA przyłączanie i ligacja starterów rozpoznawanie idealnie pasujących sekwencji amplifikacja hybrydyzacja do mikromacierzy detekcja i odczyt kolorymetryczny; czas wykonania 6-7 godz.
Real-time PCR System GeneXpert Cepheid Dostępne zestawy do diagnostyki czynników etiologicznych zakażeo: szpitalnych: C. difficile, MRSA, VRE, CPE w układzie oddechowym: prątek gruźlicy, wirus grypy w układzie nerwowym: enterowirusy w układzie moczowo-płciowym: wirus HPV, Chlamydia trachomatis, GBS Przykład: Testy typu Xpert MRSA Wykrywanie MRSA w próbce wymazu z rany, w próbce z dodatniej butelki z posiewem krwi, w próbce wymazu z nosa; czas wykonania 60-90 minut
Antygen JF5: LFD mannoproteiny uwalniane przez rosnące strzępki Aspergillus nie są uwalniane przez konidia wykrywalne w surowicy i w BAL na kilka dni przed objawami klinicznymi oznaczanie metodą immunochromatograficzną typu lateral flow (LFD) przy użyciu monoklonalnego przeciwciała JF5 skoniugowanego z cząstkami złota (Aspergillus LFD, OLM Diagnostics) wynik jest widoczny w postaci barwnego paska procedura trwa 10 minut test ma być dostępny w Polsce w Q4 2014
Antygen JF5: LFD cd.
Antygen JF5: LFD cd. 1. Thornton CR. Current Fungal Infection Reports 2013, published online. DOI:10.1007/s12281-013-0138-x. 2. Thornton CR. Clinical and Vaccine Immunology 2008, 15: 1095-1105. 3. Thornton CR, Johnson G, Agrawal S. Journal of Visualized Experiments 2012, 61: e3721. 4. Hoenigl WM et al.journal of Infection 2012, 65: 588-591. 5. White PL et al. Journal of Clinical Microbiology 2013, 51: 1510-1516. 6. Held J et al. Infection 2013, published online. DOI: 10.1007/s15010-013-0472-5.
Szybka identyfikacja czynnika etiologicznego (1) Wykrycie i identyfikacja czynnika etiologicznego bezpośrednio w próbce pobranej od pacjenta Identyfikacja drobnoustroju w pierwotnej hodowli materiału pobranego od pacjenta: dodatnie posiewy krwi hodowla na podłożach mikrobiologicznych
Szybka identyfikacja czynnika etiologicznego w próbce pobranej od pacjenta (2) Szybkie testy immunoenzymatyczne chromogenne Metody molekularne Real-time PCR Technika hybrydyzacji DNA Metody mikroskopowe: Mikroskop fluorescencyjny immunofluorescencja
Szybka identyfikacja czynnika etiologicznego w pierwotnej hodowli materiału pobranego od pacjenta (3) Hodowla na podłożach chromogennych Spektrometria masowa Metody molekularne: Technika FISH i PNA-FISH PCR Mikromacierze (metoda hybrydyzacji) Szybkie testy immunoenzymatyczne, lateksowe
Teraźniejszośd : Tok badania mikrobiologicznego - posiew Pobranie materiału od pacjenta czas 0 Preparat mikroskopowy z materiału czas 1-2 godz. Hodowla na podłożach bakteriologicznych czas 18-24 godz. Bogate podłoża hodowlane Podłoża wybiórcze i wybiórczo-różnicujące Izolacja podejrzanych kolonii czas 36-48 godz. Identyfikacja czas 40-72 godz. Metody manualne (np. preparat mikroskopowy, katalaza, testy lateksowe) Identyfikacja biochemiczna (systemy manualne i automatyczne) Oznaczenie lekowrażliwości Metoda dyfuzyjno-krążkowa Paski z gradientem antybiotyku Metody automatyczne czas 40-72 godz.
Niedaleka przyszłośd: Tok badania mikrobiologicznego Pobranie materiału od pacjenta czas 0 Wykrycie czynnika etiologicznego kilka minut - 2 godz. Hodowla na podłożach bakteriologicznych 18-24 godz. Podłoża chromogenne mechanizm oporności Identyfikacja 20 24 godz. MALDI-TOF Metody molekularne Szybkie testy immunoenzymatyczne i kolorymetryczne Oznaczenie lekowrażliwości, mechanizmów oporności Metoda dyfuzyjno-krążkowa Metody automatyczne np. Phoenix, VITEK MALDI-TOF Metody molekularne 20-30 godz. W przypadku konieczności izolacji wydłużenie czasu analizy o 18 godz. Możliwe skrócenie czasu potrzebnego do otrzymania wyniku badania mikrobiologicznego (identyfikacja + antybiogram) o 24 godz.
Podsumowanie W nowoczesnej diagnostyce mikrobiologicznej obserwuje się następujące trendy: Automatyzacja procesu diagnostycznego Stosowanie metod umożliwiających: Szybkie wykrycie i identyfikację czynnika etiologicznego zakażenia Oznaczenie lekowrażliwości w możliwie najkrótszym czasie Integracja różnych systemów i aparatury stosowanej w laboratorium za pomocą systemu informatycznego Wykorzystanie systemów eksperckich umożliwiających szybką i prawidłowa interpretacje wyniku badania mikrobiologicznego Rozbudowa systemów informatycznych, włączenie systemu informatycznego laboratorium mikrobiologicznego do systemu informatycznego szpitala
Dziękuję za uwagę