BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. XLII, 2009, 3, str. 945 949 Agnieszka Białek, Andrzej Tokarz, Alicja Wiśniowska WPŁYW RÓŻNORODNYCH CZYNNIKÓW DIETETYCZNYCH NA ZAWARTOŚĆ KWASU ŻWACZOWEGO (cis -9, trans-11 CLA) I PROFIL KWASÓW TŁUSZCZOWYCH W SUROWICY SZCZURÓW. Cz. I. Katedra i Zakład Bromatologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego Kierownik: prof. nadzw. dr hab. A. Tokarz W pracy zbadano zależności pomiędzy dietą zróżnicowaną pod względem wartości odżywczej i podaży kwasów tłuszczowych na zawartość kwasu cis-9, trans-11 oktadekadienowego i profil kwasów tłuszczowych w surowicy szczurów. Dodatek olejów roślinnych i rybnych istotnie wpływał na zawartość kwasu żwaczowego w surowicy. Hasła kluczowe: sprzężone dieny kwasu linolowego (CLA), kwas żwaczowy, kwasy tłuszczowe. Key words: conjugated linoleic acid (CLA), rumenic acid, fatty acids. Dieta stanowi główne źródło kwasów tłuszczowych niezbędnych dla prawidłowego funkcjonowania organizmu, nie tylko jako najwartościowszego źródła energii, ale także jako związków o różnorodnych funkcjach fizjologicznych. Grupą kwasów tłuszczowych o niebagatelnym znaczeniu dla zachowania zdrowia są sprzężone dieny kwasu linolowego (CLA ang. Conjugated Linoleic Acid). Stanowią one grupę izomerów kwasu oktadekadienowego, w łańcuchu węglowym których wiązania podwójne tworzą układ sprzężony, tzn. oddziela je jedno wiązanie pojedyncze. Na podstawie licznych badań stwierdzono, że wykazują one działanie przeciwnowotworowe, przeciwmiażdżycowe, redukujące masę tkanki tłuszczowej, poprawiające przyrost masy mięśniowej, stymulujące wzrost organizmu (m.in. poprzez przyrost masy kostnej) itd. (1). Ich naturalnym źródłem dietetycznym są mleko i przetwory mleczarskie oraz mięso zwierząt poligastrycznych, gdzie ponad 90% całkowitej puli CLA stanowi kwas cis-9, trans-11 oktadekadienowy tzw. kwas żwaczowy (RA ang. Rumenic Acid). Powstaje on na drodze przemian nienasyconych kwasów tłuszczowych w żwaczu przeżuwaczy pod wpływem enzymów bakterii symbiotycznych, oraz endogennie z kwasu trans-11 oktadekenowego kwasu wakcenowego (VA ang. Vaccenic Acid) przy udziale Δ 9 desaturazy (2, 3). O ile u zwierząt poligastrycznych większość puli CLA jest pochodzenia endogennego, o tyle u ludzi podstawowe znaczenie ma pobranie CLA z dietą (4). Oznaczenie poziomu CLA w surowicy może stanowić dobry wskaźnik jego pobrania z dietą (5). Jednocześnie ze względu na podobieństwo w budowie CLA może np. wchodzić w interakcje z innymi kwasami tłuszczowymi (6), czego obrazem może być zmiana profilu kwasów tłuszczowych w surowicy krwi.
946 A. Białek i inni Nr 3 Celem podjętych badań było określenie wpływu diety na zawartość sprzężonych dienów kwasu linolowego i innych kwasów tłuszczowych w surowicy krwi szczurów, których dietę modyfikowano poprzez zastosowanie dodatkowego czynnika dietetycznego. MATERIAŁ I METODY Badania prowadzono na samcach szczurów Wistar. Zwierzęta pochodziły ze zwierzętarni Instytutu Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. M. Mossakowskiego PAN w Warszawie. Badania uzyskały akceptację Komisji Etycznej ds. badań na zwierzętach Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Zwierzęta podzielono na 6 grup po 8 osobników każda: gr. kontrolna pasza (Labofeed H) i woda w ilości ad libitum, gr. 1/2 dieta o zredukowanej o połowę wartości odżywczej tj. każdy szczur otrzymywał dziennie 5 g paszy, gr. omega 3 od 70 dnia życia oprócz paszy preparat Omega 3 (firmy Lysi) w ilości 0,4 ml podawany za pomocą sondy dożołądkowej, gr. słonecznikowy, gr. oliwa, gr. rzepakowy od 70 dnia życia oprócz paszy odpowiedni olej w ilości 0,4 ml podawany za pomocą sondy dożołądkowej, Do badań wykorzystano surowicę krwi pozyskaną poprzez odwirowanie świeżo pobranej krwi przy 3000 obr/min przez 10 min, która do momentu badania była przechowywana w temperaturze 60 C. Z surowicy pochodzącej od jednego szczura wykonano trzy równoległe oznaczenia. Estry metylowe kwasów tłuszczowych przygotowano według procedury zaproponowanej przez Bondia-Pons i współpr. (5). Profil kwasów tłuszczowych oznaczono metodą chromatografii gazowej z detekcją płomieniowo-jonizacyjną stosując kolumnę Rtx 2330 (40 m 0,18 mm i.d., 0,1 μm grubość filmu). Warunki analizy: temperatura komory nastrzykowej 250 C, temperatura detektora 270 C, program temperaturowy pracy kolumny 140 C przez 1 min, przyrost temperatury do 170 C z szybkością 20 C/min., temperatura 170 C przez 20 min., przyrost temperatury do 230 C z szybkością 10 C/min, temperatura 230 C przez 15 min. Całkowity czas analizy 41 min. Interpretację jakościową chromatogramów przeprowadzono porównując czasy retencji estrów metylowych kwasów tłuszczowych badanej próbki z czasami retencji wzorców estrów metylowych sprzężonych dienów kwasu linolowego (CLA Methyl firmy NuCheckPrep) oraz wzorcami estrów metylowych kwasów tłuszczowych Supelco 37 Component FAME Mix. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej za pomocą programu Statistica 8.0 PL (StatSoft Polska). WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Udział procentowy poszczególnych kwasów tłuszczowych w całkowitej puli kwasów tłuszczowych obecnych w surowicy zaprezentowano w tabeli I. Skład procentowy poszczególnych diet stosowanych w badaniu przedstawiono w tabeli II. Wystąpiły istotne statystycznie różnice pomiędzy poszczególnymi grupami dietetycznymi w zawartości następujących kwasów tłuszczowych: C12:0, C14:0, C15:0, C16:0,
Nr 3 947 Zawartość kwasu żwaczowego i profil kwasów tłuszczowych u szczurów. Cz. I Tabela I. Skład puli kwasów tłuszczowych w surowicy krwi badanych grup dietetycznych (jednakowe litery oznaczają istotne statystycznie różnice pomiędzy grupami w zawartości danego kwasu tłuszczowego) Table I. Fatty acids profile in serum of investigated dietary groups (identical letters stand for significant differences among groups in a specific fatty acid content) Gr. kontrolna Gr. 1/2 Gr. Omega 3 Gr. Słonecznikowy Gr. Oliwa Gr. Rzepakowy Kwas tłuszczowy X ± SD C6:0 nd. nd. nd. nd. 00,26 ± 0,17 nd. C8:0 nd. nd. nd. nd. nd. nd. C10:0 00,09 ± 0,09 nd. nd. nd. 00,07 ± 0,02 00,04 ± 0,00 C11:0 00,06 ± 0,02 nd. nd. nd. 00,06 ± 0,01 00,05 ± 0,01 C12:0 00,05 ± 0,0 a 00,04 ± 0,02 a 00,13 ± 0,22 a 00,04 ± 0,02 a 00,11 ± 0,04 a 00,05 ± 0,01 a C13:0 00,06 ± 0,03 00,05 ±0,04 00,07 ± 0,04 00,07 ± 0,05 00,08 ± 0,03 00,05 ± 0,02 C14:0 00,36 ± 0,04 a 00,31 ± 0,08 a 00,40 ± 0,04 a,b 00,33 ± 0,04 a 00,49 ± 0,03 a 00,29 ± 0,03 a,b C15:0 00,36 ± 0,05 00,26 ±0,02 a 00,36 ± 0,05 00,36 ± 0,00 00,47 ± 0,03 a 00,41 ± 0,02 C16:0 18,76 ± 1,04 19,60 ± 0,74 a 18,38 ± 1,22 18,76 ± 0,86 19,07 ± 1,31 16,96 ± 0,46 a C16:1 01,42 ± 0,2 a, b 01,40 ± 0,19 a, b 01,34 ± 0,15 a, b 01,31 ± 0,14 a 00,79 ± 0,14 a, b 00,49 ± 0,15 b C17:0 nd. 00,25 ± 0,02 00,40 ± 0,00 nd. 00,51 ± 0,06 nd. C17:1 00,09 ± 0,01 00,06 ± 0,01 nd. 00,09 ± 0,01 00,10 ± 0,03 nd. C18:0 10,32 ± 1,04 11,04 ± 0,39 a 10,59 ± 0,37 09,81 ± 0,62 a 11,03 ± 0,95 a 10,59 ± 0,26 C18:1 n9 OL 07,08 ± 1,40 07,86 ± 0,52 a 06,50 ± 0,47 a 07,39 ± 0,76 07,84 ± 1,21 07,48 ± 0,60 C18:2 n6 LA 18,54 ± 2,16 17,31 ± 0,65 17,44 ± 0,77 18,56 ± 1,18 17,66 ± 1,95 17,01 ± 0,47 C18:3 n6 GLA 00,17 ± 0,02 00,24 ± 0,04 a, b 00,15 ± 0,02 b 00,19 ± 0,03 00,17 ± 0,03 a 00,20 ± 0,02 C18:3 n3 ALA 08,88 ± 2,31 07,57 ± 1,17 a 09,83 ± 0,86 08,62 ± 1,58 06,46 ± 3,43 a 11,20 ± 0,97 a C20:0 nd. nd. nd. nd. nd. nd. cis-9, trans-11 CLA 00,09 ± 0,01 b, c 00,07 ± 0,01 a, b, c, d 00,08 ± 0,01 a 00,09 ± 0,01 b, d 00,10 ± 0,02 a, b 00,12 ± 0,00 b C20:1 nd. 00,36 ± 0,03 nd. nd. nd. nd. C21:0 nd. 00,10 ± 0,00 00,19 ± 0,08 00,11 ± 0,05 00,26 ± 0,00 00,14 ± 0,04 C20:2 nd. 00,13 ± 0,03 00,14 ± 0,01 nd. 00,15 ± 0,02 00,18 ± 0,01 C20:4 n6 AA 20,76 ± 2,94 20,34 ± 1,27 19,60 ± 1,55 22,23 ± 2,08 20,83 ± 2,20 21,02 ± 0,68 C22:0 00,21 ± 0,02 nd. nd. nd. 00,23 ± 0,04 00,22 ± 0,03 C22:1 nd. nd. nd. nd. nd. 00,05 ± 0,01 C20:5 n3 EPA 01,51 ± 0,19 c 02,33 ± 0,30 a, c, d 02,64 ± 0,68 a, c, e 01,09 ± 0,15 a, b, d, e 01,73 ± 0,25 a 01,89 ± 0,15 b C24:0 nd. nd. nd. nd. nd. nd. C24:1 nd. 00,12 ± 0,03 00,10 ± 0,02 00,10 ± 0,03 00,07 ± 0,04 nd. C22:6 n3 DHA 02,64 ± 0,39 a 02,75 ± 0,24 a 03,68 ± 0,52 a 02,65 ± 0,53 a 02,55 ± 0,54 a 02,37 ± 0,25 a
948 A. Białek i inni Nr 3 Tabela II. Udział procentowy poszczególnych kwasów tłuszczowych w stosowanych dietach Table II. Percentage distribution of fatty acids in applied diets Kwasy tłuszczowe Pasza oliwa ol. rzepakowy omega-3 ol. słonecznikowy C14:0 0,19 0,11 0,12 3,81 0,15 C16:0 15,80 13,89 11,41 17,29 12,18 C16:1 nd. 0,39 nd. 3,69 0,03 C18:0 3,83 3,16 3,25 3,56 4,00 C18:1 n9 18,34 39,06 33,57 14,54 20,66 C18:1 n7 nd. nd. 1,33 nd. 0,23 C18:2 n6 36,57 25,86 30,52 22,29 47,29 C18:3 n3 20,84 12,55 17,08 12,78 12,66 C20:1 nd. nd. nd. nd. 0,11 C20:4 AA 0,31 0,18 0,19 0,69 0,19 C20:5 EPA nd. nd. nd. 6,01 nd. C22:6 DHA nd. nd. nd. 3,92 nd. C16;1, C18;0, C18:1 n-9, C18:3 n-6, C18;3 n-3, cis-9, trans-11 CLA, C20:5 n-3, C22:6 n-3. Najwyższe poziomy kwasu cis-9, trans-11 CLA oznaczono w grupie suplementowanej olejem rzepakowym (0,12±0,001%), zaś najniższą zawartością tego związku charakteryzowała się grupa 1/2 (0,07±0,01%). Spośród zastosowanych modyfikacji diety pozytywnie na zawartość kwasu żwaczowego w surowicy oddziaływał dodatek oleju rzepakowego (p = 0,002275), zaś wyraźne negatywne działanie stwierdzono w przypadku obniżenia wartości odżywczej diety (p = 0,019820). Ponadto w grupie o obniżonej wartości odżywczej diety zaobserwowano wyższe stężenia długołańcuchowych kwasów n-3 oraz GLA. Grupa spożywająca preparat omega 3 charakteryzowała się najwyższymi stężeniami kwasów DHA i EPA, odpowiednio 3,68±0,52% i 2,64±0,68%, co było obrazem zdecydowanie większego pobrania tych kwasów z dietą. Jednocześnie w surowicy tych zwierząt notowano najniższe poziomy kwasu arachidonowego oraz kwasu oleinowego. Podobne wyniki uzyskali Jelińska i współpr., którzy po zastosowaniu wzbogacania diety szczurów w olej rybny obserwowali zdecydowanie wyższe poziomy kwasów DHA i EPA oraz niższe poziomy kwasu AA w fosfolipidach izolowanych z wątroby (7). Również udział kwasu żwaczowego w całkowitej puli kwasów tłuszczowych był niższy w tej grupie. Potwierdza to wyniki uzyskane przez Valeille i współpr., którzy wykazali, że CLA konkuruje z kwasami n-3 obecnymi w olejach rybnych na poziomie jądrowych czynników transkrypcyjnych, takich jak receptory PPAR, gdyż dodatek oleju rybnego do diety wzbogaconej w CLA niweluje działanie tego ostatniego (8). Najwyższy odsetek stanowił kwas α-linolenowy w surowicy szczurów z grupy z dodawanym olejem rzepakowym średnio 11,20±0,97%, co jest wynikiem jego dużego pobrania z dietą z racji dużej zawartości tego kwasu tłuszczowego w oleju rzepakowym (11,25% całkowitej zawartości kwasów tłuszczowych) (9). Nieomal o połowę niższą
Nr 3 949 Zawartość kwasu żwaczowego i profil kwasów tłuszczowych u szczurów. Cz. I zawartością ALA charakteryzowała się surowica grupy otrzymującej oliwę 6,46± 3,43. Nie zaobserwowano zaś żadnych istotnych statystycznie różnic w poziomach kwasu linolowego pomiędzy badanymi grupami. Kwas linolowy stanowił główny składnik puli kwasów tłuszczowych zawartych w paszy i jego pobranie z dietą w każdej grupie było duże. WNIOSKI 1. Skład puli kwasów tłuszczowych w surowicy szczurów zależy od składu puli kwasów tłuszczowych przyjmowanych z dietą. 2. Dodatek olejów roślinnych i rybnych wpływa na poziomy kwasu żwaczowego w surowicy. 3. Dieta o obniżonej wartości odżywczej negatywnie wpływa na poziomy kwasu cis-9, trans-11 CLA w surowicy. A. Białek, A. Tokarz, A. Wiśniowska EFFECTS OF VARIED DIETARY FACTORS ON RUMENIC ACID (CIS -9, TRANS-11 CLA) AND FATTY ACIDS PROFILE IN RATS SERUM. Abstract Rumenic acid (cis-9, trans-11 octadecadienoic acid) is a basic CLA isomer which occurs in the greatest amount in dairy fat of all natural fats. CLA has been attributed many beneficial effects in prevention of different types of cancer, atherosclerosis, hypertension and obesity reduction. The aim of our study was to estimate the impact of olive oil, sunflower oil, rape oil and fish oil as well as nutritive value reduction on rumenic acid and other fatty acids profile in serum of rats. An increased consumption of rape and olive oil increased cis-9, trans-11 CLA concentration while addition of fish oil rich in omega 3 fatty acids decreased it s amount. Reduction of nutritive value of diet also caused the decline in CLA content in rats serum. Different dietary factors can influence the rumenic acid and other fatty acids content in serum. PIŚMIENNICTWO 1. Bhattacharya A., Banu J., Rahman M., Causey J., Fernandes G.: Biologigal effects of conjugated Linoleic acids in health and disease. J. Nutr. Biochem., 2006; 17: 789-810. 2. Tanaka K.: Occurrence of conjugated linoleic acid in ruminant products and its physiological functions. Animal Science Journal, 2005; 76: 291-303. 3. Mosley E.E., Shafii B., Moate P.J., McGuireM.A.: cis-9, trans-11 Conjugated Linoleic Acid Is Synthesized Directly from Vaccenic Acid in Lactating Dairy Cattle. J. Nutr., 2006; 136: 570-575. 4. Pariza M.W., Park Y., Cook M.E.: The biologically active isomers of conjugated linoleic acid, Progress in Lipid Research, 2001; 40: 283-298. 5. Bondia-Pons I., Molto-Puigmarti C., Castellote A. I., Lopez Sabater M. C.: Determination of conjugated Linoleic acid in human plasma by gas chromatography, J. Chromat. A, 2007; 1157: 422-429. 6. Banni S., Angioni E., Casu V., Melis M. P., Carta G., Corongiu F. P., Thompson H., Ip C.: Decrease in linoleic acid metabolites as a potential mechanism in cancer risk reduction by conjugated linoleic acid, Carcinogenesis, 1999; 20(6): 1019-1024. 7. Jelińska M., Tokarz A., Olędzka R., Czorniuk-Śliwa A.: Effects of dietary linseed, evening primrose or fish ols on fatty acid and prostaglandin E 2 contents in the rat livers and 7,12-dimethylbenz[a]anthracene-induced tumours, Biochim. Biophys. Acta, 2003; 1637(3): 193-199. 8. Valeille K., Gripois D., Bloquit M.-F. et al.: Lipid atherogenic risk markers can be more favorably influenced by the cis-9,trans-11-octadecadienoate isomer than a conjugated linoleic acid mixture or fish oil in hamsters. Br. J. Nutr., 2004; 91: 191-199. 9. Jelińska M.: Kwasy tłuszczowe czynniki modyfikujące procesy nowotworowe, Biul. Wydz. Farm WUM, 2005, 1. Adres: 02-097 Warszawa, ul. Banacha 1.