Analiza genetyczna form pszenżyta ozimego (X Triticosecale Witt.) z introgresją chromatyny Aegilops spp.

Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk Michał Kwiatek Analiza genetyczna form pszenżyta ozimego (X Triticosecale Witt.) z introgresją chromatyny Aegilops spp. AUTOREFERAT Praca doktorska wykonana pod kierunkiem dr hab. Haliny Wiśniewskiej, prof. IGR PAN Poznań, 2013

1. Streszczenie Pszenżyto (X Triticosecale Witt.) jako rodzaj całkowicie syntetyczny posiada wąski zakres zmienności genetycznej z racji braku przejścia procesu ewolucji. Krzyżowania międzygatunkowe i międzyrodzajowe dają możliwość wytworzenia nowych genotypów pszenżyta ze znacznie korzystniejszymi cechami w porównaniu do form wyjściowych, tym bardziej, że w ostatnim czasie nastąpiło drastyczne załamanie odporności pszenżyta na rdzę brunatną powodowaną przez Puccinia triticiana, mączniaka prawdziwego powodowanego przez Blumeria graminis, fuzariozę powodowaną przez Fusarium spp. oraz łamliwość źdźbła powodowaną przez Oculimacula yallundae i O. acuformis. Dzikie gatunki kozieńców, należące do rodzaju Aegilops, są blisko spokrewnione z pszenicą należącą do rodzaju Triticum oraz z pszenżytem. Posiadają bardzo dużą zmienność genetyczną, dlatego też stanowią źródło ważnych agronomicznie cech, które mogą być wykorzystane w procesach hodowlanych, mających na celu ulepszanie pszenicy i pszenżyta uprawnego. Materiałem użytym w badaniach były cztery gatunki poliploidalne kozieńców [Aegilops biuncialis (UUMM, 2n=4x=28), Aegilops ovata (UUMM, 2n=4x=28), Aegilops kotschyi (UUSS, 2n=4x=28), Aegilops variabilis (UUSS, 2n=4x=28)] oraz jeden gatunek diploidalny Aegilops squarrosa (Triticum tauschii, DD, 2n=2x=14), a także formy amfiploidalne Aegilops spp. Secale cereale oraz kolejne pokolenia mieszańcowe uzyskane z obustronnych krzyżowań form amfiploidalnych z pszenżytem uprawnym (odmiany: Bogo, Kitaro, Lamberto, Moreno i Secundo oraz linia 8/88). Celem prowadzonych badań było wprowadzenie chromatyny Aegilops do pszenżyta heksaploidalnego a następnie określenie struktury chromosomowej uzyskanych mieszańców oraz śledzenie ewentualnych zmian strukturalnych w kolejnych pokoleniach przy użyciu technik cytogenetyki molekularnej. W tym celu dokonano identyfikacji poszczególnych chromosomów przy użyciu markerów cytogenetycznych, techniką fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w gatunkach: Ae. umbellulata (UU, 2n=2x=14), Ae. comosa (MM, 2n=2x=14) i Ae. longissima (S l S l, 2n=2x=14) i Ae. sharonensis (S sh S sh, 2n=2x=14), będących ewolucyjnymi przodkami gatunków poliploidalnych, użytych w prezentowanym doświadczeniu. W celu określenia składów chromosomowych badanych form zastosowano techniki cytogenetyki molekularnej polegające na hybrydyzacji sond molekularnych z DNA w chromosomach in situ. W prezentowanych badaniach genomowe DNA analizowanych gatunków posłużyło do kategoryzacji chromosomów a cztery sekwencje powtarzalne: psc 119.2 (otrzymana z żyta S. cereale) oraz pas1 (otrzymana z Ae. tauschii) oraz 35S rdna i 5S rdna służyły do identyfikacji poszczególnych chromosomów. Badania polegały na analizie cytogenetycznej i molekularnej form wyjściowych (Ae. biuncialis, Ae. ovata, Ae. kotschyi, Ae. variabilis i Ae. tauschii), amfiploidów Aegilops ssp. S. 1

cereale oraz mieszańców (Aegilops ssp. S. cereale) pszenżyto. Wykazano różnice w lokalizacji sekwencji powtórzeniowych pomiędzy analogicznymi chromosomami genomów wchodzących w skład form wyjściowych i form mieszańcowych. Lokalizacja sygnałów w chromosomach genomu M i S była bardziej zróżnicowana niż w chromosomach genomu U i D. Identyfikowano także geny związane z odpornością na rdzę brunatną (powodowaną przez Puccinia triticiana), mączniaka prawdziwego (powodowanego przez Blumeria graminis) oraz łamliwość podstawy źdźbła (powodowaną przez Oculimaculla yallundae i O. acuformis) z pomocą zweryfikowanych markerów molekularnych. Rośliny mieszańcowe posiadające chromatynę rodzaju Aegilops kotschyi, Ae. variabilis, Ae. ovata i Ae. biuncialis są źródłem kompleksowej odporności na rdzę (Lr37+Sr38+Yr17). Wyprowadzono również mieszańce posiadające chromosomy Ae. variabilis lub Ae. tauschii, które są źródłem odporności na rdzę brunatną warunkowaną przez gen Lr39. Ponadto, otrzymane rośliny mieszańcowe posiadające chromosomy Ae. variabilis cechują się obecnością genu Pm13 (odporność na mączniaka prawdziwego). Mieszańce pszenżyta z translokacjami chromatyny kozieńców o ustabilizowanej strukturze i pożądanych cechach argonomicznych mogą być formami przeznaczonymi do dalszych prac hodowlanych. Praca częściowo została wykonana w ramach projektu finansowanego przez Narodowe Centrum Nauki: Nr projektu: UMO-2012/05/N/NZ9/01563 Tytuł projektu: Identyfikacja chromosomów w gatunkach diploidalnych i tetraploidalnych kozieńców (Aegilops spp.) oraz w formach mieszańcowych w obrębie plemienia Triticeae przy użyciu markerów cytogenetycznych Kierownik projektu i wykonawca: Michał Kwiatek 2. Wstęp Pszenżyto uprawne (X Triticosecale Witt.) jest syntetycznym allopoliploidem pozyskanym w obrębie plemienia Triticeae. Jest to mieszaniec międzyrodzajowy powstały w wyniku skrzyżowania pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum L.) i żyta (Secale cereale L.). Krzyżowania międzygatunkowe oraz międzyrodzajowe są powszechnie stosownym narzędziem hodowli klasycznej w celu uzyskania nowych gatunków (lub rodzajów), a także w celu poszerzania zmienności genetycznej już istniejących taksonów. Wytworzenie zboża łączącego zalety pszenicy zwyczajnej i żyta było jednym z celów hodowli końca XIX i XX wieku. Pszenica zwyczajna jest gatunkiem o stosunkowo dużych wymaganiach glebowych, w przeciwieństwie do żyta, które może być uprawiane na lekkich, piaszczystych glebach (Tarkowski 1975). Jest także gatunkiem dość wrażliwym na choroby grzybowe (Wiśniewska i in. 2003, Wiśniewska i Kowalczyk 2005), szkodniki (Friebe i in. 1990), a także cechuje 2

się wrażliwością na deficyt wody (Saint Pierre i in. 2012). Co więcej, ziarno pszenicy posiada większą zawartość białka i innych składników żywieniowych, które wpływają na wysoką jakość mąki (Tarkowski 1989). Żyto natomiast jest zbożem o stosunkowo wysokiej odporności na stresy biotyczne i abiotyczne (Rakowska 1994). Pszenżyto stanowi obiecującą alternatywę dla żyta w użytkowaniu ziarna na paszę, przede wszystkim jako odmiany ozime, dające wyższe plony o lepszych parametrach jakościowych ziarna. Aktualnie (stan na 15.01.2013r.) w Krajowym Rejestrze Odmian znajduje się 38 odmian pszenżyta ozimego oraz 9 odmian pszenżyta jarego. Podstawowym kierunkiem wykorzystania pszenżyta jest produkcja pasz, głównie ze względu na wysoką zawartość białka o korzystnym składzie aminokwasowym i wysokim współczynniku strawności (Arseniuk i Oleksiak 2002). Ze względu na sposób wyprowadzania pszenżyta możemy wyróżnić pszenżyto pierwotne i wtórne (Kiss i Videki 1971). Pszenżyto pierwotne otrzymane jest poprzez krzyżowanie pszenicy z żytem, a następnie kolchicynowanie płonych roślin pokolenia F 1. W zależności od ploidalności pszenicy dobranej do krzyżowania z żytem diploidalnym, uzyskuje się pszenżyto oktoploidalne (AABBDDRR), heksaploidalne (AABBRR) i tetraploidalne (AARR). Zamierzony cel hodowców w uzyskaniu formy mieszańcowej pszenicy z żytem został w pewnym sensie osiągnięty poprzez uzyskanie wtórnych form pszenżyta heksaploidalnego. Według Merkera (1976) przewagę pszenżyta wtórnego nad pszenżytem pierwotnym można wyjaśnić w trojaki sposób. Po pierwsze, chromosomy genomów A i B pochodzące z form o różnym poziomie ploidalności koniugują ze sobą tworząc wtórne pszenżyto, zatem wprowadzają pożądaną w hodowli zmienność genetyczną (Sisodia i McGinnis 1970). Po drugie, pszenżyto wtórne cechuje się wyraźnie lepszą stabilnością mejotyczną, jednakże istnieją niewielkie różnice w ilości uniwalentów pomiędzy formami pszenżyta 6x z cytoplazmą heksaploidalnych i tetraploidalnych pszenic (Thomas i Kaltsikes 1972). Po trzecie, wyprowadzenie pszenżyta wtórnego daje możliwość uzyskania substytucji chromosomów genomu D w miejsce chromosomów żytnich. W celach poznawczych powstało wiele form pszenżyta o różnym stopniu poliploidalności oraz o zróżnicowanym podłożu genetycznym. Wzorem pszenicy, pszenżyto stało się obiektem badań nad introgresją chromatyny spokrewnionych gatunków. Pierwsze mieszańce oddalone pszenżyta z obcą cytoplazmą powstały w wyniku krzyżowań z kozieńcami (Aegilops ovata L., Ae. caudata L.) oraz dziką pszenicą T. timopheevi Zhuk. (Sánchez-Monge 1974). Kozieńce są roślinami rejonu śródziemnomorskiego. Występują naturalnie od Wysp Kanaryjskich po zachodnią Azję (Van Slageren 1994). Występowanie w zróżnicowanych warunkach środowiskowych jest spowodowane szerokimi zdolnościami adaptacyjnymi tych gatunków. Fakt ten wyjaśnia posiadanie przez gatunki Aegilops wielu ważnych agronomicznie cech, do których zalicza się przede wszystkim cechy warunkujące odporność lub tolerancję na stresy biotyczne i abiotyczne oraz cechy poprawiające jakość i strukturę plonu. Przeniesienie obcych genów, które mogą warunkować pożądane cechy, można osiągnąć poprzez wyprowadzenie linii translokacyjnych za pomocą krzyżowań oddalonych a następnie krzyżowań wypierających (wstecznych), bądź technik inżynierii 3

genetycznej (transformacja genetyczna, kultury in vitro). W badaniach strukturalnych nad introgresją chromatyny Aegilops do innych rodzajów plemienia Triticeae powszechnie używane są metody cytogenetyki molekularnej. Metoda genomowej hybrydyzacji in situ (GISH) pozwala na dyskryminację chromosomów pochodzących od różnych komponentów użytych w krzyżowaniu. Do określenia poszczególnych typów chromosomów używa się przede wszystkim metody FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ), która wykorzystuje specyficzne sondy oparte o m.in.: rdna; przycentromerowe, interkalarne, bądź przytelomerowe sekwencje satelitarne, a także sekwencje syntetyczne (sztucznie wygenerowane, krótkie sekwencje nukleotydowe). Powszechnie używana jest także metoda C-prążków, która umożliwia identyfikację chromosomów poprzez wybarwienie heterochromatyny. Identyfikacja agronomicznie wartościowych cech możliwa jest dzięki zastosowaniu metod genetyki molekularnej. Mając do dyspozycji coraz większą liczbę dostępnych markerów molekularnych, analizy te głównie sprowadzają się do wykorzystania metod opartych o PCR. 3. Cel pracy Jak wykazano we Wstępie, zakres zmienności uprawnego pszenżyta heksaploidalnego jest ograniczony, ponieważ jest to rodzaj bardzo młody, sztucznie wytworzony przez człowieka i nie przeszedł ewolucji naturalnej, jak inne gatunki zbóż. Oprócz wielu zalet pszenżyto ma także pewne niedoskonałości, takie jak niska wartość wypiekowa spowodowana brakiem genomu D pszenicy, w którym zlokalizowane są najważniejsze geny warunkujące wartość technologiczną, oraz zwiększająca się podatność na choroby powodowane przez grzyby patogeniczne, takie jak rdza brunatna i żółta, mączniak prawdziwy i fuzarioza. Prezentowana rozprawa miała na celu zbadanie możliwości poszerzenia zmienności genetycznej pszenżyta poprzez introgresję chromatyny z dzikich gatunków rodzaju Aegilops. Badania obejmowały: 1) wyprowadzenie roślin mieszańcowych Aegilops-pszenżyto poprzez obustronne krzyżowanie form amfiploidalnych (Aegilops spp. S. cereale) z pięcioma odmianami i jedną linią hodowlaną pszenżyta, 2) wyprowadzenie czterech pokoleń roślin mieszańcowych (Aegilops spp. S. cereale) pszenżyto za pomocą samozapyleń i krzyżowań wstecznych i ocenę efektywności krzyżowań, 3) analizę cytogenetyczną ancestralnych form diploidalnych kozieńców (Ae. umbellulata, UU; Ae. comosa, MM; Ae. sharonensis, S sh S sh ; Ae. longissima, S l S l ; Ae. tauschii, DD) oraz form tetraploidalnych (Ae. kotschyii, UUSS; Ae. variabilis, UUSS; Ae. biuncialis, UUMM; Ae. ovata, 4

UUMM) a także mieszańców tych form z żytem i pszenżytem. W tym celu identyfikowano chromosomy mitotyczne i mejotyczne za pomocą fluorescencyjnej i genomowej hybrydyzacji in situ (FISH/GISH), 4) identyfikację genów odporności na rdzę brunatną (powodowaną przez Puccinia triticiana), mączniaka prawdziwego (powodowanego przez Blumeria graminis) oraz łamliwość podstawy źdźbła (powodowaną przez Oculimacula yallundae i O. acuformis) za pomocą zweryfikowanych markerów molekularnych. Celem badań było stwierdzenie, w jakim zakresie zastosowane techniki krzyżowań umożliwiają przeniesienie całych chromosomów lub fragmentów chromatyny gatunków z rodzaju Aegilops do pszenżyta uprawnego, czy obserwowana introgresja obcej chromatyny jest stabilna w kolejnych pokoleniach oraz jakie geny warunkujące odporność roślin na choroby zostały przeniesione do genomu pszenżyta. Cel ten realizowano za pomocą metod genetyki klasycznej oraz genetyki i cytogenetyki molekularnej. 4. Materiał i metody 4.1. Materiał badawczy Do badań użyto pięciu odmian pszenżyta ozimego (X Triticosecale Witt.): Bogo, Lamberto, Kitaro, Moreno i Secundo, które uzyskano z firmy DANKO Hodowla Roślin Sp. z o.o. w Choryni oraz jedną linię 8/88 otrzymaną z kolekcji Instytutu Genetyki Roślin PAN w Poznaniu. Do krzyżowań z pszenżytem użyto pięciu form amfiploidalnych (Aegilops spp. S. cereale): Ae. biuncialis S. cereale (2n = 6x = 42, UUMMRR), Ae. ovata S. cereale (2n = 6x = 42, UUMMRR), Ae. kotschyi S. cereale (2n = 6x = 42, UUSSRR), Ae. viriabilis S. cereale (2n = 6x = 42, UUSSRR), Ae. tauschii S. cereale (2n = 4x = 28, DDRR). Ziarniaki Ae. kotschyi, Ae. variabilis, Ae. biuncialis, Ae. ovata i Ae. tauschii zostały pozyskane przez Wojciechowską (1996) z kolekcji prof. Feldmana (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel). Formy amfiploidalne zostały otrzymane poprzez krzyżowania międzyrodzajowe pomiędzy Aegilops spp. i żytem odmiany Strzekęcińskie. (Wojciechowska i Pudelska 1999, 2002a, b, 2005). Ziarniaki żyta (Secale cereale) odmian: Strzękęcińskie oraz Dankowskie Złote (użyte do analiz cytogenetycznych) otrzymano z firmy nasiennej DANKO Hodowla Roślin Sp. z o.o. w Choryni. Ziarniaki Aegilops umbellulata, Ae. comosa, Ae. longissima, Ae. sharonensis i Ae. speltoides otrzymano z National Small Grains Germplasm Research Facility, National Small Grains Collection (Aberdeen, Idaho, USA). 5

4.2. Metody badawcze wyprowadzenie mieszańców (Aegilops spp. S. cereale) pszenżyto z pomocą krzyżowań wstecznych i samozapyleń, określanie żywotności ziaren pyłku przy użyciu 2% roztworu acetokarminu z gliceryną (stosunek objętościowy 1:1), analiza efektywności krzyżowań na podstawie średnich z roślin badanych kombinacji krzyżówkowych, uzyskanych poprzez iloraz liczby otrzymanych ziarniaków przez liczbę zapylonych kwiatków, przygotowanie preparatów cytologicznych metodą maceracji enzymatycznej (podziały mitotyczne) oraz metodą kwasową (podziały mejotyczne), izolacja genomowego DNA przeznaczonego do analiz cytogenetycznych (Lombard i Delurme 1997), izolacja genomowego DNA przeznaczonego do analiz molekularnych (Doohan i in. 1998), izolacja i oczyszczanie plazmidowego DNA (5S, 35S rdna, psc 119.2) przy użyciu kitu QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Komórki E. coli TopF10` transformowane DNA plazmidu puc19 z insertem psc 119.2, amplifikacja sekwencji pas1 z całkowitego genomowego DNA pszenicy (Triticum aestivum L.) metodą PCR wg. Nagaki i in. (1995), amplifikacja insertu w postaci sekwencji psc119.2, 5S rdna (Unfried i Gruendler 1990) i 35S rdna (Gerlach i Dyer 1980) z plazmidowego DNA metodą PCR, znakowanie 5S rdna i pas1 tetra-metyl-rodaminą metodą PCR Labelling, znakowanie sekwencji 35 rdna i psc 119.2 (Unfried i Gruendler 1990) przy użyciu zestawu do nicktranslacji (Roche), genomowa/fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH/GISH), amplifikacja metodą PCR oraz rozdział elektroforetyczny markerów genów odporności, analiza polimorfizmu endopeptydazy Ep-D1 sprzężonej z genem Pch1. 5. Wyniki 5.1. Krzyżowania W pierwszym roku doświadczeń przeprowadzono dwukierunkowe krzyżowanie amfiploidów Aegilops-Secale z pięcioma odmianami pszenżyta (Bogo, Lamberto, Kitaro, Moreno i Secundo) oraz jedną linią hodowlaną 8/88. Uzyskano 88 roślin pokolenia F 1 w jedenastu kombinacjach krzyżówkowych, w których zapylaczem były formy amfiploidalne oraz 653 ziarniaki w 30 kombinacjach, w których zapylaczem były odmiany lub linia pszenżyta. 6

Ze względu na niską zdolność kiełkowania oraz porażenie ziarniaków patogenami grzybowymi, uzyskano 24 rośliny pokolenia F 1 w jedenastu kombinacjach, w których zapylaczem były formy amfiploidalne: Secundo AkSc [pszenżyto odm. Secundo (Ae. kotschyi S. cereale)], Secundo AoSc, Kitaro AkSc, Kitaro AvSc, Moreno AkSc, Moreno AvSc, Moreno AoSc, Lamberto AvSc, 8/88 AkSc, 8/88 AvSc, 8/88 AoSc; oraz 40 roślin pokolenia F 1 w 6 kombinacjach (AkSc Secundo, AvSc Secundo, AbSc Secundo, AoSc Secundo, AvSc Kitaro i AtSc Bogo), w których zapylaczem były odmiany lub linie pszenżyta. Wszystkie 64 rośliny mieszańcowe pokolenia F 1 poddano samozapyleniu bądź krzyżowaniom wstecznym w kolejnych latach. W kolejnym roku doświadczeń uzyskano 741 ziarniaków, z których do analiz i dalszego krzyżowania przeznaczono 323 roślin. W następnym roku uzyskano 446 ziarniaków, z których 300 roślin analizowano i przekazano do dalszych krzyżowań. W ostatnim roku doświadczeń uzyskano 3370 ziarniaków, z których wybrano 206 celem wykonania analiz genetycznych. 5.2. Analiza żywotności ziaren pyłku Analizie żywotności ziaren pyłku poddano 20 roślin każdej z pięciu kombinacji amfiploidalnych, które następnie użyte zostały do krzyżowań z pszenżytem. Średnia żywotność ziaren pyłku kształtowała się na poziomie wyższym niż 60% oprócz roślin kombinacji Aegilops tauschii S. cereale, których pyłek charakteryzował się średnią żywotnością w wysokości 42,1%. Średnia żywotność ziaren pyłku użytych form pszenżyta w latach 2009 2012 zawierała się w granicach 86% - 94%. Rośliny pokolenia F 1 charakteryzowały się dużą zmiennością żywotności ziaren pyłku (4,82-71,21%) w zależności od kombinacji krzyżówkowej. Najwyższą żywotność ziaren pyłku wykazywały rośliny trzech kombinacji, których komponentem matecznym była linia pszenżyta 8/88. Rośliny kombinacji pokoleń F 2 i BC 1 F 1 cechowały się żywotnością pyłku w zakresie 22,75-74,40%. Stwierdzono brak żywotnego pyłku w roślinach (Ae. biuncialis S. cereale) Secundo. W kolejnym roku doświadczeń analizie żywotności ziaren pyłku poddano 17 kombinacji krzyżówkowych pokoleń F 3, BC 1 F 2, F 1 (BC 1 F 1 ) oraz BC 2 F 1. Rośliny pokolenia BC 1 F 2, kombinacji Secundo (Ae. kotschyi S. cereale) oraz (Ae. kotschyi S. cereale) Secundo posiadały pyłek o najwyższej żywotności (odpowiednio 76,68% i 64,93%), natomiast rośliny pokolenia F 1 (BC 1 F 2 ) kombinacji Secundo (Ae. kotschyi S. cereale) charakteryzowały się najbardziej żywotnym pyłkiem (79,15%). W kolejnym roku doświadczeń najniższe wartości procentowe żywotności ziaren pyłku (10,28% i 10,83%) obserwowano w roślinach odpowiednio pokolenia F 1 (BC 2 F 1 ) oraz pokolenia BC 3 F 1 kombinacji Secundo (Ae. tauschiii S. cereale) Bogo. Natomiast rośliny pokolenia F 1 (BC 1 F 2 ) kombinacji Secundo (Ae. kotschyi S. cereale) charakteryzowały się najbardziej żywotnym pyłkiem (79,15%). 7

5.3. Analizy cytogenetyczne Celem prowadzonych badań było określenie struktury chromosomowej materiałów wyjściowych oraz śledzenie ewentualnych zmian strukturalnych w kolejnych pokoleniach przy użyciu technik cytogenetyki molekularnej. Wykonano mapę fizyczną markerów cytogenetycznych metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w chromosomach gatunków: Ae. umbellulata (U u U u, 2n=2x=14), Ae. comosa (M c M c, 2n=2x=14), Ae. sharonensis (S sh S sh, 2n=2x=14) oraz Ae. longissima (S l S l, 2n=2x=14) będących ewolucyjnymi przodkami czterech gatunków tetraploidalnych: Ae. kotschyi (U k U k S k S k ), Ae. variabilis (U v U v S v S v ), Ae. biuncialis (U b U b M b M b ), Ae. ovata (U o U o M o M o ), użytych w prezentowanym doświadczeniu. Ponadto, analizowano chromosomy gatunku Ae. tauschii (DD), który bezpośrednio został użyty do wytworzenia roślin amfiploidalnych Ae. tauschii S. cereale. Zastosowanie metody FISH z użyciem sond 5S rdna, 25S rdna, psc119.2 i pas1, pozwoliło na identyfikację poszczególnych chromosomów oraz analizę lokalizacji sygnałów na chromosomie. Z każdej grupy amfiploidów Aegilops-Secale wybrano po 20 genotypów i poddano analizie struktury genomu techniką genomowej hybrydyzacji in situ (GISH i mcgish). W amfiploidach zidentyfikowano kompletne kariotypy Aegilops sp. 28 chromosomów, (Ae. tauschii 14 chromosomów). Odstępstwa od teoretycznej liczby chromosomów dotyczyły chromosomów żyta. W trzech roślinach kombinacji Ae. kotschyi S. cereale obserwowano 15 chromosomów żyta, a w jednej roślinie 16 chromosomów. Jedna roślina kombinacji Ae. variabilis S. cereale charakteryzowała się obecnością 12 chromosomów S. cereale, natomiast w dwóch innych roślinach tej kombinacji obserwowano 13 chromosomów żyta. Jedna roślina kombinacji Ae. ovata S. cereale posiadała introgresję chromatyny Aegilops ovata w telomerowej części chromosomu 3R Secale cereale. Składy chromosomowe 66 roślin mieszańcowych pokolenia F 1 z 17 kombinacji krzyżówkowych były analizowane za pomocą techniki GISH. Ogólna liczba chromosomów mieszańców badanych kombinacji krzyżówkowych wahała się w granicach od 39 do 44. Liczba chromosomów genomów U i S wahała się od 4 do 7 (dla każdego genomu), natomiast liczba chromosomów genomu M zawierała się w przedziale 5-7. Chromosomy genomu R w mieszańcach występowały przeważnie w liczbie 14, z wyjątkiem roślin kombinacji (Ae. variabilis S. cereale) Secundo i (Ae. biuncialis S. cereale) Secundo, gdzie obserwowano od 12 do 14 chromosomów R. Powiązanie metod rdna-fish oraz FISH z sondami opartymi o sekwencje powtórzeniowe DNA pozwoliło stwierdzić, iż chromosomy 2U, 2M, 2S, 3U, 3M, 3S, 6U, 5M oraz 6S najliczniej występowały w badanych mieszańcach a w przypadku jednej rośliny mieszańcowej z chromatyną Ae. tauchii zidentyfikowano wspominane powyżej chromosomy 1D i 3D. 148 roślin pokolenia F 2 i BC 1 F 1 posiadały od 31 do 44 chromosomów. Liczba chromosomów genomu U i M wynosiła maksymalnie 5, a liczba chromosomów genomu S wynosiła maksymalnie 6. Liczba chromosomów R w analizowanych mieszańcach była stała i wynosiła 14 za wyjątkiem roślin 8

kombinacji 8/88 (Ae. variabilis S. cereale), gdzie obserwowano od 11 do 14 chromosomów żytnich. Wśród wszystkich roślin kombinacji 8/88 (Ae. variabilis S. cereale), (Ae. kotschyi S. cereale) Secundo i (Ae. variabilis S. cereale) Secundo obserwowano translokacje punktowe z udziałem chromatyny genomu S na chromosomach genomów A i B. Ponadto, obserwowano translokacje terminalne z udziałem chromosomów 1U, 1B, 6U i 6B u 4 roślin pokolenia BC 1 F 1 kombinacji Moreno (Ae. ovata S. cereale) i 3 w roślinach pokolenia F 2 kombinacji (Ae. ovata S. cereale) Secundo. 13 roślin pokolenia BC 1 F 1 kombinacji Kitaro (Ae. kotschyi S. cereale) posiadało 2 chromosomy 6U z translokowanym fragmentem chromatyny pszenżyta, zlokalizowanym terminalnie. W kolejnym roku doświadczeń przeanalizowano 300 roślin pochodzących z 17 kombinacji krzyżówkowych pokolenia F 3, BC 1 F 2, F 1 (BC 1 F 1 ), BC 2 F 1. Obserwowano znaczną eliminację chromosomów Aegilops w roślinach mieszańcowych w porównaniu z mieszańcami poprzedniego pokolenia. Nie stwierdzono obecności chromatyny Aegilops w roślinach siedmiu kombinacji. W pozostałych kombinacjach liczba chromosomów genomu U wynosiła od 0 do 5, liczba chromosomów genomu S od 0 do 6, natomiast liczba chromosomów genomu D od 0 do 3. W dwóch roślinach kombinacji (Ae. kotschyi S. cereale) Secundo stwierdzono obecność translokacji 5U-5A. 206 roślin otrzymanych z ośmiu kombinacji krzyżówkowych pokoleń F 4, BC 1 F 3, F 1 (BC 1 F 2 ), BC 2 F 2, F 2 (BC 1 F 1 ), BC 1 [F 1 (BC 1 F 1 )], F 1 (BC 2 F 1 ) i BC 3 F 1 zostało poddanych analizie cytogenetycznej. Delecje oraz translokacje terminalne chromatyny pszenżyta, obejmujące długie ramiona chromosomów 3D występowały w 6 roślinach pokolenia BC 3 F 1, kombinacji (Ae. tauschii S. cereale) Bogo. Analiza częstości występowania chromosomów Aegilops za pomocą metod FISH wykazała, iż w analizowanych mieszańcach występowały tylko chromosomy 2U, 3U, 2S, 3S i 3D. Do badań metafazy I mejozy komórek macierzystych ziaren pyłku wybrano 42 rośliny z 9 kombinacji krzyżówkowych, a dokładniej: 2 rośliny pokolenia F 1, 5 roślin pokolenia F 1 (BC 1 F 1 ), 3 rośliny pokolenia BC 2 F 1, 6 roślin pokolenia BC 2 F 1, 1 roślinę pokolenia F 3, 7 roślin pokolenia BC 2 F 1, 4 rośliny pokolenia BC 2 F 1, 11 roślin pokolenia F 4, oraz 2 rośliny pokolenia BC 3 F 1. Dla każdej rośliny analizowano od 10 do 20 komórek macierzystych pyłku (KMP) podczas metafazy I mejozy. Składy chromosomowe badano przy użyciu metody mcgish. Średnia liczba biwalentów wynosiła 16,6 20,88 na komórkę macierzystą pyłku (KMP). Najwięcej uniwalentów obserwowano w roślinach pokolenia F 1 kombinacji (Ae. biuncialis S. cereale) Secundo średnia 6,70/KMP, a najmniej w roślinach pokolenia F 1 kombinacji (Ae. variabilis S. cereale) Secundo średnia 0,24/KMP. Obserwowano również triwalenty o strukturze genomowej AB/AB/R lub UMU. 9

5.4. Identyfikacja genów odporności na grzyby patogeniczne za pomocą markerów molekularnych W celu analizy obecności genów odporności na stres biotyczny powodowany infekcją patogenów grzybowych w użytych do badań gatunkach Aegilops, roślinach amfiploidalnych (Aegilops spp. S. cereale) i formach pszenżyta przeznaczonych do krzyżowań użyto zweryfikowanych markerów molekularnych. Identyfikowano obecność 12 markerów DNA genów odporności na rdzę brunatną (powodowaną przez Puccinia triticina; Lr9, Lr10, Lr19, Lr20, Lr22a, Lr28, Lr29, Lr35, Lr37, Lr39, Lr41, Lr47). Ponadto, 4 markery DNA genów odporności na mączniaka prawdziwego (powodowanego przez Blumeria graminis): Pm1, Pm2, Pm3, Pm13. Identyfikowano również obecność jednego markera enzymatycznego w postaci endopeptydazy EpD1b oraz sprzężonego z nim markera DNA Xust2001-7DL, który powiązany jest z locus kodującym gen Pch1, odpowiedzialny za odporność roślin na łamliwość źdźbła powodowaną przez Oculimaculla yalundae i O. acuformis. W prezentowanej pracy w pokoleniu F 1 wyselekcjonowano 6 roślin kombinacji (Ae. variabilis S. cereale) Secundo oraz 2 rośliny kombinacji 8/88 (Ae. variabilis S. cereale), które posiadały jednocześnie markery Lr37 i Lr39 warunkujące odporność na rdzę brunatną i Pm13, który warunkuje odporność na mączniaka prawdziwego oraz markery Pm1, Pm2 i Pm3. W kolejnych pokoleniach rośliny czterech kombinacji z udziałem chromatyny amfiploida (Ae. variabilis S. cereale), tj.: F 2 8/88 (Ae. variabilis S. cereale), F 2 (Ae. variabilis S. cereale) Secundo, BC 1 F 1 Lamberto (Ae. variabilis S. cereale) oraz BC 1 F 1 8/88 (Ae. variabilis S. cereale) charakteryzowały się współwystępowaniem wszystkich pięciu analizowanych markerów. 19 roślin posiadających 5 markerów genów odporności pochodziło z kombinacji BC 1 F 1 8/88 (Ae. variabilis S. cereale). 16 roślin pokolenia F 1 (BC 1 F 1 ) kombinacji 8/88 (Ae. variabilis S. cereale) oraz 24 rośliny pokolenia BC 1 F 2 kombinacji 8/88 (Ae. variabilis S. cereale) charakteryzowały się współwystępowaniem wszystkich analizowanych markerów. Współwystępowanie czterech markerów genów odporności występowało także w 24 roślinach pokolenia F 4 kombinacji Secundo (Ae. kotschyi S. cereale), oraz w 23 roślinach pokolenia BC 3 F 1 kombinacji (Ae. tauschii S. cereale) Bogo. Przeprowadzone analizy zymogramów endopeptydaz EpD1 oraz badania mające na celu identyfikację markera Xust2001-7DL (sprzężonego z enedopeptydazą EpD1) nie wykazały obecności endopeptydazy EpD1b sprzężonej z genem Pch1, warunkującym odporność na łamliwość źdźbła w badanych formach amfiploidalnych (Aegilops spp. S. cereale) i formach pszenżyta przeznaczonych do krzyżowań. 6. Dyskusja W prezentowanej pracy wykorzystano 5 form amfiploidalnych (Aegilops spp S. cereale) w celu podjęcia próby wprowadzenia zmienności do pszenżyta poprzez krzyżowanie z pięcioma odmianami pszenżyta i jedną linią hodowlaną pszenżyta heksaploidalnego. Z doniesień literaturowych wynika, iż wykorzystanie amfiploidów celem introgresji obcej chromatyny do gatunków pokrewnych 10

może być korzystne (Simonenko i in. 1998, Apolinarska 2010). Amfiploidy użyte w omawianej pracy cechowały się poziomem ploidalności 6x lub 4x a także obecnością genomu R (podobnie jak w formach pszenżyta), który według wstępnych założeń miał zapewnić częściową stabilność cytogenetyczną otrzymanych mieszańców. Wśród 30 kombinacji krzyżówkowych pokolenia F 1, których formą ojcowską były amfiploidy Aegilops Secale tylko rośliny jedenastu kombinacji zawiązały ziarniaki. Z 4100 zapylonych kwiatków uzyskano tylko 88 ziarniaków, co stanowiło 2,15% zawiązywania ziarniaków. Natomiast wśród krzyżowań, w których zapylaczem były formy pszenżyta, we wszystkich 30 kombinacjach krzyżówkowych uzyskano ziarniaki. Efektywność krzyżowania była zatem pięciokrotnie wyższa w przypadku, gdy komponentem matecznym były amfiploidy Aegilops S. cereale. Wyniki te są zbieżne z badaniami nad otrzymaniem mieszańców Aegilops-Triticum pokolenia F 1 (Prażak 2001), gdzie procent zawiązywanych ziarniaków w przypadku, gdy formą mateczną były kozieńce był siedmiokrotnie wyższy niż w przypadku krzyżowań odwrotnych. Można zatem przypuszczać, że dużą rolę w tym procesie odgrywa żywotność ziaren pyłku. Ponadto niższa efektywność krzyżowań w przypadku, gdy zapylaczem były formy amfiploidalne (Aegilops S. cereale) spowodowana może być różnicą w morfologii i składzie białek ziaren pyłku. W badaniach Kalinowskiego i in. (2001) ziarna pyłku amfiploidów Ae. kotschyi S. cereale i Ae. variabilis S. cereale posiadają odmienną strukturę i kształt oraz 1 do 3 porów w porównaniu do ziaren pyłku form wyjściowych z jednym porem. Procent zawiązywania ziarniaków poszczególnych kombinacji również ulegał przyrostowi z pokolenia na pokolenie. Podobne wyniki otrzymano w badaniach mieszańców pokolenia F 2 do F 5 Aegilops kotschyi Boiss. Triticum aestivum L. cv. Rusałka (Prażak 2009). Nieodłączną częścią badań nad mieszańcami oddalonymi są analizy cytogenetyczne pozwalające stwierdzić stopień introgresji obcej chromatyny. W tym celu, jednym z głównych założeń prezentowanej pracy było poznanie struktury i morfologii chromosomów gatunków rodzaju Aegilops, użytych do krzyżowań. W tej pracy badano za pomocą metod cytogenetyki molekularnej chromosomy, należące do genomów U, M, S i D, które są głównymi genomami w obrębie rodzaju Aegilops (Van Slageren 1994). Jednym z założonych zadań analizy porównawczej wzorów sygnałów FISH na chromosomach badanych genomów rodzaju Aegilops (U, S, M, D), w różnych stadiach ewolucyjnych i mieszańcowych, było ustosunkowanie się do teorii Zohary ego i Feldman a (1962) mówiącej, iż zazwyczaj jeden genom stanowi tzw. oś lub nazywany jest genomem podstawowym (ang. pivotal genome). Z kolei genomy towarzyszące podlegają modyfikacjom w większym natężeniu i znacznie różnią się od genomu rodzicielskiego, stąd nazywane są genomami różnicującymi (ang. differential genome). Genom U, rozważany jako genom podstawowy o konserwatywnej strukturze, jest zabezpieczeniem zapewniającym płodność mieszańca, podczas gdy główne rearanżacje zachodzą w genomach różnicujących (Chee i in. 1995). Wyniki prezentowanych badań nie odbiegają od założeń wspomnianej teorii. Jednakże, stwierdzono niewielkie różnice w dystrybucji sekwencji powtarzalnych w chromosomach genomu U (Ae. umbellulata) i D (Ae. tauschii) w porównaniu z chromosomami tego genomu w potomnych gatunkach. Natomiast dystrybucja sygnałów sekwencji powtórzeniowych 11

wskazuje, że chromosomy genomów M i S są bardziej zróżnicowane. Umiejętność identyfikacji poszczególnych chromosomów Aegilops sp. pozwoliła śledzić ich zachowanie w następujących po sobie pokoleniach mieszańcowych(aegilops spp S. cereale) pszenżyto. W prezentowanej pracy stwierdzono, iż samozapylenie, bądź krzyżowania wsteczne z pszenżytem miały istotny wpływ na eliminację chromosomów kozieńców. W roślinach pokolenia F 1 niezależnie od kombinacji krzyżówkowej obserwowano przeważnie od 4 do 7 chromosomów kozieńców. Zidentyfikowano udział chromosomów wszystkich grup homeologicznych. Ciekawym zjawiskiem były translokacje wewnątrzgatunkowe pomiędzy chromosomami grup czwartej i szóstej genomów U i M w kombinacji (Ae. biuncialis S. cereale) Secundo. W kolejnych pokoleniach, otrzymywanych poprzez samozapylenia i krzyżowania wsteczne z pszenżytem, obserwowano coraz mniejszą liczbę chromosomów Aegilops. Związek pomiędzy eliminacją chromosomów (bądź chromatyny) kozieńców oraz obecnością translokacji z procentowym zawiązywaniem ziarniaków w kolejnych pokoleniach nie jest jednoznaczny. Obserwowano wzrost zawiązywanych ziarniaków w stosunku do zapylonych kwiatków porównując pokolenia, natomiast procentowy udział roślin poszczególnych kombinacji krzyżówkowych, które posiadały translokacje (translokacje punktowe genomu S na chromosomach genomów A i B pominięto) utrzymywał się na podobnym poziomie. Proces eliminacji obcej chromatyny ma swoje podłoże w procesie mejozy, gdzie chromosomy introgresywne, nie posiadające pary w postaci chromosomu homologicznego (uniwalenty) tworzą mikrojądra, na skutek czego ulegają eliminacji. Analizy metafazy I mejozy komórek macierzystych pyłku wykonane na wybranych roślinach opisanych w tej pracy pokazują wysoką liczbę uniwalentów (średnia częstość występowania - 6,7/komórkę macierzystą pyłku) w roślinach pokolenia F 1 kombinacji (Ae. biuncialis S. cereale) Secundo oraz występowanie triwalentu o strukturze genomowej UMU. Obserwowane zaburzenia mogły mieć wpływ na niską żywotność ziaren pyłku roślin tej kombinacji, która wynosiła 6,95%. W przypadku rodzaju Aegilops, eliminacja chromosomów może być spowodowana poprzez działanie genów gametocydalnych (Gc) (Endo i Tsunewaki 1975). Gamety posiadające chromosomy z genami Gc indukują fragmentację chromosomów, aberracje bądź delecje fragmentów chromosomów w gametach nie posiadających genów Gc (Nasuda i in 1998). Rozwój linii introgresywnych pszenżyta jest konieczny w celu transferu pożądanych cech, takich jak odporność na choroby wywołane przez grzyby patogeniczne. Połączenie metod genetyki molekularnej, pozwalającej na identyfikację markerów genów odporności z metodami cytogenetyki molekularnej zostało wykorzystane w prezentowanej pracy do selekcji genotypów pszenżyta z introgresją chromatyny Aegilops, niosącej geny odporności na rdzę brunatną i mączniaka prawdziwego. Analiza 892 roślin z 17 kombinacji krzyżówkowych pozwoliła wyodrębnić przy użyciu metod genetyki molekularnej szeroką pulę roślin, w których zidentyfikowano współwystępowanie kilku markerów genów odporności na rdzę brunatną i mączniaka prawdziwego. Tak zwana piramidyzacja genów odporności ma na celu wykorzystanie kilku genów odporności pochodzących z różnych źródeł (Chełkowski i in. 2003). 12

7. Wnioski 1. Zastosowanie ustabilizowanych amfiploidów (Aegilops spp. S. cereale, UUSSRR lub UUMMRR bądź DDRR) do krzyżowań z pszenżytem 6 (AABBRR) warunkuje powstawanie biwalentów genomu R, co korzystnie wpływa na stabilność genetyczną mieszańców, zdolność zawiązywania ziarniaków i żywotność ziaren pyłku. 2. Efektywność krzyżowania była pięciokrotnie wyższa w przypadku, gdy komponentem matecznym były amfiploidy Aegilops S. cereale w porównaniu do krzyżowań odwrotnych. 3. Średnia żywotność ziaren pyłku roślin kombinacji (Ae. kotschyi S. cereale) pszenżyto, (Ae. variabilis S. cereale) pszenżyto, (Ae. biuncialis S. cereale) pszenżyto i (Ae. ovata S. cereale) pszenżyto ulegała wzrostowi z pokolenia na pokolenia oraz miała istotny wpływ na procent zawiązywanych ziarniaków roślin z tych kombinacji. 4. Markery cytogenetyczne w postaci sekwencji powtarzalnych: 5S i 35S rdna oraz psc119.2 i pas1 są efektywnym narzędziem identyfikacji chromosomów rodzaju Aegilops w mieszańcach Aegilops S. cereale oraz (Aegilops S. cereale) pszenżyto. 5. Chromosomy genomu U i D gatunków należących do rodzaju Aegilops charakteryzują się większą konserwatywnością w stosunku do chromosomów genomów M i S biorąc pod uwagę dystrybucję sekwencji powtarzalnych 5S i 35S rdna oraz psc119.2 i pas1 w analizowanych gatunkach diploidalnych tj. Ae. umbellulata, Ae. comosa, Ae. longissima, Ae. sharonensis i Ae. tauschii, a także w gatunkach tetraploidalnych Ae. kotschyi, Ae. variabilis, Ae. biuncialis i Ae. ovata oraz w badanych formach amfiploidalnych Aegilops S. cereale oraz mieszańcach (Aegilops S. cereale) pszenżyto. 6. Zwielokrotnienie poziomu ploidalności indukuje eliminację loci 35S rdna w chromosomach 1M, 5M, 5S i 6S tetraploidalnych gatunków Aegilops (Ae. kotschyi, Ae. variabilis, Ae. biuncialis i Ae. ovata) oraz w mieszańców Aegilops spp. S. cereale i (Aegilops spp. S. cereale) pszenżyto w porównaniu z gatunkami diploidalnymi tj. Ae. umbellulata, Ae. comosa, Ae. longissima, Ae. sharonensis 7. W następujących po sobie krzyżowaniach wstecznych lub samozapyleniach występuje sukcesywna eliminacja chromosomów kozieńców z mieszańców (Ae. kotschyi S. cereale) pszenżyto, (Ae. variabilis S. cereale) pszenżyto, (Ae. biuncialis S. cereale) pszenżyto i (Ae. ovata S. cereale) pszenżyto (Aegilops tauschii S. cereale) pszenżyto. 13

8. Chromosomy Aegilops sp. należące do drugiej i trzeciej grupy homeologicznej występowały najczęściej w kombinacjach (Ae. kotschyi S. cereale) pszenżyto, (Ae. variabilis S. cereale) pszenżyto, (Ae. biuncialis S. cereale) pszenżyto oraz (Ae. ovata S. cereale) pszenżyto oraz (Aegilops tauschii S. cereale) pszenżyto i uległy eliminacji w najmniejszym stopniu podczas kolejnych krzyżowań. 9. Krzyżowania międzyrodzajowe indukują translokacje wewnątrzgatunkowe pomiędzy chromosomami czwartej i szóstej grupy homelogicznej genomów U i M w kombinacjach (Ae. biuncialis S. cereale) pszenżyto oraz (Ae. ovata S. cereale) pszenżyto. 10. Wizualizacja punktowych translokacji genomu S na chromosomach genomu A i B w mieszańcach (Ae. kotschyi S. cereale) pszenżyto oraz (Ae. variabilis S. cereale) pszenżyto świadczy o wysokim stopniu pokrewieństwa tych genomów, a także może być spowodowana zbyt wysoką temperaturą hybrydyzacji podczas GISH, co skutkowało zwiększeniem specyficzności sondy molekularnej opierającej się na genomowym DNA, bogatym w sekwencje powtarzalne. 11. Rośliny mieszańcowe (Ae. kotschyi S. cereale) pszenżyto, (Ae. variabilis S. cereale) pszenżyto, (Ae. biuncialis S. cereale) pszenżyto i (Ae. ovata S. cereale) pszenżyto są źródłem kompleksowej odporności na rdzę brunatną, źdźbłową i żółtą (Lr37+Sr38+Yr17). 12. Rośliny mieszańcowe (Aegilops spp. S. cereale) pszenżyto posiadające chromosomy Ae. variabilis lub Ae. tauschii charakteryzują się obecnością markera genu Lr39 warunkującego odporność na rdzę brunatną. 13. Rośliny mieszańcowe pszenżyta ze zidentyfikowanymi chromosomami amfiploida (Ae. variabilis S. cereale) cechują się obecnością markera genu Pm13 warunkującego odporność na mączniaka prawdziwego. 14. Z mieszańców pszenżyta z amfiploidami (Aegilops spp. S. cereale) wyselekcjonowano 150 roślin posiadających 4-6 markerów genów warunkujących odporność na rdzę brunatną (Lr37 i Lr39) i mączniaka prawdziwego (Pm1, Pm2, Pm3 i Pm13). 14

8. Literatura 1. Apolinarska B., Wiśniewska H., Wojciechowska B. (2010). Aegilops-rye amphiploids and substitution rye used for introgression of genetic material into rye (Secale cereale L.). J. Appl. Genet. 51(4): 413-20. 2. Arseniuk E., Oleksiak T. (2002). Production and breeding of cereals in Poland. Proc. 5th Int. Triticale Symp., IHAR Radzików, Poland 30 June 5 July. I: 7-13. 3. Chee P.W., Lavin M., Talbert L.E. (1995). Molecular analysis of evolutionary patterns of U genome wild wheats. Genome 38: 290 297. 4. Chełkowski J., Golka L., Stępień Ł. (2003). Application of STS markers for leaf rust resistance genes in near-isogenic lines of spring wheat cv. Thatcher. J. Appl. Genet. 44: 323-338. 5. Doohan F.M., Parry D.W., Jenkinson P., Nicholson P. (1998). The use of species-specific PCR based assays to analyse Fusarium ear blight of wheat. Plant Pathology 47: 197-205. 6. Endo T.R., Tsunewaki K. (1975). Sterility of common wheat with Aegilops triuncialis cytoplasm. Heredity 66: 13 18. 7. Friebe B., Hatchett J.H., Sears R.G., Gill B.S. (1990). Transfer of Hessian fly resistance from 'Chaupon' rye to hexaploid wheat via a 2BS/2RL wheat-rye chromosome translocation. Theor. Appl. Genet. 79: 385-389. 8. Gerlach W.L., Dyer T.A. (1980). Sequence organization of the repeating units in the nucleus of wheat which contain 5S rrna genes. Nucleic Acids Res. 11: 4851 4865. 9. Kalinowski A., Winiarczyk K., Wojciechowska B. (2001). Pollen proteins after two-dimensional gel electrophoresis and pollen morphology of the amphiploids Aegilops kotschyi and Ae. variabilis with Secale cereale. Sex Plant Reprod 14: 153 161. 10. Kiss A., Videki L. (1971). Developement of secondary hexaploid triticales by crossing Triticale with rye. Wheat Inf. Ser. 32: 17-20. 11. Lombard V., Delourme R. (2001). A consensus linkage map for rapeseed (Brassica napus L.): construction and integration of three individual maps from DH populations. Theor. Appl. Genet. 103: 491 507. 12. Merker A. (1976). The cytogenetic effect of heterochromatin in hexaploid triticale. Hereditas 83: 215-222. 13. Nagaki K., Tsujimoto H., Isono K., Sasakuma T. (1995). Molecular characterization of a tandem repeat, Afa family, and its distribution among Triticeae. Genome 38: 479-486. 14. Nasuda S., Friebe B., Busch W., Kynast R.G., Gill B.S. (1998). Structural rearrengement in chromosome 2M of Aegilops comosa has prevented the utilization of the Compair and related wheat Ae. comosa translocations in wheat improvement. Theor. Appl. Genet. 96: 780 785. 15. Prażak R. (2001). Cross direction for successful production of F1 hybrids between Triticum and Aegilops species. Plant Breeding and Seed Science 45(1): 83-86. 16. Prażak R. (2009). Zmienność i współzależność niektórych cech w mieszańcach Aegilops kotschyi Boiss. Triticum aestivum L. cv. Rusałka. Biul. IHAR 252: 43-59. 15

17. Rakowska M. (1994). Antinutritive compounds in rye grain. Hod. Rośl. Aklim. 38: 21-42. 18. Saint Pierre C., Crossa J.L., Bonnett D., Yamaguchi-Shinozaki K., Reynolds M.P. (2012). Phenotyping transgenic wheat for drought resistance. J. Exp. Bot. 63(5): 1-10. 19. Sánchez-Mongue E. (1974). Development of triticales in western Europe. Proc Symp Triticale El Batán, México. p. 31-39. 20. Simonenko V.K., Motsny I.I., Sechnyak A.I., Kulbida M.P. (1998). The use of wheat-alien and Aegilops-rye amphiploids for introgression of genetic material to wheat. Euphytica 100: 313 321. 21. Sisodia N.S., McGinnis R.C. (1970). Importance of hexaploid wheat germplasm in hexaploid triticale breeding. Crop Sci. 10: 161-162. 22. Tarkowski C. (1975). Triticale cytogenetyka, hodowla i uprawa. Roczn. Nauk Roln., Monografie, Seria D, Tom 157. 23. Tarkowski C. (1989). Biologia pszenżyta. Państwowe Wydawnictwo Naukowe. 24. Thomas J.B., Kaltsikes P.J. (1972). The genomic origin of the unpaired chromosomes in triticale. Can. J. Genet. Cytol. 18 :687-700. 25. Unfried I., Gruendler P. (1990). Nucleotide sequence of the 5.8S and 25S rrna genes and of the internal transcribed spacers from Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 18: 4011. 26. Van Slageren M.W (1994). Wild wheats: a monograph of Aegilops L., and Amblyopyrum (Jaub. & Spach) Eig (Poaceae). Agricultural University of Wageningen, the Netherlands, and International Center for Agricultural Research in Dry Areas, Aleppo, Syria. 27. Wiśniewska H., Kowalczyk K. (2005). Resistance of cultivars and breeding lines of spring wheat to Fusarium culmorum and powdery mildew. J. Appl. Genet. 46(1):35-40. 28. Wiśniewska H., Stępień Ł., Kowalczyk K. (2003). Resistance of spring wheat cultivars and lines to leaf rust. J. Appl. Genet. 44(3): 361-368. 29. Wojciechowska B. (1996). Hybrids of tetraploid Aegilops sp. with Secale cereale. Genet. Pol. 37A: 174-178. 30. Wojciechowska B., Pudelska H. (1999). Production, morphology and fertility of the amphiploids Aegilops variabilis Secale cereale and Ae. kotschyi S. cereale. Cereal Res. Commun. 27: 79 82. 31. Wojciechowska B., Pudelska H. (2002a). Production and morphology of the hybrids Aegilops kotschyi Secale cereale and Ae. biuncialis S. cereale. J. Appl. Genet. 43: 279 285. 32. Wojciechowska B., Pudelska H. (2002b). Hybrids and amphiploids of Aegilops ovata L. with Secale cereale L.: production, morphology and fertility. J. Appl. Genet. 43: 415 421. 33. Wojciechowska B., Pudelska H. (2005). Production and characterization of amphiploids of Aegilops kotschyi and Ae. biuncialis with Secale cereale, and of backcross hybrids of Ae. biuncialis S. cereale amphiploids with 2x and 4x S. cereale. J. Appl. Genet. 46: 157-161. 34. Zohary D., Feldman M. (1962). Hybridization between amphiploids and the evolution of polyploids in the wheat Aegilops Triticum group. Evolution 16: 44 61. 16