Podstawy genetyki V Interakcje genetyczne część 2. Genetyczne podstawy biologii systemów. Powstanie i ewolucja informacji genetycznej
2 Interakcje genetyczne
Interakcje Łagodzące (alleviating interactions) Fenotyp podwójnego mutanta lżejszy, niż przewidywany dla sumowania fenotypów mutantów pojedynczych Syntetyczne, pogarszające (synthetic, aggravating interactions) Fenotyp podwójnego mutanta cięższy, niż przewidywany dla sumowania fenotypów pojedynczych mutantów 3
Interakcje agodzące Supresja Fenotyp mutacji (a) znoszony przez mutację w innym genie (b) Podwójny mutant ab ma fenotyp dziki lub bliski dzikiemu Epistaza Fenotyp mutacji (a) maskowany przez mutację w innym genie (b) Podwójny mutant ab ma fenotyp taki sam, jak mutant b obecność mutacji b narzuca fenotyp niezależnie od allelu genu a 4
Epistaza (sensu stricte) Mutacje w jednym genie (epistatyczne) maskują fenotyp alleli innego genu (hipostatycznego) Z reguły wskazuje na funkcję w tym samym szlaku, może posłużyć do ustalenia kolejności procesów Zauważona jako czynnik zmieniający typowy rozkład 9:3:3:1 w krzyżówkach dwugenowych 5
Epistaza D. melanogaster mutanty barwy oka wt white vermillion Podwójny mutant white, vermillion ma oczy białe, nieodróżnialne od pojedynczego mutanta white Mutacje white epistatyczne względem vermillion (i wielu innych mutacji barwy oka 6
Epistaza wt white vermillion Drozopteryna jasnoczerwona, ommochromy brunatne Defekty szlaku drozopteryny oczy ciemnobrązowe Defekty szlaku ommochromów oczy jaskrawoczerwone (np. vermillion) Produkt genu white transport prekursorów barwników (guaniny i tryptofanu) do komórek zawiązka oka w zarodku 7
Epistaza Przy regulacji pozytywnej (i np. szlakach biosyntezy) mutacja elementu leżącego wyżej w szlaku będzie epistatyczna 8 Roth et al. Journal of Biology 2009, 8:35
Epistaza i szlaki regulatorowe Obecność mutantów o przeciwstawnym efekcie sugeruje regulację negatywną jednego z etapów szlaku mutacja tra epistatyczna Roth et al. Journal of Biology 2009, 8:35 9
Interakcje syntetyczne Syntetyczne wzmocnienie Fenotyp podwójnego mutanta silniejszy (lub nieoczekiwany) niż suma fenotypów pojedynczych mutacji Syntetyczna letalność Pojedyncze mutacje nie są letalne, podwójny mutant letalny Niekomplementacja niealleliczna (SSNC second-site non-complementation) Dwie recesywne mutacje a i b w podwójnej hetrozygocie dają fenotyp zmutowany 10
Syntetyczne wzmocnienie Nieoczekiwanie silny (synergistyczny) efekt połączenia dwóch mutacji np. mutacja a obniża tempo wzrostu o 10%, mutacja b o 20%, a w podwójnym mutancie obniżenie o 90% Skrajny przypadek: syntetyczna letalność Zwykle dotyczy alleli nullomorficznych lub hipomorficznych Łatwiejsza do badania w organizmach mających wegetatywną fazę haploidalną (np. drożdże) Inny wariant: SDL (synthetic dosage lethality) nadekspresja jednego genu ujawnia b. silny fenotyp w kontekście mutacji innego genu 11
Syntetyczne wzmocnienie W przypadku alleli null dotyczy szlaków działających równolegle Szlak A i B wykazują redundację, ale defekt obydwu jest letalny Boone et al. Nature Reviews Genetics, 2007 vol. 8 (6) pp. 437 12
Syntetyczne wzmocnienie W przypadku alleli hipomorficznych może dotyczyć elementów tego samego szlaku 13 Boone et al. Nature Reviews Genetics, 2007 vol. 8 (6) pp. 437
SDL Syntetyczna letalność dawki (nadekspresji) synthetic dosage lethality Np. nadekspresja genu PHO4 jest letalna w kontekście delecji genu PHO85 PHO85 koduje kinazę białkową, ktorej substratem jest, m. in., produkt PHO4. Fosforylacja hamuje aktywność białka. Letalny efekt nadmiaru aktywnego białka Pho4p. 14
Poszukiwanie interakcji Interakcje dające się selekcjonować pozytywnie (np. supresje) można wykrywać stosując bezpośrednią selekcję (np. po mutagenezie albo po transformacji plazmidem wysokokopiowym) W niektorych organizmach modelowych (drożdże) możliwa systematyczna analiza interakcji dla wszystkich par genów cel: stworzenie kompletnej mapy interakcji Poszukiwanie interakcji syntetycznych: metody SGA i dslam 15
SGA Synthetic Gene Array Kolekcja delecji, krzyżowana z badanym genem Sporulacja, Selekcja haploidów MATa Selekcja pojedynczych i podwójnych mutantów 16 Boone et al. Nature Reviews Genetics, 2007 vol. 8 (6) pp. 437
Niekomplementacja niealleliczna Second-site non-complementation (SSNC) Mutacja a jest recesywna, mutacja b w innym genie też, ale podwójna heterozygota a/+ b/+ ma fenotyp mutanta 17
SSNC typu I Interakcja toksyczna Połączenie zmutowanych produktów genów daje produkt o toksycznych (antymorf) właściwościach, których nie mają pojedynczo Specyficzne dla alleli w obu genach Allele nie mogą być nullomorfami Bardzo rzadko spotykana Np. geny α i β tubuliny u drożdży 18
SSNC typu II Sekwestracja Białka A i B działają w kompleksie. Heterozygotyczna mutacja B (+/b) jest recesywna powstaje wystaczająca ilość kompleksu AB (50%) Antymorficzna mutacja A tworzy nieaktywny kompleks z produktem B. W heterozygocie (a/+) z dzikimi allelami B powstaje 50% prawidłowego kompleksu Połączenie heterozygoty (a/+) i (b/+) powoduje, że zmutowane białko A wyłapuje połowę z pozostałej połowy białka B- tylko 25% kompleksu aktywnego Specyficzna dla allelu a, allel b może być null 19
SSNC typu II Heterozygota B2t/+ dysponuje połową potrzebnej β-tubuliny (niezależnie od allelu B2t) Obecność mutanta nc sekwestruje jeszcze połowę tej puli w nieaktywny kompleks, zostaje 25% Delecja genu nc nie daje tego efektu połowa podjednostki α i połowa podjednostki β może bez przeszkód się łączyć dając 50% normalnego poziomu kompleksu 20
SSNC typu III Złożona haploinsuficjencja Nie wymaga interakcji fizycznej produktów genów Obniżenie aktywności genów A i B w heterozygotach pojedynczo nie daje efektu W podwójnej heterozygocie efekty obniżenia aktywności obu genów się sumują i pojawia się defekt Nie jest specyficzna wobec alleli, występuje też dla alleli null 21
Z ożona haploinsuficjencja (SSNC typu III) Geny nod i ncd u Drosophila w podwójnej heterozygocie defekt mejozy Systematyczne analizy u drożdży: Dla szczepu heterozygotycznego pod względem delecji genu aktyny znaleziono 208 innych heterozygotycznych delecji, które w połączeniu dawały defekty morfologii aktyny 22
Interakcje genetyczne a fizyczne Badania na skalę genomu i proteomu (wysokoprzepustowe) Np. u drożdży dla 1000 genów mapa z ok. 4000 interakcji Dla pojedynczego genu nie będącego niezbędnym (defekt nie jest letalny) średnio 34 interakcje, dla genów niezbywalnych (essential) 5x więcej Globalna sieć (interaktom) powinna zatem mieć ~200 000 interakcji Interakcje fizyczne i genetyczne rzadko się nakładają, choć częściej, niż przewidywano by dla pełnej losowości U drożdży ~1% 23
Interakcje genetyczne ujęcie systemowe Interakcje genetyczne wskazują na związki funkcji Mogą wiązać elementy tego samego szlaku/kompleksu, ale też różnych szlaków, powiązanych funkcją Zestaw interakcji (pozycja na mapie interaktomu genetycznego) może wskazywać na funkcję genu 24
Sieci Dwie własności sieci robustness (krzepkość) odporność na zaburzenie np. mutację jednego z elementów) evolvability potencjał zmienności Zależą od topologii sieci 25
Sieci biologiczne Sieć a) najmniej odporna na zaburzenia, sieć c) najbardziej W sieci a) najwięcej interakcji syntetycznych, w c) - najmniej Sieci biologiczne przypominają typ b) struktura hierarchiczna (scale-free) 26
Sieci biologiczne Przykładowa sieć dla 204 genów drożdżowych 27 Boone et al. Nature Reviews Genetics, 2007 vol. 8 (6) pp. 437
Sieci biologiczne Sieci interakcji biologicznych mają charakter hierarchiczny węzły centralne (hubs) z dużą liczbą połączeń węzły peryferyjne, z małą liczbą połączeń węzły centralne częściej odpowiadają genom niezbywalnym (których defekt jest letalny) Mały świat długość scieżki pomiędzy dwoma węzłami jest niewielka (3.3 u drożdży) Gęste otoczenia lokalne (sąsiedzi danego węzła często oddziałują ze sobą) Podobne właściwości ma np. Internet, sieci interakcji społecznych, liczba Erdősa wśród matematyków 28
Interakcje genetyczne a biologia systemów Badanie sieci interakcji funkcjonalnych na skalę całego organizmu to podstawa biologii systemów Interakcje genetyczne są ważnym elementem takiej sieci Może nawet bardziej, niż interakcje fizyczne Interakcje fizyczne identyfikują kompleksy, interakcje genetyczne mogą pokazać, w jakim kontekście te kompleksy funkcjonują Wszystkie dotychczasowe wyniki są bardzo niekompletne, nawet u drożdży Nie ma biologii systemów bez genetyki 29
30 Ewolucja informacji genetycznej
Czym jest życie? metabolizm + informacja (replikacja)
Cząsteczki organiczne mog y powstać w atmosferze pierwotnej Ziemi Oparin, Haldane Miller, 1953
Co by o najpierw? Metabolizm (Oparin, Dyson) Replikacja (Eigen)
Świat RNA: metabolizm + replikacja RNA może wykazywać aktywność enzymatyczną (metabolizm)
RNA może tworzyć różne struktury
Świat RNA
Problemy świata RNA Ograniczona zdolność magazynowania informacji w pojedynczym replikatorze (ilość informacji możliwej do zakodowania jest odwrotnie proporcjonalna do częstości błędów relikacji granica Eigena) Samolubne RNA w sieci replikatorów Abiotyczna synteza RNA
Jak powsta a informacja genetyczna Powstają pierwsze nici RNA RNA replikuje RNA RNA katalizuje reakcje z udziałem aminokwasów RNA katalizuje tworzenie białek i DNA DNA przejmuje rolę materiału genetycznego
Kto naprawdę rządzi w komórce? DNA replikacja informacji genetycznej przekazywanie jej kolejnym pokoleniom RNA ekspresja i regulacja informacji genetycznej różne funkcje na różnych etapach
RNA w ekspresji genu Obraz klasyczny cetralna hipoteza ( dogmat ) mrna RNA informacyjny trna RNA transportujący (przenosi aminokwasy) rrna RNA rybosomalny
Inne role RNA Sortowanie białek w komórce
Inne role RNA Elementy systemu obróbki RNA snrna składanie mrna
Inne role RNA Elementy systemu obróbki RNA snorna obróbka rrna
RNA katalityczne omas Cech (1982) intron w Tetrahymena sam się wycina Nagroda Nobla 1989
RNA katalityczne Sidney Altman (1983) RNaza P (enzym tnący prekursory trna) składa sie z białka i RNA, to RNA jest katalizatorem Nagroda Nobla 1989
RNA syntetyzuje bia ko
Co potrafią rybozymy? Cięcie RNA, cięcie DNA Ligacja (łączenie) cząsteczek RNA Tworzenie wiązania peptydowego Rybozymy selekcjonowane in vitro potrafią też polimeryzować RNA fosforylować RNA i DNA alkilować i aminoacylować RNA tworzyć i przecinać wiązania amidowe i glikozydowe dołączać kationy metali do grup porfirynowych
RNA jako elementy regulacyjne XIST inaktywacja chromosomu X sirna, mirna, strna itd... - małe cząsteczki RNA regulujące działanie genów
Od świata RNA do pierwszych organizmów Świat RNA Wczesny świat RNA (trna, rybozymy) Proto-rybosomy (proto-rrna, snorna, snrna) Świat RNP Początki syntezy białek katalizatory RNP Katalizatory białkowe, translacja Świat DP DNA komórki Ostatni wspólny przodek Uproszczenie struktury i regulacji proto-eukarionty Endosymbioza prokarionty eukarionty
Historia życia na Ziemi 50
Drzewo ewolucyjne życia?
Powstanie mitochondriów i chloroplastów - endosymbioza
Biologia ewolucyjna? Nothing in Biology Makes Sense Except in the Light of Evolution Theodosius Dobzhansky (1900-1975)
Biologia ewolucyjna? Wiêęc ja ju ż 40 przesz³ło lat mówiêę proz¹ą, nie maj¹ąc o tym najmniejszego pojêęcia! Molière Każdy biolog korzysta z teorii ewolucji, nawet jeżeli nie zdaje sobie z tego sprawy!
Pierwsza synteza Darwinizm + genetyka klasyczna + genetyka populacji Syntetyczna teoria ewolucji Mutacje jako podstawa zmienności ewolucyjnej W populacjach naturalnych występują rozmaite allele wielu genów, nowe powstają w wyniku mutacji Ewolucja jako zmiany częstości alleli w populacji
Pierwsza synteza 4 główne siły ewolucji Mutacje Przepływ genów Dobór naturalny Dryf genetyczny
Druga synteza Darwinizm + genetyka molekularna ewolucja molekularna Molekularne mechanizmy ewolucji Jak zachodzą zmiany sekwencji DNA (i białek), jak ewoluują genomy Jak działa dobór naturalny na poziomie sekwencji Genetyczna kontrola rozwoju w ewolucji ( evo-devo ) Ewolucja molekularna jako narzędzie do poznawania funkcji genów i genomów
Podobieństwo i homologia Homologia: podobieństwo wynikające ze wspólnego pochodzenia ewolucyjnego cecha odziedziczona od wspólnego przodka
Podobieństwo i homologia sekwencji Przy dostatecznie dużym podobieństwie można założyć, że sekwencje są homologiczne Podobne struktury przestrzenne i/lub funkcje mogą być determinowane przez różne sekwencje Liczba możliwych sekwencji aminokwasowych o nietrywialnej długości jest gigantyczna Na poziomie sekwencji praktycznie nie stwierdza się konwergencji, homoplazje są przypadkowe
Rozmiary genomów 60
Rozmiary genomów i liczba genów 61
Skąd się biorą nowe geny Liczba genów w trakcie ewolucji wzrasta Jak powstaje nowa informacja (nowe geny)? 62
Paralogi i ortologi Paralogi geny homologiczne w tym samym genomie, powstałe w wyniku duplikacji genu - np. α-globina i β- globina człowieka Ortologi geny homologiczne powstałe w wyniku specjacji, pochodzące od genu u wspólnego przodka np. α-globina człowieka i α-globina myszy
Nowe geny powstają dzięki duplikacji DNA Duplikacje wewnątrz genu Tasowanie eksonów Duplikacje całych genów Duplikacje fragmentów i całych chromosomów (aneuploidia) Duplikacje genomu (poliploidia, hipoteza 2R)
Duplikacje T.A. Brown. Genomy III, PWN 2009
Duplikacje wewnątrz genu 5 1 2 3 4 5 6 3 Delecja Pierwotny gen trypsynogenu 1 6 5 3 4 duplikacje + dodana sekwencja Wewnętrzne duplikacje Thr Ala Ala Gly 1 6 5 3 Dodana: Gly 5 1 1 2 3 4 5 6 7 37 38 39 40 41 6 3 Gen glikoproteiny chroniącej przed zimnem Dissostichus mawsoni
Ewolucja globin
Ewolucja genów opsyn
Ewolucja widzenia kolorów
Geny HOX regulatory rozwoju
Ewolucja genów HOX Dzięki duplikacjom genów HOX wyewoluowały bardziej złożone plany ciała
Bia ka sk adają się z domen T.A. Brown. Genomy III, PWN 2009 Granice domen i eksonów często się pokrywają
Tasowanie eksonów i domen T.A. Brown. Genomy III, PWN 2009
Wspólne motywy w różnych genach Możemy stawiać hipotezy dotyczące funkcji nieznanych białek na podstawie motywów znajdowanych w sekwencji. Podstawa większości współczesnych badań biochemicznych!!
Homologia genów jako źród o informacji Duplikacje paralogiczne są źródłem nowych genów i nowych funkcji, ale często działających na podobnej zasadzie Np. poszukiwanie nowych enzymów o funkcji zbliżonej do już znanych Geny ortologiczne z reguły (choć nie zawsze) zachowują funkcję organizmy modelowe wnioskowanie o funkcji genów na podstawie badań nad innymi organizmami np myszy, a nawet drożdże jako modele do badania chorób człowieka
Ewolucja sekwencji i dobór naturalny 76
Mutacje a różnice sekwencji wg. Li & Graur, et al., 1991
Tempo zmian sekwencji bia ka Jednostka PAM (Percentage Accepted Mutations): 1 zaakceptowana zmiana/ 100 aminokwasów Granica istotnej homologii 80% Różnice sekwencji 60% 40% 20% 100 200 300 400 PAM
Mutacje a różnice w sekwencji Różnice sekwencji między gatunkami Polimorfizm wewnątrzpopulacyjny Obserwowane są jako różnice te mutacje, które utrwaliły się w populacji całkowicie lub częściowo (polimorfizmy wewnątrzpopulacyjne)
Mutacje Szkodliwe są szybko eliminowane przez dobór negatywny (oczyszczający) Neutralne nie wpływają na funkcję produktu, nie podlegają selekcji Korzystne są szybko utrwalane w populacji przez dodatni dobór naturalny
Teoria neutralna (Kimury) Większość obserwowanych różnic w sekwencjach, zarówno wewnątrzpopulacyjnych, jak i międzygatunkowych to mutacje neutralne, utrwalane przez dryf genetyczny Mutacje niekorzystne są eliminowane i nie obserwujemy ich (modyfikacja mutacje prawie neutralne nie są w pełni eliminowane i mogą się w pewnych warunkach utrwalać) Mutacje korzystne są bardzo rzadkie, mają znaczenie ale w analizach ilościowych są pomijalne
Neodarwinizm (ortodoksyjny) Głównym źródłem różnic między sekwencjami jest dobór naturalny
Teoria neutralna jest zbytnim uproszczeniem, podobnie jak ortodoksyjny selekcjonizm Mutacje neutralne stanowią większość, ale mutacje podlegające doborowi nie są w większości sekwencji pomijalne Niektóre sekwencje ewoluują w sposób bliższy modelowi neutralnemu, w innych wyraźne jest działanie doboru
Tempo zmian bia ka jest kszta towane przez dobór naturalny Tzw. sekwencje zachowawcze (konserwowane) zmieniają się powoli, zmiany eliminowane przez dobór sekwencje o kluczowej i niezmiennej funkcji Sekwencje o mniej znaczącej lub zmieniającej się w toku ewolucji funkcji zmieniają się szybciej
Tempo zmian jednostka: PAM/10 8 lat Jednostka czasu ewolucyjnego: ile lat (w milionach, 10 6 ) potrzeba do utrwalenia 1 mutacji/100 aa (1 PAM)
Zegar molekularny Jeżeli teoria neutralna jest prawdziwa to tempo zmian zależy jedynie od działania doboru negatywnego Tempo zmian będzie różne dla różnych sekwencji ale takie samo w różnych gałęziach drzewa dla danej sekwencji
Czy istnieje zegar molekularny? Nie istnieje globalny zegar prawdziwy we wszystkich gałęziach drzewa dla danej sekwencji Można znaleźć zegary lokalne tempo zmian jest równomierne dla danej sekwencji w określonej grupie organizmów
Jak szukać śladów dzia ania doboru Większość sekwencji genów zmienia się jednostajnie, w tempie wyznaczanym przez eliminację mutacji niekorzystnych zegar molekularny Odstępstwa od jednostajnego tempa w określonej gałęzi dobór specyficzny dla tej gałęzi Orangutan Goryl Szympans Człowiek Orangutan Goryl Szympans Człowiek Orangutan Goryl Szympans Człowiek Równomierne tempo zmian Przyspieszone zmiany Spowolnione zmiany
Gen mowy Rzadka choroba dziedziczna objawiająca się zaburzeniami mowy, niezdolnością do tworzenia struktur składniowych i gramatycznych. Gen FOXP2
FOXP2 szybka ewolucja Enard et al. (2002) Nature 418, 869-72
MYH16 Jedna z form łańcucha ciężkiego miozyny Mutacja ok. 2,5 mln lat temu związek z ewolucją kształtu czaszki osłabienie mięśni szczęki, zmniejszenie twarzoczaszki, wzrost mózgoczaszki
Gen mikrocefaliny Mikrocefalia Chory 13 lat Zdrowy 11 lat Kouprina et al., PLoS Biology, 2004, 5:E126 Szybka ewolucja genu u człowieka
Geny cz owieczeństwa? Nie ma jednego, czy kilku genów człowieczeństwa Za różnice między ludźmi a innymi gatunkami odpowiada kumulacja wielu, pozornie niewielkich, różnic Niewielkie zmiany sekwencji mogą pociągać znaczne zmiany fenotypowe Istotne są też różnice na poziomie regulacji trudniejsze do zbadania
Medycyna ewolucyjna
Medycyna ewolucyjna Dlaczego chorujemy? Przyczyny bezpośrednie Bo zainfekował nas wirus, bo złamaliśmy nogę itp. Przyczyny pierwotne Wyścig ewolucyjny pasożytów i gospodarzy Dlaczego nasze ciało jest zbudowane tak a nie inaczej ewolucyjne kompromisy Historia ewolucji naszych przodków a przystosowanie do współczesnego środowiska Nowotwór jako proces ewolucyjny Dlaczego się starzejemy?
Wyścigi z patogenami Sekwencje genów kodujących białka układu odpornościowego należą do najszybciej zmieniających się w ewolucji Sekwencje białek wirusów, bakterii itp. też szybko się zmieniają Szukając tych obszarów sekwencji, które zmieniają się najszybciej możemy wskazać, które białka powinny być celem dla leków, który szczep wirusa będzie najgroźniejszy itp. Bakterie i wirusy szybko uodparniają się na leki
Szczepionki przeciw grypie Każdego roku powstaje wiele (ok. 10-11) różnych wariantów wirusa. Trzeba przewidzieć, który z nich będzie zagrożeniem w następnym sezonie, żeby przygotować szczepionkę Analiza ewolucyjna wskazała 18 kodonów w genie kodującym hemaglutyninę wirusa, które podlegają silnemu działaniu doboru dodatniego Ten ze szczepów, u którego jest najwięcej zmian w tych kodonach najprawdopodobniej będzie źródłem następnej infekcji Trafność: 9 na11 = 0,818
Ewolucyjna medycyna mitochondrialna Niektóre polimorfizmy mtdna mają znaczenie selekcyjne Warianty zaadoptowane do zimnego klimatu: słabsze sprzężenie OXPHOS z wytwarzaniem ATP, część energii gradientu protonowego rozpraszana w postaci ciepła Warianty zaadoptowane do ciepłego klimatu: wydajne sprzężenie OXPHOS z wytwarzaniem ATP, optymalne wykorzystanie energii z pokarmu
Adaptacje mtdna konsekwencje Ciepły klimat Silne sprzężenie OXPHOS z wytwarzaniem ATP Wydajne wykorzystanie kalorii z pokarmu W połączeniu z wysokokaloryczną dietą zwiększone wytwarzanie ROS Krótszy czas życia Podatność na choroby degeneracyjne (np. AD), cukrzycę. Zimny klimat Słabsze sprzężenie OXPHOS z wytwarzaniem ATP Mniej wydajne wykorzystywanie kalorii z pokarmu, termogeneza Mniejsze wytwarzanie ROS przy diecie wysokokalorycznej Długowieczność Mniejsza zapadalność na choroby degeneracyjne (AD, PD, cukrzyca). Mniejsza zapadalność na choroby związane z defektami OXPHOS (np. LHON). Większa zapadalność na choroby związane z defektami OXPHOS (np. LHON).