RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 160927 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 17.03.04 047279.4 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 09.01.08 Europejski Biuletyn Patentowy 08/02 EP 160927 B1 (13) T3 (1) Int. Cl. A61K31/ A61P31/04 A61P31/ (06.01) (06.01) (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Pochodne guanidyny na bazie diaminy o działaniu przeciwdrobnoustrojowym (30) Pierwszeństwo: AT03000043.03.03 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 21.12.0 Europejski Biuletyn Patentowy 0/1 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 30.06.08 Wiadomości Urzędu Patentowego 06/08 (73) Uprawniony z patentu: Geopharma ProduktionsgmbH, Wien, AT PL/EP 160927 T3 (72) Twórca (y) wynalazku: GEORGOPOULOS Apostolos, Wien, AT (74) Pełnomocnik: Sulima Grabowska i Sierzputowska Biuro Patentów i Znaków Towarowych sp.j. rzecz. pat. Sulima Zofia 00-96 Warszawa skr. poczt. 6 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
SGS-2/VAL EP 1 60 927 B1 Opis 2 30 [0001] Wynalazek dotyczy leku o działaniu przeciwdrobnoustrojowym lub mikrobobójczym. [0002] Opracowywanie nowych antybiotyków, zwłaszcza w ostatnich latach, to ciągły wyścig z rosnącym rozwojem oporności drobnoustrojów. Leczenie zakażeń szpitalnych, często powodowanych przez oporne drobnoustroje, stanowi jeden z największych problemów szpitali na całym świecie. Zakażenia w dziedzinie dermatologii, takie jak zakażenia po oparzeniach skóry, zakażenia ran, odleżyny lub trądzik, często wymagają dłuższego leczenia antybiotykami. Równocześnie często obserwuje się rozwój oporności u szczepów gronkowców i Pseudomonas. Problemem terapeutycznym są też zakażenia przewodu pokarmowego przez Helicobakter pylori. Ponadto problemy terapeutyczne mogą stwarzać zapalenia spojówek, zakażenia otolaryngologiczne i obszary rozrodcze, powodowane przez bakterie lub wirusy. [0003] Celem wynalazku jest dostarczenie nowego leku, który wykazuje zwiększoną aktywność w stosunku do wielu drobnoustrojów. [0004] Zgodnie z wynalazkiem ten cel osiąga się dzięki zastosowaniu polimerowej pochodnej guanidyny na bazie diaminy zawierającej łańcuchy oksyalkilenowe między dwiema grupami aminowymi, przy czym pochodna guanidyny stanowi produkt polikondensacji soli addycyjnej guanidyny z kwasem z diaminą, która zawiera łańcuchy polioksyalkilenowe między dwiema grupami aminowymi, a także jej farmaceutycznie dopuszczalnych soli, do wytwarzania leku skutecznie działającego przeciwko drobnoustrojom. [000] Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania soli polioksyalkilenoguanidyny wytwarzanych z użyciem trietylenoglikolodiaminy (względna masa cząsteczkowa: 148), polioksypropylenodiaminy (względna masa cząsteczkowa: 230) oraz polioksyetylenodiaminy (względna masa cząsteczkowa: 600). [0006] Jako substancję czynny szczególnie korzystny jest poli[chlorowodorek 2-(2-etoksyetoksyetylo)guanidyniowy] zawierający co najmniej 3 grupy guanidyniowe o średniej masie cząsteczkowej szczególnie w zakresie 00 do 3000 D. [0007] Stosowane zgodnie z wynalazkiem polimerowe pochodne guanidyny są znane z PCT/AT01/00134. [0008] Korzystne reprezentatywne związki stosowane zgodnie z wynalazkiem oraz potwierdzenie ich skuteczności przeciwdrobnoustrojowej opisano poniżej. Jako przykład stosowanej zgodnie z wynalazkiem klasy związków będzie poniżej opisana skuteczność prze-
2 2 30 3 ciwdrobnoustrojowa poli[chlorowodorku 2-(2-etoksyetoksyetylo)guanidyniowego] o średniej masie cząsteczkowej 00 D (CAS nr 37472-91-). [0009] W celu otrzymania tego związku rozpuszczono 4,43 moli chlorowodorku guanidyniowego w 4,03 mola trietylenoglikolodiaminy w 0 C. Następnie mieszaninę ogrzano do 1 C i mieszano w tej temperaturze przez 2 godziny. Następnie utrzymywano tę temperaturę przez 2 godziny, po czym przyłożono próżnię (0,1 bara) i mieszano przez kolejne dwie godziny pod próżnią w 170 C. Następnie doprowadzono powietrze do normalnego ciśnienia, pozwolono by mieszanina ostygła do 1 C i rozcieńczono ją demineralizowaną wodą do około 0%. Zobojętniono ją do ph około 6 za pomocą kwasu fosforowego, pozostawiono do ostygnięcia i rozcieńczono do pożądanego stężenia. Oznaczona masa cząsteczkowa wynosi 00 D. [00] Substancja czynna, poli[chlorowodorek 2-(2-etoksyetoksyetylo)guanidyniowy] wykazuje przy niskiej toksyczności i dobrej tolerancji z farmakologicznego punktu widzenia korzystne właściwości farmakodynamiczne, a zatem może być stosowana jako lek w terapii przeciwdrobnoustrojowej. W szczególności substancja czynna wykazuje doskonałą skuteczność przeciwdrobnoustrojową, którą można wykazać w badaniach przeprowadzonym na wielu różnych drobnoustrojach, takich jak bakterie wielooporne (które są oporne na zwykle stosowane antybiotyki), grzyby (drożdże, dermatofity, grzyby pleśniowe) i wirusy, takie jak Herpes simplex. Ze względu na szybkie działanie mikrobobójcze w zasadzie nie należy oczekiwać rozwoju oporności, co także wykazały badania na większej liczbie szczepów bakterii (30 szczepów bakterii i 30 pasaży). [0011] Po podaniu ogólnoustrojowym (dożylnie lub dootrzewnowo) poli[chlorowodorku 2-(2-etoksyetoksyetylo)guanidyniowego] w ilości do mg/kg masy ciała, u szczura w surowicy krwi stwierdzono stężenia do 0 µg/ml po dwóch godzinach przy równoczesnej dobrej tolerancji. Te stężenia są znacznie wyższe niż oczekiwany poziom potrzebny przy zastosowaniu terapeutycznym. Równocześnie przy tej wysokiej dawce zaobserwowano dobrą tolerancję, nie było przypadków zgonów ani ciężkich działań ubocznych. Tak więc poli[chlorowodorek 2-(2-etoksyetoksyetylo)guanidyniowy] może być stosowany jako środek przeciwdrobnoustrojowy. [0012] Jako środek leczniczy substancję czynną można stosować w odpowiedniej postaci leku, samą lub razem z nieorganicznymi lub organicznymi farmakologicznie biernymi środkami pomocniczymi. Przykładowo substancję można stosować jako składnik maści lub roztworu, przy czym stężenie może wynosić w maści około 0,01 do g substancji czynnej na g maści, a w roztworze może odpowiadać stężeniu do mg/kg masy ciała. Ze względu na wymienione korzystne właściwości farmakologiczne stosowanie w postaci
3 maści lub roztworu jest korzystne przy różnych wskazaniach. W tym przypadku bierze się pod uwagę szczególnie zakażenia skóry, błon śluzowych, oczu lub przewodu pokarmowego. W tych zakresach substancja czynna według wynalazku może mieć znaczący udział w unikaniu oporności na antybiotyki. Skuteczność przeciwdrobnoustrojowa [0013] W celu sprawdzenia działania przeciwdrobnoustrojowego przebadano 334 drobnoustroje, stanowiące klinicznie odpowiednie izolaty i szczepy ATCC jako drobnoustroje odniesienia pod kątem minimalnego stężenia hamującego (MHK). Badano również niszczenie zarazków w zależności od czasu i stężenia (krzywe niszczenia), a także możliwość rozwoju oporności. 1. Drobnoustroje: [0014] W sumie zbadano 323 bakterie różnych gatunków, drożdży oraz jeden dermatofit. Badane drobnoustroje wyizolowano standardowymi metodami laboratoryjnymi z dróg oddechowych, dróg moczowo-płciowych, krwi i innych materiałów biologicznych pacjentów i dokładnie scharakteryzowano je. 2. Testowana substancja: [00] Jako roztwór wyjściowy stosowano opisany powyżej poli[chlorek C2-(2-etoksy)etoksyetylo)guanidiowy] (masa cząsteczkowa: 00 D) w 2% roztworze wodnym. Rozcieńczano go jałową wodą do odpowiedniego stosowanego stężenia. Testowane substancje przechowywano w temperaturze pokojowej. 3. Oznaczanie najmniejszego stężenia hamującego (MHK): [0016] Aktywność testowanej substancji zbadano metodą mikrorozcieńczania w bulionie 2 30 Muellera-Hintona według zaleceń NCCLS. Inokulum drobnoustrojów wynosiło co najmniej x CFU/ml, a inkubację prowadzono przez 16 do godzin w 36 C/powietrze otoczenia. Substancję czynną stosowano w stężeniu od 00 µg/ml do 0,001 µg/ml. [0017] Najniższe stężenie substancji czynnej przy którym nie był widoczny wzrost bakterii, określono jako MHK. Przy każdym teście stosowano także szczepy kontroli jakości ATCC o znanym MHK. 4. Rozwój oporności: [0018] W oparciu o wartości MHK 30 szczepów bakterii zastosowano w doświadczeniach nad rozwojem oporności: Zarazki Gram-dodatnie: MSSA (n=1), MRSA (n=2), MRSE (n=4), VRE (n=), S. aureus ATCC 29213.
4 Zarazki Gram-ujemne: E. coli o wielorakiej oporności (n=4), Klebsiella pneumoniae (n=1), Klebsiella oxytoca (n=1), Pseudomonas aeruginosa (n=4), Pseudomonas aeruginosa o wielorakiej oporności (n=4), Acinetobacter sp. (n=2) i E. coli ATCC 3218 i 2922. [0019] Wszystkie szczepy inkubowano z testowaną substancją w stężeniu od 00 µg/ml do 0,001 µg/ml przez 24 godziny. Probówki, w których stwierdzano wzrost bakterii po pierwszym pasażu, stosowano jako inokulum do drugiego pasażu. W przypadku każdego szczepu bakterii przeprowadzono 30 pasaży, przy czym nowe MHK zawsze porównywano z MHK z początku doświadczenia (pierwszy pasaż).. Niszczenie zarazków w zależności od czasu i stężenia: [00] Aby zbadać potencjał mikrobobójczy substancji czynnej, zastosowano po dwa wielooporne szczepy gronkowców, enterokoków, E. coli i Pseudomonas aeruginosa. [0021] Szybkość niszczenia badano po dodaniu (czas 0) zawiesiny bakterii (1x6 do 2 30 x6 CFU/ml) (czas 0) oraz po 2,, i 30 minutach. [0022] W tych doświadczeniach osiągnięto ilościowe zmniejszenie ilości zarazków w każdym punkcie czasowym i przy każdym stężeniu. Substancję czynną stosowano w stężeniach %, 1%, 0,1% i 0,001%. Jako kontrolę włączono także próbę bez substancji czynnej. 6. Minimalne stężenie hamujące (MHK): [0023] Wyniki badania MHK zestawiono w tabelach 1 do. [0024] W przypadku Staphylococcus aureus i Staphylococcus epidermidis substancja czynna wykazywała, niezależnie od profilu oporności izolatów w stosunku do antybiotyków, bardzo dobre działanie z wartościami MHK od 4 do 32 µg/ml. Także wielooporne gronkowce (MRSA) wykazywały MHK w tym zakresie (tabela 1). [002] Testy w przypadku Enterococcus faecalis także dały wartości MHK 16 do 32 µg/ml (tabela 1), przy czym wielooporne i oporne na wankomycynę szczepy enterokoków (n=) również nie różniły się od wrażliwych izolatów. [0026] Enterobacteriacae: W odniesieniu do E. coli, gatunków Klebsiella, gatunków Enterobacter i Proteus mirabilis substancja czynna dała bardzo dobre wyniki z wartościami MHK od 4 do 32 µg/ml (tabela 2). [0027] Bardzo dobre działanie stwierdzono w przypadku testowanych Salmonella, Shigella i Yersinia enterocolitica (tabela 3). [0028] Grupa niefermentująca, Pseudomonas aeruginosa i gatunki Acinetobacter, także okazała się wrażliwa na substancję czynną z wartościami MHK od 4 do 32 µg/ml (tabela 3). [0029] Także w tym przypadku dla pięciu izolatów Pseudomonas, które są oporne na szereg znaczących klinicznie antybiotyków, stwierdzono dobre działanie substancji czynnej
2 stosowanej zgodnie z wynalazkiem. [0030] Substancja czynna była równie skuteczna w stosunku do Mycobacterium tuberculosis, avium complex, kansaii i gordonae (tabela 4) z wartościami MHK od 16 do 32 µg/ml. [0031] Testowanie klinicznie znaczących gatunków grzybów, takich jak Candida albicans, Candida tropicalis i Candida parapsilosis (drożdże) oraz Trichophyton mentagrophyte, (dermatofit), wykazała także bardzo dobre działanie przeciwgrzybowe (wartości MHK od 8 do 32 µg/ml) (tabela ). 7. Rozwój oporności: [0032] W tym celu zbadano w sumie 30 zarazków z dziewięciu różnych patogennych gatunków bakterii, zarazki Gram-dodatnie, takie jak Staphylococcus aureus i epidermidis, jak i zarazki Gram-ujemne, takie jak E.coli, Klebsiella spp., Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter spp. Testowano zarówno wrażliwe szczepy ATCC, jak i wielooporne izolaty kliniczne. [0033] W obu grupach nie zaobserwowano rozwoju oporności po 30 pasażach, czyli nie stwierdzono podwyższenia wartości MHK. 8. Niszczenie zarazków w zależności od czasu i stężenia: [0034] W celu oceny bakteriobójczych właściwości substancji czynnej określono szybkość niszczenia bakterii. [003] W doświadczeniach stosowano po dwa szczepy Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E.coli i Pseudomonas aeruginosa. [0036] W przypadku Staphylococcus aureus, E.coli i Pseudomonas aeruginosa zdolność niszczącą substancji czynnej aż do stężenia 0,01% wystąpiła bezpośrednio po dodaniu inokulum (0 do 30 sekund). [0037] W przypadku enterokoków do zniszczenia zarazków przy stężeniu substancji czynnej 0,01% potrzebny był czas od do 30 minut. Tabela 1. Skuteczność w stosunku do bakterii Gram-dodatnich Gatunek Liczba szczepów n (%) z MHK (w mg/l) 4 8 16 32 MSSA (n = 3) 0 (0) 6 (17,1) (7,1) 9 (2,8) MRSA (n = 60) 3 () (16,7) 38 (63,3) 9 () Enterococcus faecalis (n = 32) 0 (0) 0 (0) 16 (0) 16 (0)
6 Tabela 2. Skuteczność w stosunku do Enterobacteriacae Gatunek Liczba szczepów n (%) z MHK (w mg/l) 4 8 16 32 Klebsiella spp. (n = 43) 0 (0) (11,6) 18 (41,9) (46,) Escherichia coli (n = 9) 2 (3,4) 17 (28,8) 39 (66,1) 1 (1,7) Enterobacter spp. (n = 17) 1 (,9) 1 (,9) 12 (70,6) 3 (17,6) Proteus spp. (n = 7) 0 (0) 0 (0) 3 (42,9) 4 (7,1) Tabela 3. Skuteczność w stosunku do bakterii Gram-ujemnych Gatunek Liczba szczepów n (%) z MHK (w mg/l) 4 8 16 32 Pseudomonas spp.. (n = ) 1 (1,8) (9,1) 32 (8,2) 17 (30,9) Acinetobacter spp. (n = 2) 0 (na) 0 (na) 1 (na) 1 (na) Salmonella spp. (n = 6) 0 (na) 2 (na) 4 (na) 0 (na) Shigella spp. (n = 2) 0 (na) 0 (na) 1 (na) 1 (na) Yersinia enterocolitica (n = 1) 0 (na) 0 (na) 0 (na) 1 (na) Tabela 4. Skuteczność w stosunku do mykobakterii Gatunek Liczba szczepów n (%) z MHK (w mg/l) 4 8 16 32 Mycobacterium spp. (n = 6) 0 (na) 0 (na) (na) 1 (na) Tabela. Skuteczność w stosunku do grzybów Gatunek Liczba szczepów n (%) z MHK (w mg/l) 4 8 16 32 Candida spp. (n = ) 0 (na) 1 (na) 3 (na) 6 (na) Trichophyton mentagrophytes (n =1) 0 (na) 0 (na) 1 (na) 0 (na)
7 Skuteczność kliniczna [0038] Aby potwierdzić dobrą aktywność substancji czynnej in vitro, substancję badano w warunkach klinicznych na ochotnikach z trudnymi do leczenia zakażeniami. Substancję stosowano w roztworze wodnym albo w postaci żelu o stężeniu 0,%. Pacjenci [0039] 12 pacjentów w wieku od 3 do 62 lat leczono substancją czynną. 2 pacjentów z przewlekłym zapaleniem przewodu pokarmowego (Helicobacter pylori - dodatnich) 3 pacjentów z przewlekłym zapaleniem dziąseł i błon śluzowych jamy ustnej 3 pacjentki z przewlekłym zapaleniem błon śluzowych pochwy 1 pacjent z gangreną stopy 3 pacjentów z grzybicą (1 pacjent z grzybicą dłoni, 2 pacjentów z grzybicą stóp) Wyniki [0040] Kliniczną skuteczność substancji czynnej zestawiono w tabeli 6 dla 12 wybranych pacjentów. przedstawiono rodzaj terapii, długość terapii, kliniczne objawy wiodące i sukces kliniczny. [0041] W skrócie, we wszystkich 12 przypadkach po leczenia przez 2 do 28 dni można było zaobserwować przekonującą skuteczność kliniczną. Nastąpiła wyraźna poprawa objawów wiodących przy równoczesnej doskonałej miejscowej tolerancji. W żadnym przypadku nie wystąpiły skutki uboczne, takie jak zaczerwienienia, podrażnienia czy nudności.
8 Liczba pacjentów Tabela 6 Wskazania Objawy kliniczne Rodzaj leczenia Czas trwania leczenia (dni) Sukces kliniczny 2 Przewlekłe zapalenie żołądka Bóle uciskowe żołądka, zgaga 2 x dziennie 0,% roztwór doustnie 14 Brak dolegliwości 3 Zapalenie dziąseł i błony śluzowej jamy ustnej Bolesne ogniska zapalne, krwawienie z dziąseł 2 x dziennie 0,% roztwór miejscowo 2 Wyraźne zagojenie, brak bólu, brak krwawienia z dziąseł 3 Przewlekłe zapalenie błony śluzowej pochwy Palenie, wyciek, swędzenie 2 x dziennie 0,% roztwór miejscowo Brak dolegliwości 1 Gangrena stopy Zmiany wrzodowe, przeciekający obrzęk, cuchnący zapach, przeciwwskazana operacja 3 Grzybica rąk i stóp Swędzenie, deformacja i przebarwienie paznokci 3 x dziennie 0,% roztwór miejscowo 3 x dziennie 0,% roztwór miejscowo 28 Wyraźna poprawa miejscowa, nie pojawia się zapach, przygotowanie do operacji 28 Brak swędzenia, wzrost zdrowego paznokcia
9 Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie polimerowej pochodnej guanidyny na bazie diaminy, zawierającej łańcuchy oksyalkilenowe między dwiema grupami aminowymi, która to pochodna guanidyny stanowi produkt polikondensacji soli addycyjnej guanidyny z kwasem z diaminą zawierającą łańcuchy polioksyalkilenowe między dwiema grupami aminowymi, do wytwarzania leku o działaniu przeciwdrobnoustrojowym. 2. Zastosowanie według zastrzeżenia 1, znamienne tym, że do reprezentatywnych soli z grupy soli polioksyalkilenoguanidyny należą sole wytworzone z użyciem trietylenoglikolodiaminy (względna masa cząsteczkowa: 148), polioksypropylenodiaminy (względna masa cząsteczkowa: 230) oraz polioksyetylenodiaminy (względna masa cząsteczkowa: 600). 3. Zastosowanie według jednego z zastrzeżeń 1 albo 2, znamienne tym, że stosuje się poli[chlorowodorek 2-(2-etoksyetoksyetylo)guanidyniowy] z co najmniej 3 grupami guanidyniowymi. 4. Zastosowanie według zastrzeżenia 3, znamienne tym, że średnia masa cząstecz- kowa substancji czynnej wynosi od 00 do 3000.. Zastosowanie według jednego z zastrzeżeń 1 do 4, znamienne tym, że lek wytwarza się jako lek weterynaryjny. DOKUMENTY CYTOWANE W OPISIE Ta lista dokumentów cytowanych przez Zgłaszającego została przyjęta jedynie dla informacji czytającego i nie jest częścią europejskiego opisu patentowego. Została ona utworzona z dużą starannością; Europejski Urząd Patentowy nie ponosi jednak żadnej odpowiedzialności za ewentualne błędy i braki. Dokumenty patentowe cytowane w opisie AT 00134 W [0007] Uprawniony: Geopharma ProduktionsgmbH Pełnomocnik: mgr inż. Zofia Sulima Rzecznik patentowy